בניית מערכת בתקציב נמוך לייזר Axotomy לחקר התחדשות אקסון ב ג elegans

המטרה הכוללת של הליך זה היא להראות כיצד להרכיב וליישר מערכת אבלציה בלייזר לחקר התחדשות אקסונים ב-CL gans. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של בלוטת לייזר תומפסון מקטב חצי גל לוחית סיבוב מראה, מסילת פריסקופ ומראת מסילה ללוח אב-טיפוס השלב הבא בהליך הוא יישור קרן הלייזר לקרן היוצאת מעדשת מעבה המיקרוסקופ.

לאחר מכן עדשת מרחיב קרן לייזר מותקנת, מיושרת וממוקמת כדי למרכז את קרן הלייזר ולהפוך אותה לאפס סטייה. השלב האחרון של ההליך הוא להפוך את נקודת האבלציה בלייזר לתואמת את מיקוד התמונה על ידי ביצוע התאמות עדינות. בסופו של דבר, ניתן לחתוך במדויק אקסונים של חצי מיקרון עם נזק מינימלי לרקמות משני באמצעות קרן הלייזר המוגבלת בעקיפה כאשר היא לא מושלמת יישור XY NC.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו לייזרים שניים של Femto, הוא שהיא זולה יחסית ב-15,000. הוא נטול תחזוקה יחסית ומספק חיתוך אקסון מדויק מאוד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התחדשות אקסון אלגן הים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון זבובים, עכבר דג הזברה, מערכת העצבים ההיקפית ותאי המבחנה.

בעצם כל תא שנמצא בטווח של 30 עד 50 מיקרומטר מפני השטח. התחל עם הרכיבים הממוקמים על לוח הלחם והברג במורד עמוד פריסקופ הלייזר ותומכי המסילה המוגבהים. מערכת זו משתמשת בלייזר Class 3 B שיכול לפגוע בקלות בעיניים שלך, אז אנא התייחס ברצינות לבטיחות הלייזר.

שוחח עם מישהו במחלקה המקומית לפיזיקה על איך לעבוד עם לייזרים חופשיים בבטחה. תמיד במהלך תהליך היישור, הגדר את הלייזר בעוצמה הנמוכה ביותר. כאשר אתה מסתכל דרך העיניים, ודא שהלייזר סגור מכנית והלייזר כבוי.

כעת, מקם תחילה את המיקרוסקופ, יישר אותו עם ציר המסילה. שנית, יישר אותו עם אלומת האור המועברת מעדשת המעבה של המיקרוסקופ. שלישית, יישר את שני קצוות המסילה לקורת המעבה באמצעות צמצם מתכוונן או עדשה המודבקת למסילה.

השתמש בשקעי מפלס ומעבדה כדי לכוונן את גובה המסילה לפני שתמשיך. ודא ששני קצוות המסילה מיושרים. כעת, ודא שקרן הלייזר עוברת דרך הבלוטה, מקטב תומפסון וצלחת אמצע הדרך, ואינה פוגעת בקצוות שלהם מסתובבים.

לוחית האמצע תתאים את עוצמת הלייזר עם כל הרכיבים המאובטחים ללוח הלחם. הפעל את הלייזר, הגדר את תדר הדופק למצב רציף 100 והפחית את ההספק למינימום באמצעות לוחית האמצע. השתמש בפתק או בנייר עדשה כדי לדמיין את קרן הלייזר.

עכשיו להעלות את קרן הלייזר מלוח הלחם. כוונן ותקן את המראות המותקנות קינמטית ברצף מהלייזר כדי להביא את הקרן למעלה למראה המותקנת בקצה המסילה המוגבהת. בסיום, יש ליישר את קרן הלייזר בערך למרכז המראות, ולכוון את המראות בערך 45 מעלות לציר קרן הלייזר לפני יישור קרן הלייזר עם קרן האור המועברת של המיקרוסקופ.

הסר או פתח את כל מסנני ה-ND והפתחים במודול הביניים. כעת אנו מתחילים את הצעד הקריטי ביותר למתן חיתוך מדויק של אקסונים ללא נזק אגבי מוגזם. אנו הולכים ליישר את הלייזר בדיוק בציר x, y ו-Z בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר כדי לתת את נקודת האבלציה הקטנה ביותר.

ניתן לראות את הלייזר ואת קרני האור המועברות בו זמנית על נייר. מקם את הנייר ליד יציאת המיקרוסקופ כדי להתחיל. כעת התחל ליישר את הלייזר באמצעות כוונוני המסלול על המראה על גבי הפריסקופ והמראה בקצה המסילה.

הנח נייר בין עדשת המעבה המיושרת לצריח האובייקט הפתוח. המשך להשתמש בהתאמות העדינות במראה המסילה כדי ליישר את קרן הלייזר למרכז קרן האור המועברת הגדולה יותר. כעת, תקן את המיקרוסקופ במקום בעזרת מלחציים.

שלבים נוספים להערכת יישור הלייזר ניתן למצוא בכתב היד הכתוב. יש להתקין מרחיבי קרן גלילית כפולה כדי להרחיב את קרן הלייזר 300 מיקרון 33 פעמים כדי למלא את הצמצם האחורי של המטרה של 10 מילימטר. התחל בהרכבת ארבע העדשות על מנשאים.

לאחר מכן חבר את העדשות למסילה כך שכולן יהיו באותו ציר אופטי ובדיוק אורתוגונליות לקרן הלייזר. הפעל את הלייזר והתאם אותו להספק מינימלי ולמצב רציף. התאם בערך את יישור האלומה דרך כל עדשה.

השתמש בנייר כדי לראות את הקורה. כעת כבה את הלייזר. החל תריס בטיחות על הלייזר והסר את המיקרוסקופ מנתיב קרן הלייזר.

הפעל שוב את הלייזר ודמיין אותו על קיר סמוך. השתמש בהתאמה העדינה של העדשות כדי להרחיב את האלומה. לאחר מכן כוונן את שתי המראות האחרונות המותקנות קינמטית כדי ליישר את האלומה למעגל של בהירות אחידה במיקום המשוער של הצמצם האחורי של האובייקט.

הצג את הגודל והאחידות של הקורה כנגד נייר. לאחר מכן כוונן את האלומה להתכנסות אפס על ידי ציון כיצד גודל האלומה משתנה ככל שהנייר מתרחק מהעדשה. כבה את הלייזר והפעל את התריס המכני.

החלק את המיקרוסקופ בחזרה לנתיב קרן הלייזר באמצעות הקבועים clamps כדי להגדיר את היישור הנכון. החזר את המהדקים בצד החופשי של המיקרוסקופ, אך אל תהדק אותם כלפי מטה. עכשיו הפעל את הלייזר.

הסר את תריס הבטיחות וסובב את צריח המטרה למצב פתוח באמצעות נייר על הבמה וקרן לייזר מורחבת ואחידה שבמרכזה קרן האור המועברת מהמעבה אמורה להיות גלויה. אם לא ממורכז, מרכז את הקורות על ידי שחרור מהדקי המיקרוסקופ ודחיפת המיקרוסקופ בזהירות. כעת הפעל את תריס הבטיחות והגדר את הלייזר למצב טריגר.

סובב את המטרה 60 פעמים במקומה. עכשיו תמונה של פני השטח נשרטת בשקופית מטרה. הסר את תריס הבטיחות, הפעל את לייזר האבלציה והתאם את עוצמת הלייזר לנקודת האבלציה המינימלית.

הנקודה צריכה להיות עגולה ובטווח של חמישה עד 10 מיקרון ממרכז התמונה, המרכז, נקודת האבלציה. באמצעות ההתאמות העדינות של מראת המסילה המותקנת קינמטית כדי לשמור על הנקודה במרכז ופרופיל הקורה אחיד, יהיה צורך להתאים באופן איטרטיבי את המראה המותקנת על המסילה ואת מראת הפריסקופ העליונה. הערך את מיקוד ה-Z של הלייזר על ידי הזזת המיקוד למעלה ולמטה באופן שיטתי במיקרון אחד צעדים מפעילים את לייזר האבלציה בכל שלב.

אם האלומה מורחבת ומיושרת כהלכה ועם התכנסות מותאמת כהלכה, אז היא אמורה להתכווץ בצורה מקסימלית במיקוד התמונה וחלשה או בכלל לא, מיקרון אחד מעל או מתחת למיקוד. אם נקודת האבלציה המקסימלית נמצאת מעל או מתחת למיקוד התמונה, בצע את ההתאמות הסופיות למיקוד Z של האלומה המורחבת על ידי הזזת עדשה L 3 של הטלסקופ הגלילי עד שאבלציה בלייזר תואמת את מיקוד התמונה. נמטודות הורכבו על מגלשה מותאמת אישית ואקסונים הוסרו באמצעות המערכת הבנויה לייזר אקסו סומיה והדמיית זמן-lapse של התחדשות האקסונים היו חזקים מאוד.

באמצעות במה ממונעת ניתן היה לחתוך ולדמות באופן שגרתי ומדויק חמישה אקסונים בחמש חיות שונות. בשקופית אחת. זמן ההדמיה של האקסונים היה הגורם המגביל.

כ-10% מהניסויים הפיקו סרטוני דולג זמן באיכות גבוהה. הניסויים הנותרים סיפקו נתונים טובים, אך היו פחות אטרקטיביים מבחינה אסתטית בגלל תנועות ריצוד קטנות של התולעת שהחלו בדרך כלל לאחר חמש עד שמונה שעות של קיבוע. בזמן ניסיון הליך זה, תמיד חשוב להעריך במדויק את יישור הלייזר בציר x, y ו-Z.

הבעיה הנפוצה ביותר שיש לאנשים שמנסים לחתוך אקסונים היא נזק משני או חוסר יכולת מוחלט לחתוך אקסונים, וזה כמעט תמיד נובע מלייזר לא מיושר. מערכת אבלציה בלייזר זו וטכניקה להדמיית התחדשות אקסונים ב-c Agains יאפשרו לך לבחון באופן שגרתי את ההשפעה של כל מוטציה גנטית על התחדשות האקסון. NCL נגד.