Name: זיהוי מטרות של רנא האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: למדו לזהות מטרות של microRNA ברנ"א האדם באמצעות מערכת LightSwitch לבלוציפראז בתאי ממושב. שיטה זו מאפשרת לאמת אינטראקציות בין miRNA ל-3'UTR בחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+cancer+connection%3A+the+beginning+of+a+new+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li>
<li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li>
<li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li>
<li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li>
<li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li>
<li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li>
<li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li>
<li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem.+Epub%22%5BJournal%5D)">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

הכותבים הם עובדי Genomics switchgear שעושים כלים ריאגנטים המופיעים במאמר זה. הפקה של מאמר זה מומן על ידי Genomics switchgear.

יצרנו אוסף גנום רחב של טרום משובטים 3&#39;UTR-הכתב בונה האדם כדי לאפשר מחקרים של מירנה-3&#39;UTR אינטראקציות בתאים חיים. הנה הראינו שיטה לשעתקו תפוקה גבוהה עבור שיתוף transfecting מחקה מירנה עם 3&#39;UTR-לכתבים באמצעות מערכת הכתב בלוציפראז. שיטה זו מסתמכת על החוקרים באמצעות קו הפערים transfectable התא מביך פעילות מירנה עם טכניקה overexpression. חוקרים באמצעות שורות תאים גרוע-transfectable לשקול שימוש lentiviral לוויה שלנו 3&#39;UTR-הכתב אוסף שנוצר בשיתוף עם סיגמא (Mission 3&#39;UTR Lenti GoClones). טיפול בתאי עם מירנה מחקה תוצאות הניסוי overexpression סוג, ועם כל מחקר כזה, החוקרים חייבים לקחת בחשבון כי זה יכול או לא יכול לייצג מצבים פיזיולוגיים בפועל. כדי לענות על חששות overexpression, חוקרים יכולים להשתמש מעכבי מירנה בנוסף מחקה ללמוד את האינטראקציה עם שני סוגים שונים של ההפרעות 12-14. לאחר מטרות מירנה סביר מזוהים, החוקרים עשויים לרצות mutagenize האתרים מירנה המשוערת מחייב לקבוע אם האתרים נחוצים האינטראקציה תפקודית. הם יכולים גם רוצה בהיקף של עד מאות בדיקות שונות UTRs היעד הפוטנציאלי (Boutz). בנוסף, אם החוקרים מעוניינים בשאלה האם מירנה משפיע יציבות תמליל או יעילות התרגום, נתונים הכתב בלוציפראז ניתן להשוות מדדים של מצב יציב ברמות התמליל. כל שינוי אות בלוציפראז שלא קשורה לשינוי יחסי ברמות תמליל יצביע על השפעה על יעילות התרגום. לבסוף, החוקרים עשויים להשתמש וקטורים כתב ליצור עקומת התגובה מנה להשוות את הרגישות היחסית של UTRs שונות שינויים בריכוז מירנה 14.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מוכר </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> לבן תרבות רקמות פלטות (96-היטב לתחתית מוצק) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> נקה בתרבית רקמה פלטות (96-היטב) עם מכסה </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch מגיב Assay בלוציפראז </td><td> Switchgear </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Duo מגיב transfection (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> פלייט לסכל איטום Tape </td><td> E &amp; K מדעי </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> פלייט לנשימה איטום Tape </td><td> E &amp; K מדעי </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> פלייט Luminometer </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת assay בלוציפראז lightswitch באמצעות 3&#39;utr-הכתב בונה microrna מחקים בתאים חסיד

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים ממלאים תפקיד בתהליכים ביולוגיים רבים. יותר מ 700 miRNAs אדם זוהו עד כה עם כל כך עד מאות mRNAs יעד ייחודי. כלים חישוביים, מבחני הביטוי proteomics, וכרומטין-immunoprecipitation טכניקות מבוססות לספק רמזים חשובים לזיהוי mRNAs כי הם מטרות ישירה של מירנה מסוים. בנוסף, 3&#39;UTR-כתב מבחני הפכו מרכיב חשוב של מחקרים מטרה יסודית מירנה משום שהם מספקים ראיות פונקציונלי ו לכמת את ההשפעות של מירנה-3&#39;UTR אינטראקציות ספציפיות במערכת מבוססי תאים. כדי לאפשר לחוקרים יותר 3&#39;UTR-כתב מבחני למנף ולתמוך מדרוג כלפי מעלה של מבחני כזו תפוקה גבוהה רמות, יצרנו אוסף גנום רחב של כתבים 3&#39;UTR האדם בלוציפראז ב בלוציפראז LightSwitch הפערים אופטימיזציה Assay מערכת. המערכת כוללת גם סינתטי היעד מירנה כתב בונה לשימוש שולטת חיובית, שונים אנדוגני כתב בונה 3&#39;UTR, וכן סדרה של פרוטוקולי הניסוי סטנדרטית. כאן אנו מתארים שיטה transfection משותפת של 3&#39;UTR-כתב מבנים בודדים, יחד עם מירנה לחקות כי הוא יעיל, לשחזור, והוא מקובל ניתוח תפוקה גבוהה.

מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים הוכחו לשחק תפקיד תהליכים ביולוגיים רבים. כדי להבין טוב יותר מירנה-UTR אינטראקציות, יצרנו אוסף גנום רחב של 3 כתבים UTR בלוציפראז יחד עם הגן בלוציפראז הרומן מגיב assay, מערכת LightSwitch.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

מיקרו-RNA (miRNAs) הם ווסתים חשובים של ביטוי גנים וממלאים תפקיד בתהליכים ביולוגיים רבים. יותר מ-700 סוגי miRNAs אנושיים זוהו...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע טרנספקציה משולבת (co-transfection) של מבני דנ"א של גן דגל (reporter constructs) יחד עם מימיק של micro RNA כדי לתקף מטרות חזויות של micro RNA ב-3' UTR אנושי. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון ניסיוני הכולל בחירת שורת תאים ובחירת מימיקים של micro RNA, יחד עם מבני דגל של 3' UTR Go Clone ניסיוניים ובקרים. תאי ההיצמדות נזרעים כ-24 שעות לפני הטרנספקציה. השלב הבא בפרוצדורה הוא ביצוע טרנספקציה משולבת של כל מבנה דגל של 3' UTR Go Clone ניסיוני או בקר עם מימיק של micro RNA או עם בקר שאינו מטרה (non-target), ולאחריה דגירה של 24 עד 48 שעות. כשלב סופי, ריאגנט שלבדי-לוקיפראז (light switch luciferase assay reagent) מתווסף ישירות לתאים ולתרבית, ואת אות הלומינסנציה קוראים באמצעות לומינומטר של פלטות.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אילו רצפי 3' UTR אנושיים הם מטרות של microRNA נתון, באמצעות מדידת ירידה (knockdown) באות הלוסיפראז באמצעות טכנולוגיית reporter assay. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח עבור חוקרי microRNA, כיוון שהיא מספקת בדיקה פונקציונלית לתיקוף אינטראקציות חזויות בין microRNA לבין מטרות ב-3' UTR בתאים חיים. התכנון הניסיוני מתחיל בבחירת שורת תאים נצמדת עם יעילות טרנספקציה גבוהה המתאימה לניסויים המבוססים על microRNA mimic; בדיקות אלו עובדות בצורה המיטבית בשורות תאים עם רמות ביטוי אנדוגני נמוכות של ה-microRNA.לאחר מכן, בחרו את זוג ה-micro RNA mimic והביקורת שאינה מטרה (non-target control); הכללת ביקורת שאינה מטרה היא קריטית, כיוון שטרנספקציה של פלסמיד ושל אוליגו RNA קטן יחד מובילה לאות חלש יותר מאשר טרנספקציה של הפלסמיד לבדו. בשלב הבא, בחרו את מבני הדוחות (reporter constructs) של ה-three prime UTR Go Clone מהקלון המוקדם מתוך האוסף של switchgears לכל הגנום. עברו לקטלוג המקוון ולחצו על כפתור החיפוש של ה-UTR.לאחר הזנת רשימת שמות הגנים, סמלי הגנים או מספרי הגישה, תוצאות החיפוש יספקו מידע על הווקטור והרצף, לצד סטטוס המלאי. כעת בחרו את מבני הדגימה של הרפורטר לבקרה. בחרו מבני בקרה בעלי רצפי 3' UTR שאינם צפויים להיות מטרות ל-microRNA שנבחר, כגון רצפי housekeeping, רצפי UTR או מקטעים אקראיים, וזאת כדי לשלוט בהשפעות לא ספציפיות של ביטוי יתר של microRNA על בריאות התא הכללית או על אות הבדיקה.שקלו גם להשתמש ברפורטר מטרה סינתטי של micro RNA כביקורת חיובית לפעילות ה-mimic. ביום הראשון, זרעו תאי היצמדות במעבר נמוך (low passage), כך שהם יגיעו לרמת התלכדות (confluency) של 80 עד 100% לצורך הטרנספקציה כעבור 24 שעות. שימוש בתאים בעלי התלכדות גבוהה הוא המפתח להשגת תוצאות טובות. זרעו את התאים בצלחת תרבית רקמה לבנה בעלת 96 בארות בנפח כולל של 100 µL.במקביל, יש לבדוק את מספר התאים המתאים בפלטה שקופה כדי לוודא הגעה למצב של התמזגות (confluence) ביום השני, 24 שעות לאחר זריעת התאים. יש להכין את החומרים להפשרה לצורך טרנספקציה.הפשיר את מבני הדייגים (reporter constructs) ואת ה-micro RNAs בטמפרטורה של החדר. לאחר ההפשרה, ערבב היטב ודלל את ה-micro RNAs לריכוז עבודה של 2 µM במים נטולי RNA. ה-plasma DNA מסופק בריכוז של 30 ng/µL ואינו דורש דלול נוסף. להכנת תערובת הטרנספקציה, יש לקחת בחשבון שכל שילוב של DNA-RNA צריך לעבור טרנספקציה בשלוש חזרות; יש להתאים את הנפח למספר הבדיקות המבוצעות.הכינו את תערובת סוכן הטרנספקציה על ידי ערבוב של 9.85 µL של מצע ללא סרום ו-0.15 µL של Dharma effect DUO לכל טרנספקציה. המתינו להדגרה של התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הכינו את תערובת ה-DNA-RNA לכל בדיקה על ידי ערבוב של 3.33 µL של מבנה הדיווח go clone עם כמות מספקת של microRNA mimic כדי להגיע לריכוז הסופי הרצוי.השלם את הנפח ל-10 µL באמצעות מצע ללא סרום. לאחר מכן, ערבב 10 µL מתערובת ריאגנט הטרנספקציה עם 10 µL מכל תערובת DNA-RNA וערבב היטב. הנפח הסופי עבור כל בדיקה הוא 20 µL.כסו היטב והדגירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, הוסיפו 80 µL של מצע מלא ללא אנטיביוטיקה שחומם מראש, כדי להגיע לנפח כולל של 100 µL לכל באער בבדיקה, כך שריכוז ה-mimic הסופי יהיה בין 10 ל-15 nM.כשלב סופי, הסר בזהירות את המצע מכל באער של תאים שנזרעו והחלף אותו ב-100 microliters של תערובת הטרנספקציה הסופית המתאימה. החזר את הפלטה לאינקובטור והדגר למשך 24 עד 48 שעות. מרבית התערובות יניבו תוצאות משמעותיות בתוך 24 שעות.תקופת דגירה של 48 שעות תוביל לשונות גבוהה יותר באות בין הבארות. ביום ה-3, 24 שעות לאחר הטרנספקציה, בצעו בדיקות לוסיפראז באמצעות ריאגנטים של light switch luciferase assay; ניתן לבצע את הבדיקה בתאים באופן מיידי או להקפיאם בטמפרטורה של 80°C- ולבצע את הבדיקה מאוחר יותר. הוספת מחזור של הקפאה והפשרה תוביל לליזיס תאים מוגבר ולאות גבוה יותר של הדווח (reporter). הביאו את הפלטה של התאים שעברו טרנספקציה לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הכין את תמיסת ה-assay של ה-light switch luciferase בהתאם להוראות הערכה ושפוך אותה למאגר סטרילי. השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף 100 µL של תמיסת ה-light switch assay ישירות לכל באר בלוח ה-96 בארות הלבן. כסה את הלוח, הגן עליו מאור והדגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.קראו כל באר למשך שתי שניות באמצעות לומנומטר של פלטות. נמדדה השהיה (knockdown) של פעילות נשאי לוקיפראז עם 3'UTR על ידי let-7a בתאי HT-1080, באמצעות טרנספקציה משותפת של כל מבנה נשא עם mimic של let-7a או ביקורת שאינה מטרה (non-target control) לצורך ניתוח התוצאות. הגדירו את האות מביקורת ה-non-target כ-100% עבור כל מבנה.חשבו את אחוז ההשחקה (knockdown) על ידי חילוק האות מה-micro RNA mimic הספציפי באות של ביקורת ה-non-target. לכל micro RNA mimic נתון עשויות להיות השפעות לא ספציפיות על חיוניות התאים הכללית או על אות הבדיקה, ויש לתקן השפעות לא ספציפיות אלו. השוו את ההשחקה שנצפתה ביחס למטרה ניסיונית של UTR להשחקה שנצפתה ביחס לביקורת housekeeping או ביקורת אקראית, כפי שמוצג כאן.ה-PONC וה-arid 3B האנושיים הם מטרות של let-7a microRNA. אותות ממדווחי 3' UTR אנושיים עבור הגנים PUNC ו-arid 3B יורדים באופן משמעותי בנוכחות mimic של let-7a microRNA, בעוד שאותים עבור UTR של גני בית (housekeeping) ורצפים אקראיים אינם יורדים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש לבצע cotransfection מוצלח של mimic של microRNA ומבני מדווח 3' UTR בתאים חיים, וכיצד לקרוא את האות בלומינומטר כדי למדוד את הירידה באות.

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לבצע siRNA ממוקד מסך "ubiquitome" לזהות היוביקוויטין רומן ורגולטורים כמו היוביקוויטין של התגובה התאית בתיווך HIF1A להיפוקסיה. זה יכול להיות מותאם לכל מסלול ביולוגי שבו חזקה לקריאה מהפעילות העיתונאית היא זמינה.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

זיהוי זוהר של אלמנטים פונקציונליים ב-3' אזורים לא מתורגמים (3'UTRs) (3'LIFE) היא טכניקה לזיהוי ויסות פונקציונלי ב-3'UTRs על ידי miRNAs או גורמים רגולטוריים אחרים. פרוטוקול זה משתמש במתודולוגיה בעלת תפוקה גבוהה כגון טרנספקציה של 96 בארות ומבחני לוציפראז כדי לסנן מאות אינטראקציות משוערות לדיכוי תפקודי.

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

למדו לזהות מטרות של microRNA ברנ"א האדם באמצעות מערכת LightSwitch לבלוציפראז בתאי ממושב. שיטה זו מאפשרת לאמת אינטראקציות בין miRNA ל-3'UTR בחיים.

זיהוי מטרות של רנ"א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3'UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

גלה סרטונים נוספים