זיהוי מטרות של רנ"א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3'UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע טרנספקציה משולבת (co-transfection) של מבני דנ"א של גן דגל (reporter constructs) יחד עם מימיק של micro RNA כדי לתקף מטרות חזויות של micro RNA ב-3' UTR אנושי. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון ניסיוני הכולל בחירת שורת תאים ובחירת מימיקים של micro RNA, יחד עם מבני דגל של 3' UTR Go Clone ניסיוניים ובקרים. תאי ההיצמדות נזרעים כ-24 שעות לפני הטרנספקציה. השלב הבא בפרוצדורה הוא ביצוע טרנספקציה משולבת של כל מבנה דגל של 3' UTR Go Clone ניסיוני או בקר עם מימיק של micro RNA או עם בקר שאינו מטרה (non-target), ולאחריה דגירה של 24 עד 48 שעות. כשלב סופי, ריאגנט שלבדי-לוקיפראז (light switch luciferase assay reagent) מתווסף ישירות לתאים ולתרבית, ואת אות הלומינסנציה קוראים באמצעות לומינומטר של פלטות.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אילו רצפי 3' UTR אנושיים הם מטרות של microRNA נתון, באמצעות מדידת ירידה (knockdown) באות הלוסיפראז באמצעות טכנולוגיית reporter assay. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח עבור חוקרי microRNA, כיוון שהיא מספקת בדיקה פונקציונלית לתיקוף אינטראקציות חזויות בין microRNA לבין מטרות ב-3' UTR בתאים חיים. התכנון הניסיוני מתחיל בבחירת שורת תאים נצמדת עם יעילות טרנספקציה גבוהה המתאימה לניסויים המבוססים על microRNA mimic; בדיקות אלו עובדות בצורה המיטבית בשורות תאים עם רמות ביטוי אנדוגני נמוכות של ה-microRNA.

לאחר מכן, בחרו את זוג ה-micro RNA mimic והביקורת שאינה מטרה (non-target control); הכללת ביקורת שאינה מטרה היא קריטית, כיוון שטרנספקציה של פלסמיד ושל אוליגו RNA קטן יחד מובילה לאות חלש יותר מאשר טרנספקציה של הפלסמיד לבדו. בשלב הבא, בחרו את מבני הדוחות (reporter constructs) של ה-three prime UTR Go Clone מהקלון המוקדם מתוך האוסף של switchgears לכל הגנום. עברו לקטלוג המקוון ולחצו על כפתור החיפוש של ה-UTR.

לאחר הזנת רשימת שמות הגנים, סמלי הגנים או מספרי הגישה, תוצאות החיפוש יספקו מידע על הווקטור והרצף, לצד סטטוס המלאי. כעת בחרו את מבני הדגימה של הרפורטר לבקרה. בחרו מבני בקרה בעלי רצפי 3' UTR שאינם צפויים להיות מטרות ל-microRNA שנבחר, כגון רצפי housekeeping, רצפי UTR או מקטעים אקראיים, וזאת כדי לשלוט בהשפעות לא ספציפיות של ביטוי יתר של microRNA על בריאות התא הכללית או על אות הבדיקה.

שקלו גם להשתמש ברפורטר מטרה סינתטי של micro RNA כביקורת חיובית לפעילות ה-mimic. ביום הראשון, זרעו תאי היצמדות במעבר נמוך (low passage), כך שהם יגיעו לרמת התלכדות (confluency) של 80 עד 100% לצורך הטרנספקציה כעבור 24 שעות. שימוש בתאים בעלי התלכדות גבוהה הוא המפתח להשגת תוצאות טובות. זרעו את התאים בצלחת תרבית רקמה לבנה בעלת 96 בארות בנפח כולל של 100 µL.

במקביל, יש לבדוק את מספר התאים המתאים בפלטה שקופה כדי לוודא הגעה למצב של התמזגות (confluence) ביום השני, 24 שעות לאחר זריעת התאים. יש להכין את החומרים להפשרה לצורך טרנספקציה.

הפשיר את מבני הדייגים (reporter constructs) ואת ה-micro RNAs בטמפרטורה של החדר. לאחר ההפשרה, ערבב היטב ודלל את ה-micro RNAs לריכוז עבודה של 2 µM במים נטולי RNA. ה-plasma DNA מסופק בריכוז של 30 ng/µL ואינו דורש דלול נוסף. להכנת תערובת הטרנספקציה, יש לקחת בחשבון שכל שילוב של DNA-RNA צריך לעבור טרנספקציה בשלוש חזרות; יש להתאים את הנפח למספר הבדיקות המבוצעות.

הכינו את תערובת סוכן הטרנספקציה על ידי ערבוב של 9.85 µL של מצע ללא סרום ו-0.15 µL של Dharma effect DUO לכל טרנספקציה. המתינו להדגרה של התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הכינו את תערובת ה-DNA-RNA לכל בדיקה על ידי ערבוב של 3.33 µL של מבנה הדיווח go clone עם כמות מספקת של microRNA mimic כדי להגיע לריכוז הסופי הרצוי.

השלם את הנפח ל-10 µL באמצעות מצע ללא סרום. לאחר מכן, ערבב 10 µL מתערובת ריאגנט הטרנספקציה עם 10 µL מכל תערובת DNA-RNA וערבב היטב. הנפח הסופי עבור כל בדיקה הוא 20 µL.

כסו היטב והדגירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, הוסיפו 80 µL של מצע מלא ללא אנטיביוטיקה שחומם מראש, כדי להגיע לנפח כולל של 100 µL לכל באער בבדיקה, כך שריכוז ה-mimic הסופי יהיה בין 10 ל-15 nM.

כשלב סופי, הסר בזהירות את המצע מכל באער של תאים שנזרעו והחלף אותו ב-100 microliters של תערובת הטרנספקציה הסופית המתאימה. החזר את הפלטה לאינקובטור והדגר למשך 24 עד 48 שעות. מרבית התערובות יניבו תוצאות משמעותיות בתוך 24 שעות.

תקופת דגירה של 48 שעות תוביל לשונות גבוהה יותר באות בין הבארות. ביום ה-3, 24 שעות לאחר הטרנספקציה, בצעו בדיקות לוסיפראז באמצעות ריאגנטים של light switch luciferase assay; ניתן לבצע את הבדיקה בתאים באופן מיידי או להקפיאם בטמפרטורה של 80°C- ולבצע את הבדיקה מאוחר יותר. הוספת מחזור של הקפאה והפשרה תוביל לליזיס תאים מוגבר ולאות גבוה יותר של הדווח (reporter). הביאו את הפלטה של התאים שעברו טרנספקציה לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הכין את תמיסת ה-assay של ה-light switch luciferase בהתאם להוראות הערכה ושפוך אותה למאגר סטרילי. השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף 100 µL של תמיסת ה-light switch assay ישירות לכל באר בלוח ה-96 בארות הלבן. כסה את הלוח, הגן עליו מאור והדגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

קראו כל באר למשך שתי שניות באמצעות לומנומטר של פלטות. נמדדה השהיה (knockdown) של פעילות נשאי לוקיפראז עם 3'UTR על ידי let-7a בתאי HT-1080, באמצעות טרנספקציה משותפת של כל מבנה נשא עם mimic של let-7a או ביקורת שאינה מטרה (non-target control) לצורך ניתוח התוצאות. הגדירו את האות מביקורת ה-non-target כ-100% עבור כל מבנה.

חשבו את אחוז ההשחקה (knockdown) על ידי חילוק האות מה-micro RNA mimic הספציפי באות של ביקורת ה-non-target. לכל micro RNA mimic נתון עשויות להיות השפעות לא ספציפיות על חיוניות התאים הכללית או על אות הבדיקה, ויש לתקן השפעות לא ספציפיות אלו. השוו את ההשחקה שנצפתה ביחס למטרה ניסיונית של UTR להשחקה שנצפתה ביחס לביקורת housekeeping או ביקורת אקראית, כפי שמוצג כאן.

ה-PONC וה-arid 3B האנושיים הם מטרות של let-7a microRNA. אותות ממדווחי 3' UTR אנושיים עבור הגנים PUNC ו-arid 3B יורדים באופן משמעותי בנוכחות mimic של let-7a microRNA, בעוד שאותים עבור UTR של גני בית (housekeeping) ורצפים אקראיים אינם יורדים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש לבצע cotransfection מוצלח של mimic של microRNA ומבני מדווח 3' UTR בתאים חיים, וכיצד לקרוא את האות בלומינומטר כדי למדוד את הירידה באות.