Name: Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למד הכנת פרוסות רשתית באגאר לחקר מיקרומעגלים בסופי עצבים של תאים דו-קוטביים. השיטה מאפשרת מדידות patch-clamp ישירות מסופי עצב בודדים בדג זהב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר פרד Rieke הסבר מינו של הכנת אגר מוטבע-פרוסה רשתית כשהתחלנו באמצעות פרוטוקול במעבדה שלנו. אנו מודים גם לורי Vaskalis להמחשה של סכמטית סקירה בני הזוג. Veeramuthu Balakrishnan ו Soyoun צ&#39;ו עבור הערות מועילות על טקסט ווידאו. עבודה זו נתמכה על ידי ניי-NIH RO1 מענק, והוא גם נתמך בחלקו על ידי קרן המחקר קוריאה גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה [KRF-2008-357-E00032].

<ol><li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levodopa+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li>
<li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li>
<li>WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Active+ageing%3A+a+policy+framework%22">Active ageing: a policy framework</a>. , (2002).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+disorders%3A+advances+in+cause+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).</li>
<li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson%27s+disease%3A+problems+with+the+current+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).</li>
<li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li>
<li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li>
<li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).</li>
<li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+molecular+snapshots+of+biochemical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li>
<li>Ljungdahl, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li>
<li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+directly+from+tissue%3A+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li>
<li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides%3A+3D+volume+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li>
<li>Deininger, S. -O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeininger%2C+S-O+%22Imaging+Mass+Spectrometry%22">Imaging Mass Spectrometry</a>. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).</li>
<li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li>
<li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+and+Graphical+Statistics%22%5BJournal%5D)">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li>
<li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+H+%22Mass+Spectrometry+Binning+Software+GAB%22">Mass Spectrometry Binning Software GAB</a>. , (2012).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li>
</ol>

אין לנו מתחרים אינטרסים לחשוף.

שלב קריטי וקשה בפרוטוקול שלנו היא העברת היצירה של הרשתית לתוך הפתרון אגר (פרוטוקול 3.4). יש צורך להסיר בזהירות את ההומור זגוגי פתרון פרוסה שיורית מן היצירה רשתית ולהעביר אותו ללא עיוות או כיפוף. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים מרית קטנה (21-401-25B, Fisherbrand) עם קצה כפוף לטופס 90 ° זווית, יחד עם מלקחיים קצה זוויתי (11251-35, כלי המדע פיין), כדי למקם את הרשתית חתיכת לאורך כל תהליך ההעברה פתרון פרוסה. פתרון שיורית פרוסה על פרוסת את המרית הרשתית ניתן להסיר על ידי להיזה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אגר gelling בטמפרטורה נמוכה </td><td> סיגמא </td><td> A0701 </td><td> Agarose סוג ז&#39; </td></tr><tr><td> תיקון פיפטה </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> 1B150F-4 </td><td> חומה עבה (1.5 מ&quot;מ קוטר חיצוני) בורוסיליקט זכוכית </td></tr><tr><td> אנכי חולץ </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> שיניים שעווה </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> האביב מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 ° זווית מלקחיים קצה קנס </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> להב התער </td><td> Personna </td><td></td><td> פיפיות, לנקות עם 70% אתנול ו - H 2 O </td></tr><tr><td> גלילי צינור </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338-1B </td><td> מדגם פוליאתילן בקבוקונים 2.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> סיגמא </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome מבצעה </td><td> לייקה </td><td> VT1000S או VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> זקוף מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> המטרה 60x מים טבילה </td><td> אולימפוס </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> סוני </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה בקר </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> צג &lt;/ Td&gt; <td> סוני </td><td></td><td> 13 &quot;שחור ולבן לפקח </td></tr><tr><td> מזרק מסנן </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0.2 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> סאטר Instrument </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lock-in amplifier </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 מגברים יש תוכנת אמולציה </td></tr><tr><td> ספינינג לייזר דיסק confocal מיקרוסקופ </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> הדמיה תא חי לאחר תיקון מהדק הקלטה התא כולו </td></tr><tr><td> Slidebook תוכנה </td><td> Intelligent הדמיה מכשירים (3i) </td><td></td><td> הדמיה וניתוח נתונים הרכישה </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> סיגמא </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט חיץ פתרון </td><td> GIBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td></td><td> שקופיות הזכוכית </td></tr><tr><td> נגד דהייה סוכנים </td><td> Biomeda קורפ. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ לייזר סורק </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> הדמיה של רקמות קבוע </td></tr><tr><td> מרית </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401-25B </td><td></td></tr><tr><td> מנואל אנכי מבצעה </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> אורגון גרין 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + צבע פלואורסצנטי רגיש </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 555 Hydrazide </td><td> Invitrogen </td><td> A-20501MP </td><td> פלורסנט צבע </td></tr></tbody></table>

patch-clamp מדידות קיבול ו ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב slices רשתית

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

גירויים חזותיים מזוהים והועברה על פני טווח דינמי רחב של עוצמות אור ושינויים תדירות על ידי נוירונים מתמחים הרשתית החולייתנים. שתי כיתות של נוירונים, קולטני האור ברשתית תאים דו קוטבית, לעשות זאת באמצעות סרט מסוג אזורים פעילים, המאפשרים שחרור הנוירוטרנסמיטר מתמשכת תפוקה גבוהה על פני תקופות זמן ארוכות. על סוג המעורבות דו קוטבית (MB) תא מסופי ברשתית דגי זהב, אשר depolarize לגירויים אור ולקבל מוט מעורבת קלט חרוט photoreceptor, מתאימים ללימוד סרט מסוג סינפסות הן בשל גודל גדול שלהם (~ 10-12 מיקרומטר קוטר) וכן קשרים סינפטיים רבים שלהם לרוחב והדדית עם דנדריטים תא amacrine. גישה ישירה מסופי Mb דו קוטבית תא פרוסות דג זהב רשתית עם טכניקה טלאי-clamp מאפשר מדידת Ca presynaptic 2 + זרמים, קיבול שינויים קרום, משוב הדדי עיכוב סינפטי בתיווכו של GABA &lt;תת&gt; A ו-C קולטני GABA הביע על המסופים. Presynaptic קיבול הממברנה מדידות של exocytosis לאפשר אחד כדי ללמוד את הפלסטיות לטווח קצר של שחרור הנוירוטרנסמיטר מעוררים 14,15. בנוסף, גמישות לטווח הקצר ולטווח הארוך של שחרור נוירוטרנסמיטר מדכא מתאי amacrine יכול להיות גם נחקר על ידי הקלטות של עיכוב משוב הדדי להגיע למסוף Mb 21. במהלך פרקי זמן קצרים (למשל 10 ~ ים), משוב GABAergic עיכוב הדדי מתאי amacrine עובר לזווג הדופק דיכאון דרך דלדול בריכה GABA שלפוחית ​​11. הדינמיקה הסינפטי של הרשתית microcircuits בשכבת plexiform הפנימי של הרשתית כך ניתן ללמוד באופן ישיר. הטכניקה המוח פרוסה הוצג למעלה מ 40 שנה אבל הוא עדיין מאוד שימושי עבור חקירת התכונות החשמליות של נוירונים, הן סומה תא בודד, יחיד או דנדריט האקסון, ואת מ &#39;icrocircuit ברמה הסינפטית 19. רקמות כי הם קטנים מדי כדי להיות מודבק ישירות על גבי התא חיתוך לעיתים קרובות מוטבעים הראשון אגר (או להציב על גבי נייר פילטר) ופרוסים אז 20, 23, 18, ​​9. בסרטון הזה, אנו מעסיקים את הטכניקה מראש הטבעה אגר באמצעות הרשתית דגי זהב. חלק מסופי ענק דו קוטבית תא פרוסות שלנו הרשתית דגי זהב הם axotomized (האקסון לחתוך) במהלך ההליך חיתוך. זה מאפשר לנו לבודד אחד presynaptic מסוף תשומות עצב, כי הקלטה של ​​מסופי axotomized כולל את האותות מתא סומה, דנדריטים. לחלופין, אפשר גם להקליט מתאי Mb שלמים דו קוטבית, על ידי הקלטה של ​​מסופים המחוברים אקסונים שלא נותקו במהלך ההליך חיתוך. באופן כללי, השימוש בפרוטוקול זה הניסוי יסייעו לימודים של פיסיולוגית הסינפטי ברשתית, ניתוח Microcircuit פונקציונלי, שידור הסינפטי ב סינפסות סרט.

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

גירויים חזותיים מזוהים ומועברים על פני טווח דינמי רחב של עשויות אור ושינויים בתדר על ידי נוירונים מתמחים בחולייתנים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין פרוסות רשתית מוטמעות באגר למשם חקר המעגלים הזעירים הממוקמים בקצוות העצביים הפרסינפטיים של תאי ביפולר. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת הרשתית מעין של דג זהב שהותאם לחושך, וחיתוך חתיכה מלבנית קטנה מרשתית זו. חתיכת הרשתית טובעת לאחר מכן בתמיסת אגר שקופה בעלת נקודת התכה נמוכה, אשר מוקשחת לאחר מכן בתמיסת חיתוך קרה ואיכותית.השלב הבא הוא לחתוך את גוש האגר המוצק המכיל את פיסת הרשתית המלבנית באמצעות ויברטור. השלב האחרון הוא להדגים, לזהות ולבצע טלאי (patch). קבעו בעזרת מלקחיים סיומת של תאי עצב בביפולריים.בסופו של דבר, התוצאות מראות את זרם הסידן הפרה-סינפטי ואת האקסוציטוזה הפיזית הסינפטית באמצעות מדידות קיבול ממברנה של טרמינלים של תאי בנשתיים (bipolar cells) מפורסמים ושלמים. שלום, שמי האן קים. אני פוסט-דוקטורנט במעבדת PCO במכון ברהם.היום אציג את הכנת פרוסות מוטמעות של רשתית פנים קרה בשיטת AGA, ואדגים מדידת קיבול (capacitance) בשיטת patch clamp בצינור בודד. כדי להתחיל בהליך זה, יש לחלק כל עינ של דג זהב לשניים על ידי גזירה אחידה מסביב לחלק הקדמי של העין באמצעות מספרי קפיץ. לאחר מכן, יש להניח את כוסות העין בתמיסת פרוסות מקוררת ללא סידן.במידת הצורך, הסירו את העדשה בעזרת פינצטה. לאחר מכן, הסירו את אפיתל הפיגמנט הצמוד לרשתית על ידי קילוף הרשתית מגביע העין בעזרת פינצטה עדינה בעלת קצוות בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן, חתכו את העצב האופטי בעזרת פינצטה עדינה או מספרי קפיץ.לאחר מכן, בצעו שאיבה באמצעות פפיפט פסטה משופר או פפיפט העברה בעל טיפ גדול. כדי להסיר את הרשתית, הסירו בעדינות את שארית אפיתל הפיגמנט ההדבקה לרשתית. פני השטח של הרשתית הנקייה והבריאה צריכים להיראות חלקים.לאחר מכן, טפלו ברשתית המבודדת ב-IDE בריכוז של כ-0.03% למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. לצורך הסרת נוזל הזגוגית, שימו לב כי יש לבצע את הפעולה בתאורה חלשה. בשלב הבא, גזרו פיסה מלבנית של רשתית בגודל של כ-שני על שני מילימטרים, הכוללת את מלוא עובי הרשתית, על ידי הסרת הקצוות המעוקלים באמצעות להב תער.לאחר מכן, העבירו את פיסת הרשתית למכל කුטן המלא בתמיסת אגר ותנסו למזער את כמות התמיסה מסביב לרשתית בעת הנחתה לתוך האגר הנוזלי. לאחר מכן, טבלו את הרשתית עם האגר ישירות בתמיסת הפרוסות הקרה בקרח כדי להקשיח את האגר. בשלב הבא, חתכו את גוש האגר המוצק המכיל את פיסת הרשתית המלבנית לקובייה בגודל של 1X1X1 סנטימטר.הדביקו את הבלוק לפני השטח של לוח החיתוך בתא ה-preco slice. לאחר מכן, חתכו את הבלוק לפרוסות בעובי של 200 עד 250 מיקרון בתמיסת חיתוך קרה (ice cold). באמצעות vibratome, ניתן להפיק סך של חמש עד 10 פרוסות, אשר נשארות חיוניות למשך כחמש עד שש שעות.לאחר מכן, העבירו את אחת הפרוסות לתא ההקלטה. הניחו על גבי הפרוסה מסגרת פלטינה בצורת U עם רשת של חוטי ניילון. בצעו פרפוזיה רציפה של הפרוסה בקצב של 1-2 milliliters per minute של תמיסת הקלטה המאווררת בקרבוגן.בשלב זה, השתמש במזרק עם קצה מסנן של 0.2 מיקרון כדי למלא את פיפטת ה-patch מזכוכית בתמיסה פנימית עד למפלס של סנטימטר אחד עד שניים מגב הפיפטה. לאחר מכן, הסר בועות אוויר מהקצה. own את הפיפטה במחזיק.הפעיל לחץ חיובי על הפיפטה והזז אותה לכיוון הטרמינל המיועד באמצעות מיקרו-מניפולטור, תוך כדי הנעת הקצה כלפי מטה דרך הפרוסה. הנע את הפיפטה בתנועת סריקה צידית כדי להבטיח שהפרוסה אינה נמשכת יחד עם הקצה. לאחר מכן, הנע את קצה הפיפטה מסביב לטרמינל כדי לנקות את פני השטח של הממברנה.דחפו את הקצה כלפי מטה כנגד שולי התרמיה כדי ליצור שקע ושחררו את הלחץ החיובי. אם לא נוצר אטום בדרגת giga ohm באופן מיידי, הפעילו לחץ שלילי קל על הפיפטה. ברגע שנוצר אטום בדרגת giga ohm, העבירו את מגבר ה-patch clamp מדגם E PC nine למצב הקלטה של onsell ושנו את פוטנציאל ההחזקה ל-60- או 70- millivolts.בצע את תיקון הקיבול המהיר (fast capacitance correction) והמתן עד שהאטימה תתייצב בין 5 ל-10 giga ohms. לאחר מכן, פחץ את הממברנה באמצעות שאיבה חזקה ועדינה, כדי להקים תצורת הקלטה של התא השלם (whole cell recording).ניתן להשתמש גם ביניקה באמצעות הפה במקום במזרק. לאחר שהוקמה תצורת תא שלם על קצה אלקטרודה MB מ atomized, החילו דפולריזציה מדורגת למשך 200 millisecond מ-70- עד אפס millivolts. זכרו שגל סינוס בתדר של two kilohertz מוחל במצב voltage clamp לפני ואחרי דפולריזציה זו. על מנת למדוד את קיבול הממברנה, הדפולריזציה מאפשרת מדידה ישירה של זרמי סידן פנימה המופעלים על ידי פתיחה של תעלות סידן מסוג L תלויות-מתח, תוך שימוש בתמיסה פנימית מבוססת cesium.במקביל, ניתן לנטר את קפיצת הקיבול (capacitance jump) הנגרמת על ידי אקסוציטוזה תלויית סידן של שלפוחיות סינפטיות, המגדילה את שטח הפנים של הממברנה. אם תבצעו פאץ' (patch) לתא דו-קוטבי (bipolar cell) שלם של ה-MB באמצעות פיפט על הסוף הסינפטי, לא ייראו זרמי סידן מובחנים בשל זרמי הדלפה גדולים הנובעים מצימוד של מנקי-פער (gap junction) בתאי ה-MB הדו-קוטביים. מה שרואים הוא זרם דמוי-הדלפה גדול החוצה.עם זאת, עדיין ניתן לנטר את הקפיצה בקיבול (capacitance jump) באמצעות גירוי סינוסואידלי בתדר גבוה שמופעל לפני ואחרי שלב הדפולריזציה המוצג. להלן דוגמאות של I-R-D-I-C, תמונות של קצות תאי M bipolar. קצוות תקינים נוטים להיראות אליפטיים כפי שמוצג ב-A וב-B, בעוד ש-C מראה קצה מעורב, שנראה עגול ומעגלי.ניתן להשתמש בשיטת מילוי הצבע גם כדי לסווג את קצות התאים. להלן דוגמאות לתמונות פלואורסצנציה של קצות תאי MBI דו-קוטביים עם אקסון שלם ב-D, אקסון חתוך חלקית ב-e ואקסון שהוסר לחלוטין ב-F. הטרייתם (teria) מסומנת על ידי החצים הכחולים. כאן מוצגות המדידות הישירות של אותות דימות סידן, אקסוציטוזה ומשוב מעכב.בטרמינל של תא דו-קוטבי ב-MB, ריכוז סידן עולה וארעי בטלריה של טרמינל MB הופעל על ידי דפולריזציה של מדרגת voltage clamp; ניתן לראות את תמונת הפלואורסצנציה המתאימה של טלריה ה-MB בסעיף B. דוגמאות לדיכוי סינפטי לטווח קצר של שחרור מתווכי עצב מוצגות בסעיף C. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לצמצם את כמות התמיסה סביב הרשתית בעת הצבתה באגר של הערכה. הדבר ישפר את ההיצמדות של ה-Latinized לבלוק האגר.

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

סרטון זה מדגים טכניקת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה. פיפטת זכוכית דקה עם אלקטרודה משמשת להתקרבות לתאים אמקריניים מתפוצצים בכוכבים (SACs) בתוך הרשתית. לאחר יצירת חותם, היניקה מוחלת כדי לקרוע את הממברנה וליצור את תצורת מהדק טלאי התא כולו. לבסוף, זרימת היונים דרך קולטני SAC סינפטיים נמדדת באמצעות התצורה.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה

סרטון זה מדגים את ההליך למיפוי קשרים סינפטיים על ידי אבטחת פרוסת מוח, מיקום פיפטות להשגת תצורות של תאים שלמים, וגירוי נוירונים קדם-סינפטיים להקליט תגובות פוסט-סינפטיות, ובכך להבהיר קישוריות עצבית.

רישום מהדק טלאי זוגי של הקשרים העצביים בפרוסות מוח חריפות

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

הוסר לאחר מהגוף, רקמה עצבית היא השפיעה מאוד על ידי תנאים סביבתיים, המוביל השפלה הסופי של רקמות לאחר 6 - 8 שעות. באמצעות שיטת דגירה ייחודית, אשר מקיימים מעקב קפדני אחרת ומסדירה את הסביבה התאית של הרקמות, כדאיויות רקמות ניתן להאריך באופן משמעותי עבור&gt; 24 שעות.

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפה המכילים את הגרעין הגנוקה לרוחב ואת החקירה אלקטרופיסיולוגית של הפונקציה retinogeniculate ותפקוד הסינפסות. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה לחקר הסינפסות עם שחרור גבוה והסתברות נמוכה של שחרור באותן פרוסות מוח חדות.

החקירות האלקטאליות של הפונקציה Retinogeniculate ו Corticogeniculate סינפסה

תותבות רשתית יש את היכולת ליצור תפיסות חזותיות. כדי לקדם את הפיתוח של תותבות חדשות, יש צורך בשיטות ex vivo כדי לבדוק מכשירים לפני ההשתלה. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית כאשר הוא נתון לגירוי חשמלי.

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי יכולה לבסס קשרים סיבתיים בין ליקויים בירי עצבי לתפקוד לקוי של תעלת יונים. אנו מתארים שיטות ופרוטוקולים של מהדק דינמי בנוירונים של פורקינג'ה במוח הקטן של העכבר, תוך ציון משאבים שימושיים ושיקולים טכניים. במחקר מייצג, אנו מוסיפים מוליכות נתרן מעוצבת לנוירונים Tsc1-/- Purkinje כדי להציל ירי חוזר.

שיטות מהדק דינמי לחקירת ריגוש עצבי לקוי הקשור לאוטיזם

למד הכנת פרוסות רשתית באגאר לחקר מיקרומעגלים בסופי עצבים של תאים דו-קוטביים. השיטה מאפשרת מדידות patch-clamp ישירות מסופי עצב בודדים בדג זהב.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca^{2 +} הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

גלה סרטונים נוספים