Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית
19 בינואר 2012
כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.
המטרה הכללית של הליך זה היא להכין פרוסות רשתית המוטמעות באגר, לצורך חקר המעגלים המיקרוסקופיים הממוקמים בקצוות העצביים הפרסינפטיים של תאי ביפולר. מטרה זו מושגת תחילה על ידי השגת הרשתית מעין של דג זהב שהותאם לחושך, וחיתוך פיסה מלבנית קטנה מרשתית זו. לאחר מכן, פיסת הרשתית טובעת בתמיסת אגר שקופה בעלת נקודת התכה נמוכה, אשר מוקשחת לאחר מכן בתמיסת פריסה קרה ומתאימה.
השלב הבא הוא לחתוך את גוש האגר המוצק המכיל את פיסת הרשתინა המלבנית באמצעות ויברטור. השלב האחרון הוא ויזואליזציה, זיהוי וביצוע פאץ' (patch). קבע באמצעות קלמפ טרמינל עצבי של תא ביפולרי.
בסופו של דבר, התוצאות מראות את זרם הסידן הפרה-סינפטי ואת האקסוציטוזה הסינפטית הפיזית באמצעות מדידות קיבול ממברנה מטרמינלים של תאים דו-קוטביים (bipolar cells) מנותקים ושלמים. שלום, שמי Han Kim. אני פוסט-דוקטורנט במעבדת PCO של מכון Burham.
היום אציג את הכנת פרוסות רשתית פנים קרה בשיטת AGA ואדגים מדידת קיבול (capacitance) באמצעות patch clamp בצינור בודד. כדי להתחיל בהליך זה, בצעו חיתוך של כל עין של דג זהב על ידי גזירה אחידה מסביב לחלק הקדמי של העין בעזרת מספרי קפיץ. לאחר מכן, הניחו את כוסות העין בתמיסת פרוסות מקוררת ללא סידן.
במידת הצורך, הסירו את העדשה באמצעות פינצטה. לאחר מכן, הסירו את אפיתל הפיגמנט הצמוד לרשתית על ידי קילוף הרשתית מהגביע של העין באמצעות פינצטה עדינה בעלת קצוות זוויתיים של 45 מעלות. לאחר מכן, חתכו את העצב האופטי באמצעות פינצטה עדינה או מספרי קפיץ.
לאחר מכן, בצעו שאיבה באמצעות פיפטת פסטה (pasta pipette) משופרת או פיפטת העברה בעלת טיפ גדול. כדי להסיר את הרשתית, הסירו בעדינות את שאר האפיתל הפיגמנטי המחובר אליה. פני השטח של הרשתית הנקייה והבריאה צריכים להיראות חלקים.
לאחר מכן, טפל ברשתית המבודדת ב-IDE בריכוז גבוה יותר של כ-0.03% למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. להסרת ההומור ויטראוס (גוף הזجاجית), שים לב כי יש לבצע את הפעולה בתאורה חלשה. בשלב הבא, גזור פיסה מלבנית של רשתית בגודל של כ-שני על שני מילימטרים, הכוללת את מלוא עובי הרשתית, על ידי הסרת הקצוות המעוקלים בעזרת להב תער.
לאחר מכן, העבירו את פיסת הרשתית למכל קטן מלא בתמיסת אגר, ונסו לצמצם את כמות התמיסה סביב הרשתית בעת הנחתה לתוך האגר הנוזלי. לאחר מכן, טבלו את הרשתית עם האגר ישירות בתוך תמיסת החיתוך הקרה (בקרח) כדי להקשות את האגר. לבסוף, חתכו את בלוק האגר המוצק המכיל את פיסת הרשתית המלבנית לקובייה של 1x1x1 סנטימטר.
הדביקו את הבלוק לפני השטח של לוחית החיתוך בתא ה-preco slice. לאחר מכן, חתכו את הבלוק לפרוסות בעובי של 200 עד 250 מיקרון בתוך תמיסת חיתוך קרה בטמפרטורת קרח. באמצעות vibrato, ניתן להוציא סה"כ חמש עד 10 פרוסות, שנותרות חיוניות למשך כשלוש עד שש שעות.
לאחר מכן, העבירו את אחת הפרוסות לתא ההקלטה. הניחו מסגרת פלטינה בצורת U עם רשת של חוטי ניילון מעל הפרוסה. בצעו פרפוזיה רציפה של הפרוסה בקצב של 1-2 milliliters לדקה באמצעות תמיסת הקלטה המועברת דרכה בועות של קרבוגן.
בשלב זה, השתמש במזרק עם קצה מסנן של 0.2 מיקרון כדי למלא את פיפטת הפאץ' (patch pipette) מזכוכית בתמיסה פנימית, עד למפלס של סנטימטר אחד עד שניים מקצה האחורי של הפיפטה. לאחר מכן, הסר בועות אוויר מהקצה. אחסן את הפיפטה במחזיק.
הפעל לחץ חיובי על הפיפט והזז אותו לעבר הטרמינל המיועד באמצעות מיקרו-מניפולטור, תוך כדי הנעת הקצה כלפי מטה דרך הפרוסה. הזז את הפיפט בתנועת סריקה לצדדית כדי להבטיח שהפרוסה לא תימשך יחד עם הקצה. לאחר מכן, הנע את קצה הפיפט סביב הטרמינל כדי לנקות את פני השטח של הממברנה.
דחפו את התריס כלפי מטה כנגד קצה הטרמינל כדי ליצור שקע (dimple) ושחררו את הלחץ החיובי. אם לא נוצר אטם גיגה-אוהם (giga ohm seal) באופן מיידי, הפילו לחץ שלילי קל על הפ pipette. ברגע שנוצר אטם גיגה-אוהם, העבירו את מגבר ה-patch clamp מדגם E PC nine למצב הקלטה on-cell ושנו את פוטנציאל ההחזקה ל-60- או 70- millivolts.
בצע את תיקון הקיבול המהיר (fast capacitance correction) והמתן עד שהאיטום יתייצב בין 5 ל-10 giga ohms. לאחר מכן, קרע את הממברנה באמצעות שאיבה חזקה ועדינה, כדי להקים תצורת הקלטה של תא שלם (whole cell recording).
ניתן להשתמש גם בשאיבה באמצעות הפה במקום במזרק. לאחר שתצורת התא השלם הוקמה על קצה MB ממותח, יש להחיל דפולריזציה מדורגת של 200 millisecond מ-70- עד אפס millivolts. זכרו שגל סינוס של two kilohertz מוחל במצב voltage clamp לפני ואחרי דפולריזציה זו. על מנת למדוד קיבוליות ממברנה, הדפולריזציה מאפשרת מדידה ישירה של זרמי סידן פנימה המופעלים על ידי פתיחה של תעלות סידן מסוג L תלויות-מתח עם תמיסה פנימית מבוססת cesium.
במקביל, ניתן לנטר את הקפיצה בקיבול (capacitance jump) הנגרמת מהפרשה (exocytosis) תלוית-סידן של שלפוחיות סינפטיות, אשר מגדילה את שטח הפנים של הממברנה. אם תבצעו patch לתא bipolar של ה-MB שלם עם פיפטה בטרמינל הסינפטי, לא ייראו זרמי סידן מובחנים בשל זרמי דליפה גדולים הנובעים מצימוד של gap junctions ב-do rights של תאי ה-MB bipolar. מה שרואים הוא זרם דליפה גדול הפונה החוצה.
עם זאת, עדיין ניתן לנטר את קפיצת הקיבול (capacitance jump) באמצעות גירוי סינוסואידלי בתדר גבוה המופעל לפני ואחרי שלב הדפולריזציה המוצג. להלן דוגמאות של I-R-D-I-C, תמונות של סופי תאי M bipolar. סופים שלמים נוטים להיראות אליפטיים כפי שמוצג ב-A וב-B, בעוד ש-C מראה סוף תא מעורב, הנראה עגול וסימטרי.
ניתן להשתמש בשיטת מילוי הצבע גם כדי לסווג את קצות התאים. להלן דוגמאות לתמונות פלואורסצנציה של קצות תאי MBI דו-קוטביים עם אקסון שלם ב-D, אקסון חתוך חלקית ב-e ואקסון שהוסר לחלוטין ב-F. קצותיהם מסומנים בחצים הכחולים. כאן מוצגות המדידות הישירות של אותות דימות סידן, אקסוציטוזה ומשוב עיכבני.
בטרמינל של תא דו-קוטבי ב-MB, עלייה חולפת בריכוז הסידן בטלריה (teleria) של טרמינל MB הופעלה על ידי דפולריזציה בצעד של voltage clamp; את תמונת הפלואורסצנציה התואמת של טלריה ה-MB ניתן לראות ב-B. דוגמאות לדיכוי סינפטי קצר-טווח של שחרור מוליכים עצביים מוצגות ב-C. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למזער את כמות התמיסה מסביב לרשתית בעת הצבתה באגר של הקיט. פעולה זו תשפר את ההיצמדות של ה-Latinized לבלוק האגר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול להכנת פרוסות רשתית המוטמעות באגאר, המתאימות לחקר מיקרו-מעגלים בעמדי עצב של תאי בופולר פרה-סינפטיים. השיטה מאפשרת הקלטות patch-clamp ישירות של עמדי עצב פרה-סינפטיים בודדים, ובכך מקלה על חקירת סינפסות מסוג ribbon במעגלים של הרשתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- טכניקות דימות
רקע
- מעגלים זעירים ברשתית ממלאים תפקיד מכריע בעיבוד חזותי.
- הבנת מנגנונים סינפטיים חיונית למחקר במדעי המוח.
- טמיה באגר מספקת תמיכה מבנית עבור פרוסות דקות.
- טכניקות Patch-clamp מאפשרות מדידות חשמליות מדויקות.
מטרת המחקר
- להכנת פרוסות רשתית לבדיקה אלקטרופיזיולוגית.
- לחקר התפקוד של סינפסות מסוג סרט (ribbon-type synapses).
- לשיפור ההבנה של הדינמיקה במעגלים זעירים ברשתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השגת רשתית מעיני דג זהב שהותם בחושך.
- הטמעה של חתיכות רשתית באגאר בעל נקודת התכה נמוכה.
- חיתוך של גוש האגאר המוצק באמצעות ויברטום.
- ויזואליזציה וביצוע patch-clamp של סופי העצבים של תאי דו-קוטביים.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של פרוסות רשתית מוטמעות באגר.
- הוכחת היתכנות של הקלטות patch-clamp ישירות.
- זיהוי סינפסות מסוג סרט (ribbon-type synapses) במעגלי הרשתית.
- השיטה מאפשרת מחקר מפורט של התפקוד הסינפטי.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר מעגלים מיקרו-וסקולריים ברשתית.
- הקלטות patch-clamp ישירות יכולות לחשוף דינמיקה סינפטית.
- גישה זו עשויה לקדם את המחקר במדעי העצב של הראייה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר חקירה אלקטרופיזיולוגית ואופטית ישירה של סופי עצבים פרה-סינפטיים במעגלים זעירים של הרשתית, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטית של יעדים סינפטיים המעורבים בעיבוד אותות חזותיים. על ידי כימות אקסוציטוזה תלוית סידן ומשוב עיקבי בסינפסות מסוג ribbon, הוא מספק ביטחון ניבוי בתיקוף יעדים עבור תוכניות גילוי במדעי העצבים. גישה זו נותנת מענה לנקודת הכרעה מרכזית בשלב הגילוי המוקדם, שבה תיקוף תפקודי של מנגנונים פרה-סינפטיים מנחה החלטות go/no-go לפיתוח מודולטורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידה של זרמי סידן פרה-סינפטיים ושינויים בקיבולות הקשורים לאקסוציטוזה של שלפוחיות.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים של תפקוד סינפסות מסוג ribbon באמצעות גישה ישירה לקצות עצביים מבודדים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות פלסטיות לטווח קצר של שחרור מתווכיt עצביים מעוררים ומעכבים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות בהמשך, על ידי ייצוב פרוסות רשתית עבור אלקטרופיזיולוגיה ודימיון.
- פלטים כמותיים: יצירת קריאות הדירות של קיבול ממברנה ודימיון סידן, המאפשרות השוואת השפעות של תרכובות.
- מדרגיות: תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מספר טרמינלים לכל פרוסה, דבר המשפר את התפוקה לחקירת מנגנונים סינפטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תואם למודלים של מחלה נוירודגנרטיבית של הרשתית שבה תפקוד סינפטי לקוי קודם לאובדן תאים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי שימור ארכיטקטורת המעגל המיקרוסקופי הטבעית בפסנאות טבועות באגר.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי יעילות של מודולטורים על ידי לכידה של דינמיקת עיכוב משוב הדדי מתאי אמקרין.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישור המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), באמצעות אספקת קריאות תפקודיות של פעילות פרה-סינפטית במערכת הרלוונטית למחלה.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות לגבי מנגנונים פרה-סינפטיים באמצעות מדידה ישירה של זרימת סידן ואקסוציטוזה.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של פרוסות וגישה יציבה לטרמינלים לצורך הקלטות חוזרות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה כמותית של תנאים תוך שימוש בקפיצות קיבול ממברנה ובדימיון סידן כמשתנים תלויים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רציפות פרה-קלינית על ידי שימור מיקרו-מעגלים סינפטיים בפרוסות רשתית למחקר אורך.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת הניתנת לשימוש חוזר לחקירת תפקוד סינפטי על פני מספר מפגשים ניסיוניים לכל הכנה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באישור המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באותות פרה-סינפטיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות נהלי הטמעה באגר וחיתוך סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים על פלסטיות סינפטית ועכבה במשוב.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות מותאם סיכון של תרכובות המודולות תעלות סידן פרה-סינפטיות או את מנגנון שחרור הוסיקולות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של patch-clamp electrophysiology ודימוי סידן.
- תלוי בציוד חיתוך רטט (vibratory slicing) ובאגר בעל נקודת התכה נמוכה לייצוב הרקמה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת איכות פרוסות עקבית וזיהוי טרמינלים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר למערכות מודל אחרות בעלות ארכיטקטורות סינפטיות שונות.
- מוגבל על ידי חלון החיוניות של הרקמה, הנמשך 5–6 שעות לאחר החיתוך, דבר המחייב ביצוע של הניסוי באותו היום.
