Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית
January 19th, 2012
כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין פרוסות רשתית משובצות אגר לחקר המיקרו-מעגלים הממוקמים במסופי העצב של התאים הדו-קוטביים הקדם-סינפטיים. זה מושג תחילה על ידי השגת הרשתית מעין דג זהב מותאמת כהה וחיתוך חתיכה מלבנית קטנה של רשתית זו. לאחר מכן טובלים את חתיכת הרשתית בתמיסת אגר שקופה ונמוכה עם נקודת התכה, אשר לאחר מכן מתמצקת בתמיסת פרוסה קרה ונחמדה.
השלב הבא הוא לפרוס את גוש האגר המוצק המכיל את חתיכת הרשתית המלבנית באמצעות ויברטור. השלב האחרון הוא הדמיה, זיהוי ותיקון. מהדק מסוף עצב של תאים דו קוטביים.
בסופו של דבר, התוצאות מראות את זרם הסידן הקדם-סינפטי ואת האקסוציטוזיס הפיזיקלי הסינפטי עם מדידות קיבול ממברנה ממסופי תאים דו-קוטביים אטומים ושלמים. היי, שמי האן קים. אני פוסט-דוקטורנט ב-PCO של מעבדה במכון בורהאם.
היום אני הולך להציג הכנת פרוסה משובצת AGA של רשתית פנים קרה ולהדגים מדידת קיבול מהדק תיקון בצינור יחיד של. כדי להתחיל בהליך זה, יש לחתוך כל עין של דג זהב על ידי חיתוך שווה סביב קדמת העין עם מספריים קפיציים. לאחר מכן מניחים את כוסות העיניים בתמיסת פרוסות צוננת ללא סידן.
במידת הצורך, הסר את העדשה בעזרת פינצטה. לאחר מכן, הסר את אפיתל הפיגמנט המחובר לרשתית על ידי קילוף הרשתית הרחק מכוס העין עם זוג מלקחיים עדינים עם קצה זווית של 45 מעלות. לאחר מכן, חתוך את עצב הראייה בעזרת זוג מלקחיים עדינים או מספריים קפיציים.
לאחר מכן יש למרוח יניקה עם פיפטת פסטה שונה או פיפטה גדולה להעברת קצה. כדי להסיר את הרשתית, הסר בעדינות את שאר אפיתל הפיגמנט המחובר לרשתית. פני הרשתית הנקייה והבריאה צריכים להיראות חלקים.
לאחר מכן טפל ברשתית המבודדת עם IDE גבוה בכ-0.03% במשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להסיר את ההומור הזגוגי, שימו לב כי יש לבצע את ההליך בתאורה חלשה. בשלב הבא חותכים חתיכת רשתית מלבנית בערך שניים על שני מילימטרים, המכילה את מלוא עובי הרשתית על ידי הסרת הקצוות המעוקלים בעזרת סכין גילוח.
לאחר מכן העבירו את חתיכת הרשתית למיכל קטן מלא בתמיסת אגר ונסו למזער את כמות התמיסה סביב הרשתית כשהיא מונחת לתוך האגר הנוזלי. לאחר מכן טבלו את הרשתית עם האגר ישירות בתמיסת הפרוסה הקרה כקרח על מנת למצק את האגר. לאחר מכן, חותכים את גוש האגר המוצק המכיל את חתיכת הרשתית המלבנית לקוביית סנטימטר אחד אחד.
הדביקו את הבלוק על פני צלחת החיתוך בתא פרוסות הפרקו. לאחר מכן פורסים את הבלוק לפרוסות בעובי של 200 עד 250 מיקרון בתמיסת פרוסות קרות כקרח. בעזרת ויברטו ניתן להשיג בסך הכל חמש עד 10 פרוסות, שהן ברות קיימא למשך כחמש עד שש שעות.
לאחר מכן, העבירו את אחת הפרוסות לתא ההקלטה. הניחו מסגרת פלטינה בצורת U עם רשת של חוטי ניילון על גבי הפרוסה. טפטפו את הפרוסה ברציפות בקצב של מיליליטר עד שניים לדקה עם תמיסת הקלטה מבעבעת בקרבוגן.
בשלב זה, השתמש במזרק עם קצה מסנן 0.2 מיקרון כדי למלא את פיפטת תיקון הזכוכית בתמיסה פנימית עד לרמה של סנטימטר עד שני סנטימטרים מגב הפיפטה. לאחר מכן הסר בועות אוויר מהקצה לאחר מכן. אבטח את הפיפטה במחזיק.
הפעל לחץ חיובי על הפיפטה והזיז אותה לכיוון המסוף הממוקד באמצעות מיקרו מניפולטור תוך הזזת הקצה כלפי מטה דרך הפרוסה. הזז את הפיפטה בכיוון גורף לרוחב כדי להבטיח שהפרוסה לא נמשכת יחד עם הקצה. לאחר מכן הזז את קצה הפיפטה סביב המסוף כדי לנקות את משטח הממברנה.
דחוף את הקצה כלפי מטה כנגד קצה הטרמינל כדי ליצור גומה ולשחרר את הלחץ החיובי. אם לא נוצר אטם ג'יגה אוהם, הפעל מיד לחץ שלילי קל על הפיפטה. לאחר שנוצר אטם ג'יגה אוהם, העבר את מגבר מהדק ה-E PC תשע תיקון למצב ההקלטה המוכר ושנה את פוטנציאל ההחזקה למינוס 60 או מינוס 70 מילי-וולט.
החל את תיקון הקיבול המהיר והמתן עד שהאטם יתייצב בין חמישה ל -10 ג'יגה אוהם. ואז לקרוע את הממברנה ביניקה חדה ועדינה. כדי ליצור תצורת הקלטת תא שלם.
אתה יכול גם להשתמש ביניקת פה במקום מזרק. לאחר שכל תצורת התא נקבעה על מסוף MB אטום, החל דפולריזציה של 200 אלפיות השנייה ממינוס 70 לאפס מילי-וולט. זכור כי גל סינוס של שני קילו-הרץ במצב מהדק מתח מוחל לפני ואחרי דפולריזציה זו על מנת למדוד את קיבול הממברנה, הדפולריזציה מאפשרת מדידה ישירה של זרמי סידן פנימה המופעלים על ידי פתיחת תעלות סידן מסוג L מגודרות מתח עם תמיסה פנימית מבוססת צזיום.
במקביל, ניתן לעקוב אחר קפיצת הקיבול הנגרמת על ידי אקסוציטוזיס תלוי סידן של שלפוחיות סינפטיות, מה שמגדיל את שטח הפנים של הממברנה. אם תא דו-קוטבי MB שלם מתוקן עם הפיפטה על המסוף הסינפטי, לא ייצפו זרמי סידן ניכרים בגלל זרמי הדליפה הגדולים עקב צימוד צומת הפער בזכויות הביצוע של התאים הדו-קוטביים MB. מה שרואים הוא דליפה גדולה החוצה כמו זרם.
עם זאת, עדיין ניתן לעקוב אחר קפיצת הקיבול עם גירוי סינוסואידלי בתדר גבוה המופעל לפני ואחרי שלב הדפולריזציה המוצג. להלן הדוגמאות של I-R-D-I-C, תמונות של מסופי תאים דו-קוטביים M. המסופים השלמים נוטים יותר להיראות אליפטיים כפי שמוצג ב-A ו-B בעוד ש-C מציג את הטרמינל המצויר, שנראה עגול ועגול.
ניתן להשתמש בשיטת מילוי הצבע גם כדי לסווג את מסופי התא. להלן הדוגמאות לתמונות הקרינה של מסופי תאים דו-קוטביים MBI עם אקסון שלם ב-D, אקסון חתוך חלקית ב-e ואקסון שהוסר במלואו ב-F. הטריות שלהם מסומנות על ידי החצים הכחולים. כאן מראה את המדידות הישירות של אותות הדמיית סידן, אקסוציטוזיס ומשוב מעכב.
במסוף תא דו קוטבי MB, ריכוז סידן עולה חולף בטלריה של מסוף MB הופעל על ידי דפולריזציה של שלב מהדק מתח בתמונת הקרינה המתאימה של טלריה MB ניתן לראות ב- B.דוגמאות לדיכאון סינפטי לטווח קצר של שחרור נוירוטרנסמיטר מוצגות ב- C.תוך כדי ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את כמות התמיסה סביב הרשתית כאשר היא מונחת באגר הערכה. זה ישפר את ההצמדה של לטינית מגוש האגר
.View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול להכנת פרוסות רשתית מוטמעות אגר המתאימות לחקר מיקרו-מעגלים בסופני עצב קדם-סינפטיים של תאים דו-קוטביים. השיטה מאפשרת הקלטות פאטץ'-קלמפ ישירות של סופני עצב קדם-סינפטיים בודדים, ומקלה על החקירה של סינפסות מסוג רצועה במעגלים ברשתית.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- טכניקות הדמיה
רקע
- מיקרו-מעגלים ברשתית ממלאים תפקיד מכריע בעיבוד ויזואלי.
- הבנת מנגנונים סינפטיים חיונית למחקר מדעי המוח.
- הטמעה באגר מספקת תמיכה מבנית לפרוסות דקות.
- טכניקות פאטץ'-קלמפ מאפשרות מדידות חשמליות מדויקות.
מטרת המחקר
- להכין פרוסות רשתית לניתוח אלקטרופיזיולוגי.
- לחקור את תפקודן של סינפסות מסוג רצועה.
- לשפר את ההבנה של הדינמיקה של מיקרו-מעגלים ברשתית.
שיטות ששימשו
- השגת רשתית מעיניים של דג זהב שהותאמו לחושך.
- הטמעת חלקי רשתית באגר עם נקודת התכה נמוכה.
- חיתוך גוש האגר המוצק באמצעות ויברטום.
- ויזואליזציה והקלטת פאטץ'-קלמפ של סופני עצב דו-קוטביים.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של פרוסות רשתית מוטמעות אגר.
- הוכחת היתכנות הקלטות פאטץ'-קלמפ ישירות.
- זיהוי סינפסות מסוג רצועה במעגלים ברשתית.
- השיטה מאפשרת חקר מפורט של תפקוד סינפטי.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לחקר מיקרו-מעגלים ברשתית.
- הקלטות פאטץ'-קלמפ ישירות יכולות לחשוף דינמיקה סינפטית.
- גישה זו עשויה לקדם מחקר בתחום מדעי המוח הויזואליים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct electrophysiological and optical interrogation of presynaptic nerve terminals in retinal microcircuits, supporting mechanistic de-risking of synaptic targets involved in visual signal processing. By quantifying calcium-dependent exocytosis and inhibitory feedback at ribbon-type synapses, it provides predictive confidence in target validation for neuroscience discovery programs. The approach addresses a key inflection point in early discovery where functional validation of presynaptic mechanisms informs go/no-go decisions for modulator development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring presynaptic calcium currents and capacitance changes linked to vesicle exocytosis.
- Operational Value: Enables biological de-risking of ribbon-type synapse function through direct access to isolated nerve terminals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying short-term plasticity of excitatory and inhibitory neurotransmitter release.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by stabilizing retinal slices for electrophysiology and imaging.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible membrane capacitance and calcium imaging readouts enabling compound effect comparison.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple terminals per slice, enhancing throughput for synaptic mechanism interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with retinal neurodegenerative disease models where synaptic dysfunction precedes cell loss.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by preserving native microcircuit architecture in agar-embedded slices.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on modulator efficacy by capturing reciprocal feedback inhibition dynamics from amacrine cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing functional readouts of presynaptic activity in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of presynaptic mechanisms via direct measurement of calcium influx and exocytosis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice preparation and stable terminal access for repeated recordings.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions using membrane capacitance jumps and calcium imaging as dependent variables.
- Translational Research: Maintains preclinical continuity by preserving synaptic microcircuits in retinal slices for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing synaptic function across multiple experimental sessions per preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in presynaptic signaling.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized agar embedding and slicing procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative data on synaptic plasticity and feedback inhibition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds modulating presynaptic calcium channels or vesicle release machinery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in patch-clamp electrophysiology and calcium imaging techniques.
- Depends on vibratory slicing equipment and low-melting-point agar for tissue stabilization.
- Necessitates cross-team standardization for consistent slice quality and terminal identification.
- Involves adaptation considerations when transferring to other model systems with different synaptic architectures.
- Limited by tissue viability window of 5–6 hours post-slicing, requiring same-day experimental execution.
