פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק פרוסות אורגנוטיפיות מהמוח האמצעי העוברי ביום E 12.5 לצורך ניתוח של נוירונים דופמינרגיים בשלבי התפתחותם. זאת מושג תחילה על ידי דיסקציה של המוח העוברי, ולאחר מכן השבחה של המוח בתוך agarose בעל נקודת התכה נמוכה.

השלב השלישי הוא חיתוך פרוסות המוח באמצעות ויברטום. השלב הסופי הוא בחירת פרוסת המוח המתאימה לתרבית ולדימוי בזמן אמת (time-lapse). לבסוף, דימוי בזמן אמת ומיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה משמשים להדגמת השלבים המוקדמים של נוירונים דופמינרגיים, התנהגות נדידה ודיפרנציאציה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית, כגון מעקב אחר נוירונים והתנהגות נדידה במהלך התפתחות החלק הוונטרלי של המוח. יום אחד לפני הדיסקציה, הכינו תמיסת Krebs buffer וגם את מצע התרבית בהתאם לכתב העת המצורף, כשעתיים לפני הדיסקציה. הכינו 100 milliliters של 4% low melting agarose ב-Krebs buffer על ידי חימום התמיסה במיקרוגל עד להמסה מלאה של ה-agarose.

לאחר מכן, מקמי את ה-aros במקלח מים בטמפרטורה של 45 °C. בשלב הבא, מלאי את מגש הבאפר של ה-Vibram בבפר Krebs קר מאוד. הפעילי את אלמנט הקירור ושמרי עליו בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר מכן, קבעו להב תער בתוך נשא הלהבים. הכינו סקאלפל, מכחול עדין וכף מחוררת קטנה לאיסוף הפרוסות מאזור הוויברטור לצורך חיתוך מאוחר יותר. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת Krebs לבצלחונות פטרי סטריליים ושמרו אותם על קרח.

באזור הניתוח, הכין שלוש צלחות פטרי סטריליות גדולות לניתוח ושתי צלחות פטרי סטריליות קטנות להטמעה, זוג מספריים קטנים, שתי פינצטות עדינות, כף מחוררת קטנה, פיפטת פסטור מזכוכית שעברה ליטוש באש עם קצה עגול סגור والليטר אחד של Krebs buffer על קרח. נגב את כל כלי הניתוח ב-70% ethanol. לאחר מכן, הוסף מצע גידול לבארות של פלטת שש בארות והדגר אותה ב-37 °C למשך שעתיים.

בשלב הבא, הוסיפו 1.5 milliliters של Krebs buffer עם penicillin streptomycin לכל באער של פלטה נוספת בעלת שישה באערים תחת תנאים סטריליים. הכניסו milli cell membrane inserts לבאערים. הניחו את הפלטה בעלת ששת הבאערים לצד ה-vibrato כך שניתן יהיה להעביר את פרוסות המוח אל ממברנות המסנן.

מיד לאחר החיתוך, יש להקריב עכברה נקבה הרייה עם עוברים בשלב E 12.5 ולהוציא את הרחם על ידי הרמתו בעזרת פינצטה. לאחר מכן, השתמש בפינצטה נוספת כדי לקרוע את השריר הרחמי (myometrium) מהרחם. לאחר מכן, הנח את הרחם בבפר Krebs קר במקרר קרח תחת המיקרוסקופ.

השתמשו בזוג פינצטות עדינות כדי להפריד את הדופן השרירית של הרחם, את קרומי ריקר (riker's membrane) ואת שק החלמון הוויסרלי מהעובר. לאחר מכן, הוציאו את העוברים מהרחם והעבירו כל עובר לצלוחית פטרי נפרדת המכילה תמיסת Krebs sterile buffer. לאחר מכן, חתכו את ראשו של כל אחד מהעוברים.

קבע את הראש על ידי דקירה בגובה העין באמצעות פינצטה עדינה. השתמש בזוג פינצטות נוסף כדי להסיר בזהירות את העור ואת הגולגולת. לאחר מכן, הרם בזהירות את המוח והעבר אותו לצלחת פטרי עם Krebs buffer סטרילי.

לאחר מכן, שטפו את המוחות ב-4% Low melting point aros. טמנו שתיים עד שלוש מוחות בכל פעם ב-4% fresh, low melting point aros, באמצעות פיפט פסטור בעל קצה עגול המלוטש באש.

לאחר מכן, הניחו את כלי ההטמעה על קרח בצורה מאוזנת ככל האפשר. לאחר מכן, הרימו את המוחות עד שהחלק התחתון של ה-aros יתמצק, כך שהמוחות יוכלו לשקוע באופן אחיד ולהיות מקבילים לתחתית בלוק ה-aros. כאשר ה-aros התמצק לחלוטין, גזרו את ה-aros המקיף את המוחות.

לאחר מכן, הדביקו את הבלוק על במה הדגימה של הוויברטום. בעת הדבקת הבלוק, ודאו שהצד הוונטרלי (הבטני) של המוח מקביל לבמה. בצעו חיתוכים אופקיים בעובי 300 micron בתדר של 50 hertz, אמפליטודדת להב של 1.1 millimeters ומהירות של 25 millimeters per second.

אספו את פרוסות המוח באמצעות מברשת צבע דקה כדי לדחוף את הפרוסה לכף מחוררת קטנה. לאחר מכן, העבירו אותן תחת המיקרוסקופ לצלחית המכילה בופר Krebs סטרילי וקר מאוד. בחרו את הפרוסה המכילה רקמה מהאזור הוונטרלי של האות המוחית (ventral midbrain).

בשלב זה, השתמש בכף מחוררת קטנה ובמכחול עדין כדי להעביר את פרוסות המוח אל תוך מעמדי קרומי תאי milli בתוך פלטת שש בארות המכילה תמיסת Krebs שהוכנה מוקדם יותר. לאחר מכן, העבר את הקרומים עם הפרוסות לפלטת שש בארות אחרת עם מצע גידול; שמור על החלק העליון של הקרומים יבש, כך שפרוסות המוח יקבלו מצע מלמטה ואוויר מלמעלה.

הניחו את הפרוסות באינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. חשוב מאוד להניח את הפרוסות באינקובטור בתוך שעתיים לאחר השלב הראשוני של הדיסקציה. ניתן לתחזק פרוסות אלו in vitro למשך שלושה עד ארבעה ימים.

לאחר ארבע עד חמש שעות של התאוששות, ניתן להשתמש בחתכים לדימות בשיטת time-lapse רגע לפני הדימות. יש להוסיף לצלחית 1.5 µL של ascorbic acid בריכוז 200 mM כדי להגן על החתכים מפני פוטוטוקסיות.

דגרו את הפרוסות בתא סביבתי בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide במהלך דימוי בשיטת time-lapse. להלן פרוסה אקוטית המראה את המיקום הרגיל של נוירונים דופמינרגיים במידבראין הוונטרלי (ventral midbrain), שבה ההשלכות למוח הקדמי טרם התפתחו. לאחר יום אחד בתרבית, השלוחות למוח הקדמי מתחילות להיווצר, כפי שמוצג על ידי החץ הצהוב.

חצי חץ לבן מציין את מיקום גופי התא המוצגים בהגדלה גבוהה יותר בתוספות (insets). כאן מוצג נתיב הנדידה של נוירונים המסומנים ב-YFP. בחתך אופקי אקוטי, המיקום הראשוני של התאים מסומן בחצי חץ אדום.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מכינים פרוסות גנוטיפיות מהמוח האמצעי העוברי של דג ימי ביום E 12.5, כדי להשיג פרוסות חיות ושלמות. חשוב לבצע את הדיסקציה של המוח העוברי בזהירות, ולאחר החיתוך ב-vibrato לבחור את פרוסת המוח הנכונה לתרבית ולדימות TimeLapse.