פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פרוסות אורגנוטיפיות מהמוח האמצעי העוברי של נוירון E 12.5 לניתוח נוירונים דופמינרגיים מתפתחים. זה מושג על ידי ניתוח המוח העוברי תחילה. ואז המוח מוטמע באירוס נמס נמוך.

השלב השלישי הוא לחתוך את פרוסות המוח באמצעות ויברטור. השלב האחרון הוא לבחור את פרוסת המוח הנכונה לתרבית והדמיית זמן-lapse. בסופו של דבר, הדמיית זמן-lapse ומיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית משמשות כדי להראות את השלבים המוקדמים של נוירונים דופמינרגיים, התנהגות נדידה והתמיינות.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-התפתחותי, כגון מעקב אחר נוירונים והתנהגות נודדת במהלך המוח הגחוני ההתפתחותי. יום אחד לפני הנתיחה, הכינו מאגר X קרבס אחד ואת מדיום התרבית על פי כתב היד המצורף כשעתיים לפני הנתיחה. הכן 100 מיליליטר של 4% ארוס נמס נמוך במאגר קרבס על ידי חימום התמיסה במיקרוגל עד להמסה מלאה של הארוס.

לאחר מכן מניחים את הארוס באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מלאו את מגש החיץ של Vibram במאגר קרבס קר כקרח. הפעל את גוף הקירור ושמור אותו על ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, תקן סכין גילוח במנשא הלהב. הכינו אזמל, מכחול עדין וכף מחוררת מיני לאיסוף הפרוסות באזור הוויברטור לחיתוך מאוחר יותר. לאחר מכן הוסיפו את מאגר קרבס לצלחות הפטרי הסטריליות ושמרו אותן על קרח.

באזור הנתיחה הכינו שלוש צלחות פטרי סטריליות גדולות לדיסקציה ושתי צלחות פטרי סטריליות קטנות להטמעת זוג מספריים קטנות, שני זוגות מלקחיים עדינים, כף מיני מחוררת, אש מרעה מזכוכית מלוטשת בקצה סגור עגול וליטר אחד של חיץ קרבס על קרח. נגב את כל כלי החיתוך עם 70% אתנול. לאחר מכן, הוסיפו מדיום תרבית לבארות של צלחת שש בארות ודגרו אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר של מאגר קרבס עם סטרפטומיצין פניצילין לכל באר של צלחת אחרת של שש בארות בתנאים סטריליים. הנח תוספות קרום תא מילי בבארות. הניחו את צלחת שש הבארות ליד הוויברטו כך שניתן יהיה להעביר את פרוסות המוח אל ממברנות המסנן.

מיד לאחר החיתוך, הקריבו עכברה בהריון עם עוברים בשלב E 12.5 והסירו את הרחם על ידי הרמתו עם זוג מלקחיים. לאחר מכן השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לקרוע את השריר מהרחם. לאחר מכן, הניחו את הרחם במאגר קרבס קר כקרח מתחת למיקרוסקופ.

השתמש בזוג מלקחיים עדינים כדי להפריד את דופן השרירים של הרחם, קרום הרייקר ושק החלמון הקרביים מהעובר. לאחר מכן הוציאו את העוברים מהרחם והעבירו את העובר לצלחת פטרי נפרדת עם חיץ קרבס סטרילי. לאחר מכן, חתכו את הראש מכל אחד מהעוברים.

תקן את הראש על ידי ניקוב דרכו בגובה העיניים עם זוג מלקחיים עדינים. השתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי להסיר בזהירות את העור והגולגולת. לאחר מכן הרימו בזהירות את המוח והעבירו אותו לצלחת פטרי עם חוצץ קרבס סטרילי.

לאחר מכן, שטפו את המוח ב-4% נקודת התכה נמוכה. הטמע שניים עד שלושה מוחות בכל פעם ב-4% רעננים עם נקודת התכה נמוכה. בעזרת פיפטה פסטר עם קצה עגול מלוטש באש.

לאחר מכן הניחו את כלי ההטבעה על קרח בצורה אחידה ככל האפשר. לאחר מכן, הרם את המוח עד שתחתית הארוס מתמצקת, כך שהמוחות יכולים להתיישב באופן שווה ולהיות מקבילים לתחתית גוש הארוס. כאשר הארוס התמצק במלואו, חתוך את הארוס המקיף את המוח.

לאחר הדבק הזה, הארוס חוסם על שלב הדגימה של הויברטור. בעת הדבקת הבלוק, ודא שהצד הגחוני של המוח מקביל לפלטפורמה. חתך פרוסות אופקיות בעובי 300 מיקרון בתדר של 50 הרץ, משרעת להב של 1.1 מילימטר ומהירות של 25 מילימטרים לשנייה.

אוספים את פרוסות המוח באמצעות מברשת הצבע העדינה כדי לדחוף את הפרוסה לכף מחוררת קטנה. לאחר מכן העבירו אותם לצלחת עם מאגר קרבס קר קרח סטרילי מתחת למיקרוסקופ. בחר את הפרוסה המכילה רקמת מוח תיכון גחונית.

בשלב זה, השתמש בכף מיני מחוררת ובמכחול דק כדי להעביר את פרוסות המוח על תוספות קרום תאי מילי-בצלחת שש בארות עם מאגר קרבס שהוכנה קודם לכן. לאחר מכן, העבירו את הממברנות עם הפרוסות לשש נוספות. צלחת היטב עם מדיום תרבות, שמור על החלק העליון של הממברנות יבש כך שפרוסות המוח יקבלו מדיום מלמטה ואוויר מלמעלה.

מניחים את הפרוסות באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני בחום של 37 מעלות צלזיוס. חשוב מאוד שהפרוסות יונחו בחממה תוך שעתיים לאחר השלב הראשוני של הדיסקציה. ניתן לשמור על פרוסות אלה במבחנה במשך שלושה עד ארבעה ימים.

לאחר ארבע עד חמש שעות של התאוששות. ניתן להשתמש בפרוסות בהדמיית זמן-lapse ממש לפני ההדמיה. הוסף למנה 1.5 מיקרוליטר, 200 מילי-מולרית חומצה אסקורבית כדי להגן על הפרוסות מפני פוטוטוקסיות.

דגרו את הפרוסות בתא סביבתי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במהלך הדמיית זמן-lapse. הנה פרוסה חריפה המציגה את המיקום הנורמלי של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון הגחוני שבו ההקרנות למוח הקדמי עדיין לא התפתחו. לאחר יום אחד בתרבית, ההקרנות למוח הקדמי מתחילות להיווצר כפי שמצוין על ידי החץ הצהוב.

ראשי חץ לבנים מציינים את מיקום גופי התאים המוצגים בהגדלה גבוהה יותר בכניסות. הנה שורש הנדידה של נוירונים המסומנים ב-YFP. בפרוסה אופקית חריפה, המיקום הראשוני של התאים מסומן בראש חץ אדום.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין פרוסות גנוטיפיות מהמוח התיכון העוברי הימי E 12.5 כדי להשיג פרוסות ברות קיימא ושלמות. חשוב לבצע את דיסקציה של המוח העוברי בזהירות ולאחר חיתוך ויברטו כדי לבחור את פרוסת המוח הנכונה לתרבית והדמיית TimeLapse.