Name: הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: למדו לזהות מינים חמצן תגובתי בתרביות תאים באמצעות צבענים פלואורסצנטיים, מבחני צבע וזוהר. שיטות אלו מאפשרות הערכת מתח חמצוני ומדידת רמות חנקן חמצני בביולוגיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (CA142664).

1. איתור של ROS באמצעות carboxy-H 2 DCFDA Carboxy-H 2 DCFDA הוא לא פלורסנט אלא בנוכחותו של ROS, כאשר זה מגיב מתחמצן, הוא הופך להיות פלואורסצנטי ירוק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, פתרון להכין מלאי חדש של carboxy-H 2 DCFDA ב dimethylsulfoxide סטרילי (DMSO) או 100% אתנול. הימנע מרובים ההפשרה / ההקפאה מחזורים של צבע שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם HEPES שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) או פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר עקבות של המדיום המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען תאים עם צבען (ואת צבע שליטה, סעיף ראו הערה). ב assay זה השתמשנו Jurkat, קו אנושי תא לוקמיה. השתמש carboxy-H 2 DCFDA בריכוז הסופי של 1μM במדיום תרבות קבוע עם סרום מופחת (2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבויות במשך 30 דקות בחושך, בתוך חממה קונבנציונלי (37 ° C, CO2 5%). מחק את כל פתרונות לצבוע בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר carboxy-H 2 DCFDA המכיל בינוני לשטוף פעמיים עם HBSS או PBS. מתוך שלב זה קדימה, להגן על התאים שלך מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני טרי המכיל תרופה לפי בחירתך את carboxy-H 2 DCFDA טעון תאים דגירה כרצונכם. בדוגמה זו אנו משתמשים H 2 O 2 (0.03%) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת ROS על ידי מיד לניתוח התאים על ידי זרימה cytometry באמצעות הערוץ FL1 (פלואורסצנטי ירוק), או על ידי קורא צלחת פלואורסצנטי, או על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הקרינה ניתן לאתר באמצעות עירור ופליטה אורכי הגל המתאימים פלואורסצנטי ירוק. </li></ol> הערה: בקרת צריכה לכלול carboxy-H 2 DCFDA טעון בתאים שלא טופלו ותאי מטופל בלא כתם. Carboxy-H 2 DCFDA ידוע לזהות peroxides אבל יכול להיות גם על ידי ROS חמצון אחרים. מגיב זה יכול גם להיות שונה באמצעים אחרים, לצבוע רגישות חמצון בקרה כגון 5 - (ו -6), carboxy-2 ", 7'-dichlordiacetate ofluorescein (carboxy-DCFDA) ולכן צריך להיכלל במבחן. 2. מדידה של ייצור תחמוצת החנקן (NO) יהיה עליך Sulfanilamide ו-N-1-napthylethylenediamine (NED) פתרונות dihydrochloride, ורמת ניטריט. Assay זה נקרא assay Griess. פתרון NED: הכן פתרון 0.1% dihydrochloride N-1-napthylethylenediamine מדולל פתרון water.Sulfanilamide סטרילי: הכן פתרון 1% sulfanilamide בדילול מלא חומצה זרחנית 5%. תקן ניטריט: לדלל את רמת הנתרן 0.1M הניטריט המניות 100μM במדיום סטרילי, לעשות דילול סדרתי במדיום זהה. תנאי אחסון: כימיקלים חנות לפי הוראות היצרן בטמפרטורת החדר. כאשר מחדש, נד ופתרונות Sulfanilamide מאוחסנים מיד לאחר השימוש ב 4 ° C, בחושך, וגם לתקופה מקסימלית של 3 חודשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים בצלחת 96 באר,השימוש triplicates עבור כל תנאי, והם כוללים בקרות נאותה על פי הניסויים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים כדי לגרום NO הייצור. בניסוי שלנו אנו משתמשים lipopolysaccharide (LPS) (100 ng / ml) ו-IL-4 רקומביננטי לטיפול בתאים שלנו. בפרוטוקול זה, השתמשנו RAW 264.7, macrophage עכבר קו תאים (leukaemic עכבר קו מונוציטים macrophage התא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של assay, להביא את שני ריאגנטים לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הצלחת שלך, לאסוף supernatants תא ולהעביר 50μl לצלחת 96 חדש גם כן. הכן הגבלת בארות דילול של מניות פתרון סטנדרטי שלך לעשות עקומת סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl הפתרון Sulfanilamide לדגום כל ולשלוט היטב ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl של פתרון N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride לדגום כל ולשלוט היטב ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד absorbance מיד באמצעות קורא צלחת עם מסנן של אורכי גל שבין 520nm ו 550nm. </li></ol> אם אתם משתמשים שונים צלחת / תבשיל גדלים, להשתמש 1/1/1 נפח לפתרון כל supernatant המדגם. צבע סגול יופיעו בארות חיובית. התוצאות שהושגו עם תקן יעזור לך לבדוק את היציבות של פתרונות שלך. 3. איתור של ROS פעולה: חלבונים חמצון שיטה אחרת כדי לזהות את הייצור של ROS הוא להסתכל על התוצאות הסופיות על ידי גילוי חמצון של חלבונים. ואכן, ROS לשנות גלוטתיון, נוגד חמצון זה בא לידי ביטוי ברוב התאים יש תפקיד מגן מפני ROS. בעקבות חמצון על ידי ROS, שינוי של הקטינה גלוטתיון (GSH) תוצאות בקבוצה (תיאול) sulfhydryl של ציסטאין היותו קשור גלוטתיון שנייה באמצעות גשר דיסולפיד. הדבר מוביל להיווצרות חלבון dimerized (GSSG חלבון חמצון). GSH ניתן לשחזר באמצעות שינוי של GSSG ידי רדוקטאז גלוטאתיון. הגידול יחס GSSG / GSH משקף סטרס חמצוני. Assay הבא מבוסס על זיהוי וכימות של החלבונים האלה חמצון. שיטה זו אינה סלקטיבית עבור ROS ספציפי אלא מזהה את ההשפעות של NO, H 2 O 2, O 2 ו - ROS אחרים. כאן אנו למדוד את הכמות הכוללת של חמצון (GSSG) ו מופחת (GSH) גלוטתיון באמצעות אותות bioluminescent. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים התאים בצלחת 96 באר (לבן / שקוף, תחתית שטוחה) כרגיל. לצורך ניסוי זה, השתמשנו 1x10 4 תאים לכל היטב חסיד 264.7 ו A549 תאים גלם Jurkat תאים ההשעיה. בהתאם לגודל של התאים שלך מספרים אלה יכולים להיות מותאמים. אנו ממליצים לתאי צלחת חסיד יום לפני המבחן כדי לאפשר להם לצרף את הצלחת. מספיק בארות צריכים להיות מוכנים לגילוי חלבון חמצון מופחתת, כמו גם עבור "רק בינוני" ובתאים שלא טופלו כפי שולטת. השתמש triplicates כל התנאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים שלך עם התרופה שלך בפעם הנדרש. כאן התייחסנו תאים Jurkat ו A549 תאים 1h עם H 2 O 2 (ב 5mm ו 2.5mm בהתאמה). Raw 264.7 תאים שטופלו 200ng/ml של LPS עבור 16 ח במהלך תקופה זו הדגירה, להביא את כל ריאגנטים שלך לטמפרטורת החדר (RT). הפוך את כל ריאגנטים לא יותר מ 30 דקות לפני ביצוע הבדיקה. הטבלה שלהלן מציגה את הכרכים של ריאגנטים לכל טוב. במידת האפשר, חשוב להסיר את המדיה שמכילה את סוכן הפחתת לפני שתמשיך הבדיקה. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2"> חסיד תאים </td><td colspan="2"> השעיה תאים </td></tr><tr><td> תמוגה סך Glu </td><td> חמצון Glu תמוגה </td><td> תמוגה סך Glu </td><td> חמצון Glu תמוגה </td></tr><tr><td> Nem, 25mm </td><td> אף אחד </td><td> 0.5μl </td><td> אף אחד </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Luciferin-NT </td><td> 1 μl </td><td> 1 μl </td><td> 1 μl </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> מאגר תמוגה פסיבי, 5X </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> מים מזוקקים </td><td> 39.0μl </td><td> 38.5μl </td><td> 14μl </td><td> 13.5μl </td></tr><tr><td> נפח סופי לכל טוב </td><td> 50μl </td><td> 50μl </td><td> 25μl </td><td> 25μl </td></tr></tbody></table><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מבארות עם תאים חסיד. אל תסיר בינוני בבארות עם תאים ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מופחת מגיב תמוגה גלוטתיון מחומצן או תמוגה מגיב גלוטתיון את בארות המתאים וללחוץ במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מגיב הדור Luciferin ו incubatדואר במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מגיב איתור Luciferin ו דגירה במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את האות bioluminescent בזמן שילוב של שנייה 0.25-1 דולר היטב באמצעות luminometer הקורא צלחת. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> חסיד תאים </td><td> השעיה תאים </td></tr><tr><td> מספר נייד לכל טוב </td><td> 1x10 4 </td><td> 1x10 4 </td></tr><tr><td> תא השעיה לכל תרופה + טוב </td><td> 100 μl, יש להסיר לפני 3.4 </td><td> 25μl, לא יוסר </td></tr><tr><td> מגיב גלוטתיון מופחתת תמוגה </td><td> 50 μl </td><td> 25μl </td></tr><tr><td> גלוטתיון מחומצן תמוגה מגיב </td><td> 50 μl </td><td> 25μl </td></tr><tr><td> Luciferin מגיב דור </td><td> 50 μl </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> Luciferin מגיב איתור </td><td> 100 μl </td><td> 100 μl </td></tr></tbody></table> 4. נציג תוצאות: <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 איתור של ROS באמצעות carboxy-H2DCFDA לצבוע. תאים Jurkat (קו אנושי תא לוקמיה) שטופלו עם H 2 O 2 הושוו לא טופלו התאים. ROS גורם שינוי של carboxy-H 2 DCFDA כי מאיר ירוק כפי שזוהו על ידי cytometry זרימה, השיא ניאון H 2 O 2 תאים שטופלו שינוי לעומת הפסגות שולטת (H 2 O 2 תאים שטופלו מוכתמים בצבע חמצון לא רגיש ולא שטופלו בתאים מוכתם carboxy-H 2 DCFDA). תוצאות לאשר את קיומו של ROS בתאים שטופלו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2 איתור oו NO באמצעות ריאגנטים Griess. RAW 264.7 תאים (עכבר macrophage) טופלו LPS ו - IL-4. עלייה משמעותית בייצור NO זוהה בתאים שטופלו לעומת שליטה בתאים שלא טופלו. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שורות תאים </td><td> ללא טיפול </td><td> המטופלים </td></tr><tr><td> Raw 264.7 </td><td> 13.0 </td><td> 8.3 </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 21.6 </td><td> 10.5 </td></tr><tr><td> Jurkat </td><td> 5.2 </td><td> 2.8 </td></tr></tbody></table> לוח 1: איתור של ROS בתיווך חמצון של חלבונים. RAW 264.7 תאים שטופלו LPS, Jurkat ו A549 (סרטן ריאה אנושית) תאים שטופלו H 2 O 2. תוצאות מבוטאות כיחס מופחת (GSH) / חמצון (GSSG) גלוטתיון. יחס נמוך של גלוטתיון (GSH) / (GSSG) התגלו תאים שטופלו לעומתשליטה בתאים שלא טופלו, חושף כי חלבונים היו מתחמצן יותר בתאים שטופלו.

<ol><li>Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+superoxide+in+inflammation+and+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation.</a> J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).</li>
<li>Perl, A., Gergely, P., Banki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+T+cells+of+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus.</a> Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).</li>
<li>Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CD4+D3-D4+membrane+proximal+extracellular+domain+for+the+inhibitory+effect+of+oxidative+stress+on+activation-induced+CD4+down-regulation+and+its+possible+role+for+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation.</a> Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).</li>
<li>Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+as+a+potent+activator+of+T+lymphocyte+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions.</a> Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).</li>
<li>Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cell+adhesion+molecule+1+%28VCAM-1%29+activation+of+endothelial+cell+matrix+metalloproteinases%3A+role+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species.</a> Blood. 104, 2385-2393 (2004).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).</li>
<li>Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+kinase+activity+and+gene+expression+by+reactive+oxygen+species+and+their+role+in+vascular+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).</li>
<li>Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+enhance+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity.</a> Cell Metab. 10, 260-272 (2009).</li>
<li>Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+paradox%3A+insulin+action+is+facilitated+by+insulin-stimulated+reactive+oxygen+species+with+multiple+potential+signaling+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets.</a> Diabetes. 54, 311-321 (2005).</li>
</ol>

קיבלנו את התמיכה של Promega לפרסום זה.

במצבים פתולוגיים אחדים כגון מחלות, סרטן דלקתיות, איסכמיה / reperfusion, גם טיפולים כגון קרינה או כימותרפיה (ציספלטין למשל) לעורר ייצור יתר ROS. לפיכך, גילוי מדידת רמות ROS חשוב רבים, מחקרים בסיסיים טרום קליניים וקליניים. עם זאת, ROS יש מחצית חיים קצר מאוד יכול להיות מסובך לזהות. כאן, אנו מציעים בדיקות פשוטות המשמשות באופן שגרתי ומקובל לצורך זיהוי של ייצור רדיקלים חופשיים בתאי יונקים. פרוטוקולי זיהוי באמצעות צבעים...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> 5 - (ו -6), carboxy-2 &quot;, 7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> C369 </td><td> שליטה </td></tr><tr><td> carboxy-H 2 DCFDA </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> C400 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfanilamide </td><td> סיגמא </td><td> S9251-100 גרם </td><td></td></tr><tr><td> N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride </td><td> סיגמא </td><td> N9125-10G </td><td></td></tr><tr><td> ניטריט תקן </td><td> סיגמא </td><td> 237,213, 100 גרם </td><td></td></tr><tr><td> GSH / GSSG זוהרים Assay </td><td> Promega </td><td> V6612 </td><td> כדי לכמת חמצון, או חמצון מופחתת / מופחת גלוטתיון </td></tr></tbody>
</table>

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ros) סרטן

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

מינים החמצן מגיב לכלול מספר מולקולות DNA ו-RNA נזק ו לחמצן חלבונים ושומנים (peroxydation שומנים בדם). אלה מכילים מולקולות חמצן כוללים H 2 O 2 (מי חמצן), NO (תחמוצת החנקן), O 2 - (אניון תחמוצת), peroxynitrite (ONOO -), חומצה hydrochlorous (HOCl), ו רדיקלי הידרוקסיל (OH -) . מינים חמצוני מיוצרים לא רק תחת מצבים פתולוגיים (סרטן, reperfusion איסכמי /, מחלות נוירולוגיות לב וכלי דם, מחלות זיהומיות, מחלות דלקתיות 1, מחלות אוטואימוניות 2, וכו ...) אלא גם במצבים פיזיולוגיים (לא פתולוגי) כגון חילוף החומרים התאי 3 , 4. ואכן, ROS ממלאים תפקידים חשובים רבים מסלולי איתות תאיים (התפשטות, הפעלת תא 5, 6, 7 הגירה וכו &#39;.). ROS יכול להיות מזיק (זה נקרא אז בשם&quot;סטרס חמצוני nitrosative&quot;) כאשר מיוצר בכמויות גבוהות של תאים תאים תאיים בדרך כלל להגיב על ידי ROS upregulating נוגדי חמצון כגון superoxide dismutase (SOD) ו Catalase (CAT), peroxidase גלוטתיון (GPX) ו גלוטתיון (GSH) המגן אותם רדיקלים חופשיים על ידי המרת מסוכן מולקולות מזיקות (כלומר מים). ויטמינים C ו-E יש גם כמתואר נבלות ROS (נוגדי חמצון). רדיקלים חופשיים הם מועילים סכומים נמוכים 3. Macrophage ו נויטרופילים בתיווך תגובות חיסוניות לערב את ייצור שחרור NO, אשר מעכב וירוסים, פתוגנים התפשטות הגידול 8. NO גם מגיב עם ROS אחרים ולכן, יש גם תפקיד כמו detoxifier (נבלות ROS). לבסוף NO פועלת על כלי לווסת את זרימת הדם שהינה חשובה ההסתגלות של השריר לממש ממושכת 9, 10. פרסומים אחדים הראו גם כי ROS מעורבים Sens אינסוליןitivity 11, 12. שיטות רבות להעריך ייצור ROS זמינים. במאמר זה אנו מציעים מבחני פשוט, מהיר, וזול מספר: מבחני הללו אומתו על ידי פרסומים רבים משמשים באופן שגרתי כדי לזהות ROS או השפעותיו בתאי יונקים. בעוד שחלק מבחני אלה לזהות ROS מרובים, אחרים לזהות רק ROS יחיד.

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות כדי לבחון ולהעריך את הנוכחות של מינים חמצן תגובתי בתאים.

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

מיני חמצן ריאקטיביים כוללים מספר מולקולות הגורמות לנזק ל-DNA ול-RNA ומחמצנות חלבונים ושומנים (פרי-חמצון של ליפידים). מיני ריאקטיביים אלו...

מטרת ניסוי זה היא לזהות את נוכחותם של מיני חמצן רב-פעילים בתרביתי תאים. זאת על ידי זיהוי ראשוני של מיני חמצן רב-פעילים באמצעות צבע פלואורסצנטי, ולאחר מכן, מדידת רמות תחמוצת החנקן בתאים באמצעות בדיקה קולורימטרית.לבסוף, השפעתם של מיני חמצן רגיבי-תגובה (reactive oxygen species) נקבעת על ידי זיהוי רדוקציה או חמצון של גלוטתיון באמצעות בדיקה לומניסנטית. שמי דנו. אני דוקטורנט במעבדה של פטריציה יודה, ואני אדגים את ההליך הזה.Carboxy H 2D CFDA אינו פלואורסצנטי, אך בנוכחות מיני חמצן רגיביים (ROS), ריאגנט זה עובר חמצון ופולט פלואורסצנציה ירוקה מיד לפני השימוש. הכין תמיסת מלאי טרייה של carboxy H 2D CFDA ב-DMSO סטרילי או ב-100% ethanol. שטוף את התאים בתמיסת מלחים מתוכננת ב-HEPs או בתמיסת סליין פוספטית (PBS) כדי להסיר שאריות של המצע המקורי.בבדיקה זו, אנו משתמשים בקו תאי הלוקמיה האנושית jerk cat. לאחר סבוב במערך צנטריפוגה, יש להשליך את הנוזל העליון (supernatant), להטעין את התאים בצבע בריכוז סופי של 1 µM במצע גידול רגיל עם סרום מופחת, ולהדגיר את התרביות למשך 30 דקות בחושך באינקובטור רגיל; יש להשליך כל תמיסת צבע שאינה בשימוש. לאחר מכן, יש להסיר את המצע המכיל Carbox CH 2D CFDA ולשטוף את התאים פעמיים עם HBSS או PBS.העבירו את התאים לפלטה, ומהשלב הזה ואילך, הגנו על התאים מאור. לאחר מכן, הוסיפו מצע טרי ה

production-and-detection-of-reactive-oxygen-species-ros-in-cancers

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון וידאו זה מתאר את הפרוטוקול לזיהוי מיני חמצן תגובתי תאי כולל (ROS) באמצעות 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). שיטה זו מסייעת להמחיש לוקליזציה של ROS בתאים הדבקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת עוד יותר את עוצמת ROS באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים.

זיהוי ROS עם צביעת DCFH-DA: מדידת סך ROS בקווי תאים סרטניים במעי הגס

ROS תאיים הוכח לשחק תפקיד חשוב אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית הסלולר. כאן, אנו מתארים וזמינותו רגיש לכימות תנועת ROS רמות במהלך הזדקנות ביולוגית הסלולר. אנו מספקים גם פרוטוקולים להערכת את הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ, אשר תורמת הדיווחים תפקוד שונות הקשורות לגיל.

מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

אנו מתארים יישום לא פולשנית ויוו הדמיה פרוטוקול מאופין בעיצוב חסכוני, ניצול L-012, chemiluminescent הלומינול-אנלוגי, כדי להמחיש ולכמת מינים חמצן תגובתי (ROS) שנוצר במודל של עכברים excisional פצע.

אין ויוו הדמיה של מינים חמצן תגובתי ב מאתר פצע מודל

מחקר זה מדגים את השימוש cytometry זרימה כדי לזהות החמצן מגיב מינים (ROS) ייצור הנובע הפעלת FcγR. בשיטה זו ניתן להעריך שינויים מיקרוביאלית, חמצון-חיזור איתות הפונקציה של phagocytes בתגובה מכלולים חיסוניים, מיקרואורגניזמים opsonized או ישירות FcγR cross-linking.

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

אנו מתארים שיטה עבור שימוש בזרימה רב פרמטרים cy, לנסות לזהות מיני מיטוכונדריאלי מינים חמצן (ROS) ב מורטין גזע בריא המטבית ובתאי מחולל (HSPCs) ותאי לוקמיה ממודל העכבר של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מונע על ידי MLL-AF9.

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.

גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

מטרת פרוטוקול זה היא לגרום לייצור חולף in vivo של רמות לא קטלניות של מיני חמצן תגובתי (ROS) בעור העכבר, ולקדם עוד יותר תגובות פיזיולוגיות ברקמה.

גירוי נישות תאי גזע והתחדשות רקמות בעור עכבר על ידי פוטוגנרציה תלוית פרוטופורפירין IX ניתנת להחלפה של מיני חמצן תגובתי באתרם

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי אפופלסטי (ROS) ברקמות אורז בתגובה חיסונית מולקולרית המופעלת על ידי תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגן. שיטה זו פשוטה, סטנדרטית ומייצרת תוצאות הניתנות לשחזור בתנאים מבוקרים.

זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית לכימות מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) באמצעות דיהידרואתידיום (DHE) כבדיקת צבע פלואורסצנטי באמצעות גישת סינון בתפוקה גבוהה. הפרוטוקול מתאר את השיטות להערכה כמותית של מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) בשלושת קווי תאי הקרצינומה ההפטוצלולרית השונים.

הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) באמצעות צבע פלואורסצנטי Dihydroethidium (DHE)

למדו לזהות מינים חמצן תגובתי בתרביות תאים באמצעות צבענים פלואורסצנטיים, מבחני צבע וזוהר. שיטות אלו מאפשרות הערכת מתח חמצוני ומדידת רמות חנקן חמצני בביולוגיה תאית.

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

גלה סרטונים נוספים