בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור מבני רקמה בתלת-ממד מתאי מצוברי וממטריקס שמקורו בתאים, שניתן להשתמש בהם לצורך אנליזה פונקציונלית. הדבר מושג תחילה על ידי כרסום תבנית פוליקרבונט ליצירת בארות טבעתיות בעלות תחתית עגולה. לאחר מכן, יוצקת פולי-דימתיל-סילוקסאן או PDMS על תבנית הפוליקרבונט כדי ליצור תבנית עבודה.

לאחר מכן משתמשים בתבנית ה-PDMS ליצירת בארות aros. השלב הסופי הוא זריעת תאים לתוך בארות ה-aros כדי לאפשר להם להתרכז וליצור טבעות רקמה לכידות. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להשיג הרכבה עצמית של תאים והנדסת רקמות באמצעות סוגי תאים שונים, והיא מאפשרת ניתוח של תרומת התאים והמטריצה החוץ-תאית הנגזרת מהם למבנה הרקמה ולתפקודה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני גישות אחרות להנדסת רקמות הוא היכולת לייצר מבני רקמה המורכבים כולבם מתאים ומהמטריצה החוץ-תאית שהם מייצרים במהירות רבה יותר ממה שדווח בעבר, ובפורמט המאפשר ניתוח מכני. התחילו בעיבוד של חתיכת פוליקרבונט בעובי של half inch כדי ליצור 15 בארות טבעתיות בעלות תחתית עגולה עם קוטר עמוד מרכזי של 2 mm. נקו את תבנית הפוליקרבונט כדי להסיר שאריות פלסטיק שנוצרו בתהליך העיבוד והניחו לתבנית להתייבש. לאחר מכן, ערבבו PDMS ביחס של 10 ל-1 של בסיס לסוכן דהייה (curing agent). בצעו ניקוון (Degas) לתמיסה כדי להסיר את כל בועות האוויר ולאחר מכן צקו אותה אל תוך תבנית הפוליקרבונט.

לאחר מכן, בצעו שוב ניקוון של התערובת על התבנית כדי להסיר בועות אוויר שנותרו, והקשו את ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך ארבע שעות; בזמן שה-PDMS מקשה, המיסו 2% AROS ב-DMEM. לאחר ההקשיה, הסירו בזהירות את תבנית ה-PDMS על ידי קילוף איטי מהפוליקרבונט, לאחר מכן שטפו את ה-PDMS במים וסבון ועקרו אותו באוטוקלאב יחד עם תמיסת ה-DMEM AROS. כעת, הניחו את תבנית ה-PDMS שעברה עיקור על משטח ישר ומלאו אותה ב-AROS מותך, תחילה על ידי הזרקת AROS לתוך כל אחת מתבניות העמודים המרכזיים, ולאחר מכן על ידי הזרקת AROS לחלל שסביבם.

המתינו שה-aros יתמצקו למשך כ-15 דקות. לאחר מכן, הפכו את התבנית כדי לשחרר את ה-aros מה-PDMS. גזרו את עודפי ה-aros מסביב לכל אחת מהבארות, ולאחר מכן הניחו בארת aros אחת בכל בארה של פלטת 12 בארות.

הוסיפו מצע גידול תאים מסביב לבאר ה-aros מבלי לכסות את חלקו העליון של הבאר. לאחר מכן, הכניסו את הצלחות לאינקובטור כדי לאפשר להן להגיע לשיווי משקל בזמן שהתאים מוכנים. כאשר התאים מגיעים ל-90% confluence, בצעו trypsinization לתאי שריר חלקים מעורק הראשי של חולדה וביצעו resus.

יש להשהות את התאים בריכוז של 5×10⁶ תאים למיליליטר. לאחר מכן, יש להעביר בפיפט 100 µL מתליון התאים המושהים לכל אחת מבארות ה-aros שהגיעו לשיווי משקל. יש להפיץ את התאים בכל אחת מהבארות באמצעות תנועה סיבובית.

הניחו את הצלחות באינקובטור למשך 24 שעות ללא הפרעה. החליפו את המצע מדי יומיים על ידי שאיבת המצע מסביב לבאר ולאחר מכן מילוי מחדש של כל באר עד לתבנית ה-aros תהיה שקועה לחלוטין. ובסיום התרבית, מלאו צלחת פטרי קטנה ב-PBS.

הוצאו כל טבעת מתבנית ה-aros על ידי החלקתה מעל העמוד המרכזי. הניחו את הטבעות בצלחות פטרי עם PBS Center, וטבעת אחת תחת מערכת הדימות הדיגיטלית. השתמשו בתוכנה לזיהוי קצוות (edge detection) כדי למדוד את עובי הטבעת בארבע נקודות: למעלה, למטה, משמאל ומימין לאורך היקפה.

לביצוע בדיקת מתיחה חד-צירית. רכבו דגימה בצורת טבעת על שתי תופסני חוט דקים. מתחו את התופסנים עד להפעלת עומס קריעה של 5 mN על הטבעת.

לאחר מכן, הזן את שטח החתך שחושב ממדידות העובי ורשום את אורך המדידה. בצע שמונה מחזורי טעינה מוקדמים (pre-cycle) לטבעת בין עומס הקריעה ל-50 kilo pascal. הפעל מאמץ בקצב של 10 millimeters per minute; לאחר מחזור הטעינה המוקדם השמיני, משוך עד לכשל בקצב של 10 millimeters per minute.

עבור כל טבעת, מדדו את מאמץ המתיחה הסופי (ultimate tensile stress) ואת מאמץ הכשל (failure strain), וחשבו את מודול המשיק המקסימלי מתוך הנתונים שהתקבלו. בנוסף למחקרים תפקודיים in vitro, טבעות תאים חיים אלו יכולות להתמזג כדי ליצור צינורות רקמה. השתמשו במספריים כירורגיים כדי לחתוך את קצות צינורות הסיליקון בזווית ליצירת קצוות אלכסוניים, ולאחר מכן עקרו את צינורות הסיליקון באוטוקלאב.

מלאו צלחת פטרי במצע, העבירו מחזיקי צינורות סיליקון מותאמים שעברו סטריליזציה לקללת בטיחות ביולוגית והניחו אותם בצלחת פטרי ריקה. לאחר מכן, הסירו את הטבעות מבארות ה-aros והניחו אותן בצלחת הפטרי המלאה במצע. הניחו את צינורות הסיליקון באותה צלחת פטרי כדי להרטיבם לפני השימוש.

השתמשו בפינצטה כדי להניח את קצהו של צינור סיליקון במרכז טבעת, והחליקו בעדינות את הטבעת על צינור הסיליקון. החליקו את הטבעות כך שיהיו במגע אחת עם השנייה על ידי דחיפה עדינה ורצופה של הטבעות בשני הכיוונים לאורך הצינור. לאחר הרכבת הטבעות, יישרו את צינורות הסיליקון בתוך מחזיקי הפוליקרבונט והבריגו את שני חלקי המחזיק זה לזה.

הוסיפו 55 milliliters של מצע לצלחת הפטרי. החליפו את המצע מדי שלושה ימים לאורך תקופת התרבית כדי להסיר את צינורות הרקמה. ראשית, מלאו צלחת פטרי ב-PBS.

לאחר מכן שחררו את צינורות הסיליקון מהתושבת מפוליקרבונט והשתמשו בפינצטה כדי להחליק את צינורות הרקמה מהצינור הסיליקוני אל תוך הצלחת. כאשר הפעולה מבוצעת נכונה, התאים שוקעים בתחתית בארי הבארים ומתכווצים בתוך 24 שעות לאחר ההנחה כדי ליצור טבעת רקמה סביב העמוד המרכזי בבאר ה-Agarro; זהו גרף מייצג של עקומת מאמץ-מעיכה שהתקבלה מבדיקת מתיחה חד-צירית של טבעת רקמה בעובי שני מילימטרים שנוצרה מתאי שריר חלק של חולדה. ערכי חוזק המתיחה הסופי, מודול המתיחה המקסימלי ומעטפת הכשל משמשים לאחר מכן להשוואת התכונות המכניות של דגימות טבעות רקמה שגודלו תחת פרמטרי תרבית שונים.

ניתן לשלוט בתכונות המכניות של טבעות רקמה על ידי שינוי פרמטרי התרבית, כולל מספר התאים שהוחדרו, משך התרבית, תוצר המוצרי של התרבית וסוג התאים שנעשה בהם שימוש. בנוסף לתאי שריר חלק של חולדה, תאי שריר חלק ראשוניים של בן אדם יוצרים טבעות רקמה בעלות חוזק מתיחה דומה.

תאי גזע מזנכימליים אנושיים נוטים גם הם להתרכז ולהיווצר כטבעות, אך הם לא היו חזקים מספיק עבור בדיקות מכניות. המערכת שלנו מאפשרת ייצור של מבני רקמה מהונדסים המורכבים כולם מתאים, פשוט על ידי זריעת תאים בתוך בארות ה-aros המותאמות שלנו. לאחר עיבוד התבנית הראשונית מפוליקרבונט, אנו יכולים לייצר מספר בלתי מוגבל של תבניות PDMS שניתן להשתמש בהן להכנת התבניות, כך שאין צורך בציוד נוסף.

המערכת היא ורסטילית, שכן השתמשנו במספר סוגי תאים שונים במערכת ליצירת טבעות רקמה, ולכן ניתן להשתמש במערכת זו פוטנציאלית הן ליישומים של הנדסת רקמות והן למחקרים in vitro של תרומת התאים והמטריקס החוך-תאי למבנה ולתפקוד של הרקמה.