בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מבני רקמה תלת מימדיים מתאים מצטברים ומטריצה שמקורה בתאים שניתן להשתמש בהם לניתוח פונקציונלי. זה מושג על ידי כרסום ראשון של תבנית פוליקרבונט ליצירת בארות טבעתיות עם תחתית עגולה. לאחר מכן, פולי דימתיל סלואן או PDMS יצוק על תבנית הפוליקרבונט ליצירת תבנית.

לאחר מכן תבנית ה-PDMS משמשת ליצירת בארות ארוס. השלב האחרון הוא לזרוע תאים לבארות ארוס כדי לאפשר להם להצטבר וליצור טבעות רקמה מלוכדות. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו להשגת הרכבה עצמית תאית והנדסת רקמות באמצעות סוגי תאים שונים, ומאפשרת ניתוח של תרומת התאים והמטריצה החוץ-תאית שמקורה בתאים למבנה הרקמה ולתפקודה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני גישות אחרות של הנדסת רקמות הוא שאנו יכולים לייצר מבני רקמות לחלוטין מהתאים ומהמטריצה החוץ-תאית שהם מייצרים מהר יותר ממה שדווח בעבר, ובפורמט התורם לניתוח מכני, התחל על ידי כרסום חתיכת פוליקרבונט בעובי חצי סנטימטר ליצירת 15 בארות טבעתיות עגולות עם תחתית בקוטר עמוד מרכזי של שני מילימטרים. נקה את תבנית הפוליקרבונט כדי להסיר כל פסולת פלסטיק שנוצרה מתהליך הטחינה ותן לתבנית להתייבש. לאחר מכן, ערבבו PDMS ביחס של 10 לאחד של חומר ריפוי בסיס, Degas את התמיסה כדי להסיר את כל בועות האוויר ולאחר מכן שפכו אותה לתבנית הפוליקרבונט.

לאחר מכן הסר שוב את התערובת על התבנית כדי להסיר את כל בועות האוויר שנותרו ולרפא את ה-PDMS בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות בזמן שה-PDMS מתרפא מתמוסס. 2% AROS ב-DMEM לאחר ריפוי הסר בזהירות את תבנית ה-PDMS על ידי קילוף איטי מהפוליקרבונט, ולאחר מכן שטוף את ה-PDMS במים וסבון וחיטוי אותו יחד עם תמיסת ה-DMEM AROS. כעת הניחו את תבנית ה-PDMS של החיטוי על משטח ישר ומלאו אותה בארוס מותך על ידי פיפטינג ארוס לכל אחת מתבניות העמוד המרכזיות, ולאחר מכן על ידי פיפטינג ארוס לחלל סביבם.

הניחו לארוס להתמצק במשך כרבע שעה. לאחר מכן הפוך את התבנית כדי לשחרר את ה-aros מה-PDMS. חותכים את עודפי הארוס מסביב לכל אחת מהבארות, ואז מניחים היטב ארוס אחד לכל באר של צלחת 12 בארות. כעת.

הוסף אמצעי תרבית תאים סביב החלק החיצוני של באר הארוס מבלי לכסות את החלק העליון של הבאר. לאחר מכן הכניסו את הצלחות לחממה כדי לאפשר להן להתייצב בזמן הכנת התאים. במפגש של 90% טריפסין, תאי שריר חלק של אבי העורקים של חולדה והחייאה שלהם.

השעו את התאים בריכוז של חמישה פעמים 10 לששת התאים למיליליטר. לאחר מכן פיפטה 100 מיקרוליטר של תרחיף התא התלוי לכל אחת מבארות הארוס המאוזנות. שימוש בתנועה מעגלית כדי להחיל את התאים על כל אחת מהבארות.

מניחים את הצלחות בחממה לשבת ללא הפרעה למשך 24 שעות. החלף את המדיום כל יומיים על ידי שאיבת המדיה מסביב לבאר ולאחר מכן מילוי מחדש של כל באר עד שתבנית הארוס שקועה לחלוטין. ובסיום התרבות, מלאו צלחת פטרי קטנה ב- PBS.

הסר כל טבעת מתבנית הארוס שלה על ידי החלקתה מעל החלק העליון של העמוד המרכזי. הנח את הטבעות בצלחות פטרי עם PBS Center, טבעת מתחת למערכת ההדמיה הדיגיטלית. השתמש בתוכנת זיהוי קצוות כדי למדוד את עובי הטבעת בארבעה מצבים, למעלה, למטה, שמאל וימין סביב היקףה.

לביצוע בדיקת מתיחה חד צירית. הרכיב דגימת טבעת על שתי אחיזות תיל דקות. הארך את האחיזה עד להפעלת עומס קרע של חמישה מילי-ניוטון על הטבעת.

לאחר מכן הזן את שטח החתך המחושב ממדידות העובי ורשום את אורך המד. מחזור מראש את הטבעת שמונה פעמים בין עומס הדמעות ל-50 קילו פסקל. מתח בקצב של 10 מילימטרים לדקה לאחר המחזור השמיני המקדים נמשך לכישלון ב -10 מילימטרים לדקה.

עבור כל טבעת, מדוד את מתח המתיחה האולטימטיבי ומתח הכשל וחשב את מודול המשיק המרבי מהנתונים שנרכשו. בנוסף למחקרי מבחנה פונקציונליים, טבעות התאים החיים הללו יכולות גם להתמזג ליצירת צינורות רקמה. השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את קצות צינורות הסיליקון בזווית כדי ליצור קצוות משופעים ולאחר מכן חיטוי צינורות הסיליקון בזמן שהצינורות עוברים חיטוי.

ממלאים צלחת פטרי בהעברת מדיה מחזיקי צינורות סיליקון מותאמים אישית מעוקרים לארון בטיחות ביולוגית ומניחים בצלחת פטרי ריקה. לאחר מכן, הוציאו את הטבעות מבארות הארוס והניחו אותן בצלחת הפטרי המלאה במדיה. מניחים את צינורות הסיליקון באותה צלחת פטרי כדי להרטיב אותם לפני השימוש.

השתמש במלקחיים כדי למקם את קצה צינור הסיליקון במרכז הטבעת והחלק בעדינות את הטבעת על צינור הסיליקון. החלק את הטבעות למגע אחת עם השנייה על ידי דחיפתן בעדינות ברציפות לשני הכיוונים לאורך הצינור. לאחר הרכבת הטבעות, יישר צינורות סיליקון בתוך מחזיקי הפוליקרבונט והברג את שני חלקי המחזיק יחד.

הוסף 55 מיליליטר מדיה לצלחת הפטרי. החלף את המדיה כל שלושה ימים למשך התרבית כדי להסיר את צינורות הרקמה. ראשית, מלאו צלחת פטרי ב-PBS.

לאחר מכן שחרר את צינורות הסיליקון ממחזיק הפוליקרבונט והשתמש במלקחיים כדי להחליק את צינורות הרקמה מצינור הסיליקון לתוך הצלחת. כאשר מבוצעים כהלכה, התאים מתיישבים בתחתית בארות הארוס ומתכווצים תוך 24 שעות לאחר הישיבה כדי ליצור טבעת רקמה סביב העמוד המרכזי בבאר של אגרו, זוהי עלילה מייצגת של עקומת מתח מתח המתקבלת מבדיקת מתיחה חד צירית של טבעת רקמה של שני מילימטר שנוצרה מתאי שריר חלק של חולדה. לאחר מכן משתמשים בחוזק המתיחה האולטימטיבי, מודול המתיחה המרבי וערכי מתח הכשל כדי להשוות את התכונות המכניות של דגימות טבעת רקמה הגדלות תחת פרמטרים שונים של תרבית.

ניתן לשלוט בתכונות המכניות של טבעות רקמה על ידי שינוי פרמטרי תרבית, כולל מספר מושב התאים, אורך התרבית, מדיום התרבות וסוג התא בו נעשה שימוש. בנוסף לתאי שריר חלקים של חולדה. תאי שריר ראשוניים וחלקים אנושיים יוצרים טבעות רקמה בעלות חוזק מתיחה דומה.

תאי גזע מזנכימליים אנושיים מצטברים גם הם ליצירת טבעות, אך הם לא היו חזקים מספיק לבדיקה מכנית. המערכת שלנו מאפשרת ייצור של מבני רקמה מהונדסים לחלוטין מתאים פשוט על ידי זריעת תאים לבארות הארוס המותאמות אישית שלנו. לאחר עיבוד תבנית הפוליקרבונט הראשונית, נוכל ליצור מספר בלתי מוגבל של תבניות PDMS שלאחר מכן ניתן להשתמש בהן לייצור התבניות כך שאין צורך בציוד נוסף.

המערכת רב-תכליתית בכך שהשתמשנו במספר סוגי תאים שונים במערכת כדי ליצור טבעות רקמה, ולכן מערכת זו יכולה לשמש הן ליישומים של הנדסת רקמות והן למחקרי מבחנה של תרומות התאים והמטריצה החוץ-תאית למבנה הרקמה ולתפקודה.