Name: בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: חקור שיטה ליצירת טבעות רקמות תלת-ממדיות מתאי שריר חלק באמצעות הרכבה עצמית בתבניות אגרוז. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביומכני של תרומת התאים והמטריצה החוץ-תאית למבנה הרקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים בתודה ניל Whitehouse (WPI, חנות היגינס Machine) על עזרתו עם מכונות CNC. בנוסף, אנו רוצים להודות אדריאנה הרה (WPI מחשוב ותקשורת מרכז) על עזרתה עם MATLAB תכנות, כמו גם קייט ומשקאות ויוסף Cotnoir (WPI האקדמית Technology Center) לקבלת סיוע עם Camtasia. סופי בורק Jacleen בקר (WPI האקדמית Technology Center) סיפקה קטעי וידאו משלים. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לבריאות (R15 HL097332), את בית הספר לרפואה UMass-WPI מחקר פיילוט יוזמת, איגוד הלב האמריקאי (מלגת מחקר לתואר ראשון JZH), ואת המכון הפוליטכני וורצ&#39;סטר (מחקר לתואר ראשון קיץ לידידות JZH ומוסדיים סטארט כספים MWR).

1. זריעת Cell עובש ייצור בגין על ידי כרסום 1 / 2 "חתיכה עבה של פוליקרבונט כדי ליצור 15, תחתית עגולה, בארות טבעתי בקוטר מרכז שלאחר מ"מ 2. ערוצי הסתובבו הם 6 מ"מ עמוקה 3.75 מ"מ רחב. נקי ויבש את התבנית כדי פוליקרבונט להסיר את כל פסולת הפלסטיק תהליך הטחינה. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) בשעה 10:01 יחס (w / w) בסיס לסוכן ריפוי, דגה כדי להסיר את כל בועות האוויר, ויוצקים על התבנית פוליקרבונט. דגה שוב כדי להסיר בועות הנותרים, ולרפא בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. נרפא פעם, להסיר בזהירות את התבנית על ידי PDMS לאט לקלף אותה הרחק פוליקרבונט, לשטוף עם סבון ומים, החיטוי. כמו כן החיטוי פתרון של שתי אחוזים agarose (w / v) מומס שונה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM). מניחים את התבנית PDMS על משטח ישר ומלא עם האגא מותך עלה על ידי הראשון pipetting agarose לתוך כל אחד תבניות הודעה המרכז, ולאחר מכן pipetting לחלל סביבו. אפשר agarose כדי לבסס (כ 15 דקות), ואז להפוך את התבנית כדי לשחרר את agarose מן PDMS. גזור agarose עודף סביב כל אחת הבארות, והמקום בארות לתוך 12-agarose גם הצלחות. 2. Cell תרבות זריעת טבעת הוסף תרבית תאים מדיה (DMEM עם 10% ו -1% FBS פניצילין, סטרפטומיצין) סביב החלק החיצוני של התבנית agarose, ללא מכסה את החלק העליון של תבניות. מקמי את הצלחות בחממה ולאפשר להם לאזן במשך כ 15 דקות תוך כדי להכין את התאים. באותו מפגש 90%, trypsinize אבי העורקים חולדה חלקה שריר תאים (rSMCs) ו resuspend בריכוז של 5x10 6 תאים / מ"ל. פיפטה 100 μL ההשעיה לתוך תא אחד טבעתי agarose בארות, בתנועות מעגליות כדי להחיל התאים היטב כל אחד. תוכן "&gt; ודא המדפים חממה הן ברמה, אז במקום צלחות בחממה ולאפשר להם לשבת באין מפריע במשך 24 שעות. מדיום חליפין כל יומיים לאחר מכן על ידי aspirating התקשורת מרחבי היטב, מילוי מחדש כל טוב עד agarose גם הוא שקוע לגמרי. 3. טבעת רקמה קציר ומדידות עובי בסיומו של תרבות, להסיר את הטבעת עובש agarose ידי הזזה זה מעל לפרסם את המרכז. מניחים את הטבעת בצלחת פטרי קטנה עם פוספט בופר סליין (PBS), במרכז המדגם, לרכוש תמונה באמצעות מערכת ההדמיה הדיגיטלית. השתמש ניתוח התמונה בתוכנית לאיתור קצה ולמדוד את עובי הטבעת ב 4 עמדות (למעלה, למטה, ימינה ושמאלה) סביב היקפו. חשב את ערך עובי ממוצע (t) עבור כל טבעת הפרט, להשתמש כדי לחשב את ערך שטח חתך(2π (t / 2) 2). 4. בדיקה מכנית של טבעות הגדרת מכונה בדיקות מתיחה (Instron EPS 1000) במצב אופקי. צרף תא 1N ± 1mN לטעון אישית אוחז חוט דק (שנוצר על ידי כיפוף חוט נירוסטה). הר מדגם הטבעת על שני אוחזת חוט דק. הרחבת להתמודד עד עומס 5 mn טרה מוחל על המדגם. הזן את שטח חתך (מחושבים ממדידות עובי) ולהקליט את אורך מד. טרום מחזור טבעות 8 פעמים בין לטעון את טרה ו 50 מתח kPa בשיעור של 10 מ"מ / דקה. לאחר השמיני טרום מחזור, למשוך לכישלון של 10 מ"מ / דקה. כישלון הוא כאמור ירידה בכוח על ידי 40% מן מדידה אחד למשנהו. עבור כל דגימה טבעת, למדוד את הלחץ מתיחה האולטימטיבי (UTS) ומתח כישלון לחשב את המקסימום משיק מודולוס (MTM) מהנתונים רכשה. 5. רקמות כמו טבעתsembly לפברק צינורות רקמה מחזיקי צינור מותאמות אישית במכונה מסיבוב 5 דיסקים ס"מ פוליקרבונט עם מגזרות מלבני (2 ס"מ X 3 ס"מ). לקדוח חורים מושחל דרך דיסקים אלה לאפשר לשני בעלי להידפק יחד. החיטוי בעלי שפופרת אישית, ולאחר מכן להעביר לממשלה biosafety ומניחים צלחת פטרי ריקות. השתמש במספריים כירורגית לחתוך את הקצוות של 1.9 מ"מ קוטר צינורות סיליקון בזווית כדי ליצור שוליים משופעים, ולאחר מכן החיטוי צינורות סיליקון. בעוד צינורות נמצאים autoclaved, למלא צלחת פטרי עם התקשורת. הסר את טבעות מבארות agarose ומניחים אותם בצלחת פטרי עם התקשורת. המקום autoclaved צינורות סיליקון בצלחת פטרי אותו כדי להרטיב אותם לפני השימוש. שימוש במלקחיים למקום בסוף משופעים של שפופרת סיליקון למרכז טבעת בעדינות להחליק את הטבעת על צינורות הסיליקון. חזור עם המספר הרצוי של רימהה. החלק את טבעות במגע אחד עם השני על ידי בעדינות לדחוף אותם ברציפות בשני הכיוונים לאורך הצינור. שיטה זו יכולה לשמש עבור טבעות שנקטפו אחרי יום אחד בלבד בתרבות. ברגע טבעות מורכבים, ליישר צינורות סיליקון בתוך מחזיקי פוליקרבונט בורג שני החלקים של בעל יחד. המקום מחזיק בתוך צלחת פטרי 100 מ"מ ולהוסיף 55 מ"ל התקשורת. שערי המדיה כל 3 ימים למשך תרבות. כדי להסיר את צינורות רקמות, לשחרר את צינורות סיליקון מבעל פוליקרבונט להשתמש במלקחיים כדי להחליק את צינורות רקמה את צינור סיליקון לתוך צלחת פטרי מלאות PBS. 6. נציג תוצאות: כאשר פרוטוקול מבוצע כראוי, מצטבר בתאים ליצירת טבעות רקמה בקוטר פנימי שווה לקוטר של הפוסט את התבנית המתאימה בתוך 24 שעות. קצוות הטבעת הן בדרך כלל חלק במראה (אם culturעורך על משטח ישר), הם אחידים בעובי סביב ההיקף כולו. הטבעות רקמה קל לטפל ניתן להסיר מבארות שלהם לניתוח מכני היסטולוגית לאחר מכן (ראה ב Gwyther et al. 2011 8). טבעת רקמה מורפולוגיה, הרכב מטריצה, תכונות מכניות להשתנות בהתאם למספר וסוג של תאים שנזרעו. תוצאות נציגת טבעות רקמה עשוי סוגי תאים שונים, זריעת התנאים, אורך תרבות מוצגים בלוח 1. שתי טבעות זהות מ"מ שנוצרו 5x10 5 rSMCs הציג UTS גבוה יותר מאשר טבעות שנוצרו שפורסמו בעבר שלנו 2 טבעות מ"מ (עשוי 6.6x10 5 rSMCs). 8 דומים לתאי עכברוש, אדם לתאי שריר חלק (hSMC) בקלות מצטברים כדי ליצור רקמות טבעות, שהכיל כמות גדולה של קולגן רק לאחר 14 ימים בתרבות (מידע לא מוצג). אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) מצטברים גם ויצרו טבעות מלוכדת, אך להחוזק מכני cked ושבר במהלך שלבי precycling הראשוני של בדיקות מתיחה uniaxial. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> תא מספר </td><td> עובי (מ"מ) </td><td> אורך של התרבות (ימים) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> אי זן (מ"מ / מ"מ) </td></tr><tr><td> rSMC טבעות </td><td> 6 </td><td> 660000 </td><td> 0.94 ± 0.12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0.50 ± 0.08 </td></tr><tr><td> rSMC טבעות </td><td> 4 </td><td> 500000 </td><td> 0.53 ± 0.02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0.88 ± 0.05 </td></tr><tr><td> hSMC טבעות </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0.51 ± 0.05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0.92 ± 0.08 </td></tr><tr><td> hMSC טבעות </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0.40 ± 0.07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> טבלה 1. טבלה המציגה את הפרמטרים תרבות תכונות מכניות של 2 מ"מ טבעות שנוצר סוגי תאים שונים, ריכוזי זריעה, ואת משכי תרבות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. (א) סכמטי של תהליך טבעת רקמה דור. (ב) מותאם אישית פוליקרבונט עם עובש בארות טבעתי מחורץ. בקטרים ​​הודעה המרכזית הם 2 מ"מ. (ג) PDMS התבנית לאחר התקלף מן התבנית פוליקרבונט. (ד) טבעת רקמה מצטבר עובש בתרבית agarose עם הודעה של 2 מ"מ. (ה) שני מ"מ רקמה בקוטר הטבעת PBS. ברים סולם = 6 מ"מ (B, C) ו 2 מ"מ (D, E). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. העלילה נציג מתח מתח עקומת produCED מניסוי מתיחה uniaxial.

<ol><li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2011+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).</li>
<li>Gauvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-step+self-assembly+approach+for+the+fabrication+of+tissue-engineered+vascular+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).</li>
<li>L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li>
<li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods%2C+tori%2C+and+honeycombs%3A+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).</li>
<li>Livoti, C. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+and+tissue+fusion+of+toroid-shaped+minimal+building+units%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).</li>
<li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Tissues.+Organs%22%5BJournal%5D)">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).</li>
<li>Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+conditioning+of+collagen-gel+blood+vessel+constructs+induces+remodeling+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro.</a> Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).</li>
<li>Rowe, S. L., Stegemann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+collagen-fibrin+composite+matrices+with+varying+protein+contents+and+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.</a> Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).</li>
<li>Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+triggers+rapid+contraction+and+degradation+of+fibroblast-populated+collagen+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices.</a> J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).</li>
<li>Konig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).</li>
<li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לאחרונה חלה התעניינות מוגברת מבוססי תאים או &quot;פיגום פחות&quot; הנדסת רקמות שיטות כדי לטפל בכמה מגבלות פיגום מבוססי גישות הנדסת רקמות. בהתחשב בכך תאים שמקורם ברקמות נוצרות בתאים המטריצה ​​שהם מייצרים, הם מטבעם מכילים הרבה יותר גבוה צפיפות התא, אינם מכילים חומרים אקסוגניים, והוא יכול להיות עשוי כולו מ תאים חלבונים אנושיים. שתלי כלי דם העשויים תאים אנושיים יכולים להשיג חוזק מכני ניכר בהעדר פיגומים חיצוניים (למשל, לחצים פרץ 3400 מ&quot;מ כספית לעומת 1600 מ&quot;מ כספית עבור ורידים saphenous אדם) 12. למרות מבוססי תאים ורקמות כלי דם התערוכה צפיפות התאים שיפור חוזק מכני, שיטות ייצור העדכניים ביותר (כגון &quot;הנדסה גיליונות מבוסס&quot; 3,4,12 או &quot;bioprinting&quot; 5,13) לדרוש תקופות תרבות ענפה (&gt; 3 חודשים) או ציוד מיוחד לבניית רקמות 3D. תאים שמקורם ברקמה טבעת ספידod המתואר כאן מאפשר מהירות הסלולר הרכבה עצמית ליצירת חזקים בונה רקמת 3D בתוך פרק זמן קצר ללא שימוש בציוד מיוחד. פרוטוקול זה מפרט את ההליך שפיתחנו כדי ליצור 2 מ&quot;מ קוטר פנימי חולדה חלקה שריר תאים שמקורם ברקמה טבעות. בדוגמה הנוכחית, הטבעות היו בתרבית רקמה במשך 7 ימים (בתרבית אז עבור 7 ימים נוספים לאיחוי טבעת היווצרות צינור). עם זאת, 2 עכברוש מ&quot;מ (אדם) וחלק תא טבעות שרירים ניתן להסיר את בארות והם מלוכדת מספיק לטיפול (למשל, על העברת צינורות סיליקון) מוקדם ככל שיום אחד לאחר זריעת התאים. בנוסף, טבעות רקמות חזקים עם קוטר פנימי משתנה (2, 4 ו 6 מ&quot;מ) ניתן ליצור בשיטה זו פשוט על ידי שינוי בקוטר הודעה של עובש פוליקרבונט המקורי. 8 אנחנו גם שונה לאחרונה את עיצוב תבנית פוליקרבונט כדי לאפשר five 2 זריעת מ&quot;מ בארות להיות יצוק יחידה רב גם agarose קאמרית, אשרמשתמשת פחות PDMS ו agarose, ומתאים באחד היטב צלחת 6-באר (מידע לא מוצג). שינויים בקוטר בהודעה, רוחב של זריעת הבאר, רדיוס העקמומיות של התחתון מעוגל, במספר בארות זריעה, או את העומק של בארות זריעת כולם יכולים להיות שונה פשוט על ידי שינוי מפרטים בקובץ ה-CAD עבור CNC עיבוד של עובש פוליקרבונט. לבסוף, עובש יחיד פוליקרבונט יכול לשמש כדי לפברק מספר בלתי מוגבל של תבניות PDMS, וכל תבנית PDMS ניתן לנקות, autoclaved ולעשות בהם שימוש חוזר עשרות פעמים. בנוסף לשינוי גודל הטבעות רקמות, עשינו טבעות מהרבה סוגי תאים שונים, כולל: SMCs עכברוש הראשי (יישומים סלולריים, R354-05), אדם יסודי SMCs לב כלילית (Lonza, CC-2583), האדם העיקרי fibroblasts עורי 11 (מתנה נדיבה של סיכות ד&quot;ר ג&#39;ורג&#39;, WPI המחלקה להנדסה ביורפואית), ריאות fibroblasts חולדה (RFL-6, ATCC CCL-192), וכן בתאי גזע mesenchymal (Lonza, PT-2501). כל אחד מסוגי אגרגטים תא חוזים סביב שנכתבו למרכז כדי ליצור טבעות רקמות; אף ארגון הסלולר, הרכב ECM, תכונות מכניות של מבנים משתנים לכל סוג תא. הפרמטרים זריעת לכל סוג תא צריכה להיקבע באופן אמפירי מבוסס על גודל התאים ואת יכולתם לצבור. לכן, בעוד המערכת של יצירת תאים שמקורם ברקמה טבעות הוא מאוד תכליתי, פרוטוקול ייתכן שיהיה צורך בהתאמות קלות להיווצרות רקמת אופטימלי עם סוגי תאים שונים. טבעת הגיאומטריה רקמה מקלה טעינת הערכה קלה של תכונות החומר על ידי בדיקת רקמות מתיחה uniaxial, כמתואר. יש גם תקדים משמעותי באמצעות כלי דם מגזרים טבעת למדוד התכווצות כלי הדם ותפקוד פיזיולוגי. מחקרים ראשוניים מצביעים על תאים שמקורם ברקמה טבעות יכול להיות מותקן על מכשיר myograph חוט למדידת היענות תרופתי ודור התכווצות כוח (מידע לא מוצג). בסך הכל, את היכולת לייצר במהירות עצמית התאספו טבעות תא לניתוח היסטולוגית, מכני, פיזיולוגי, ביוכימי ו מציע כלי חדש רב עוצמה זה עשוי להיות שימושי עבור מודלים מבנה רקמות תפקוד כלי הדם ועל בריאות ומחלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th></tr><tr><td> Polydimethylsiloxane (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017-CV </td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td></tr><tr><td> מערכת הדמיה דיגיטלית </td><td> DVT Corporation </td><td> דגם 630 </td></tr><tr><td> בדיקות uniaxial מכונה </td><td> Instron </td><td> E1000 ElectroPuls </td></tr><tr><td> איתור Edge תוכנה </td><td> DVT Corporation </td><td> Framework 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

בכל שנה, מאות אלפי חולים לעבור ניתוח מעקפים בעורק בארצות הברית. 1 כשליש מהחולים הללו אין כלי מתאים התורם עצמיים בשל התקדמות המחלה או הקציר הקודם. מטרתה של הנדסת רקמות כלי דם היא לפתח מקור חלופי מתאים אלה שתלי לעקוף. בנוסף, רקמת כלי דם מהונדסים עשויים להביא תועלת כמו החיים דגמים של כלי הדם כדי לחקור מחלות לב וכלי דם. מספר גישות מבטיחות לכלי הדם הנדסה נחקרו, עם מחקרים עדכניים רבים מתמקדת בפיתוח וניתוח של תא המבוססת על שיטות. 2-5 בזאת, אנו מציגים שיטה במהירות עצמית להרכיב תאים לטבעות רקמה 3D כי ניתן להשתמש במבחנה למודל רקמות כלי דם. כדי לעשות זאת, השעיות של בתאי שריר חלק הם זורעים לתוך עגול תחתית טבעתי agarose בארות. לא דבק המאפיינים של agarose לאפשר הבתאי הדואר להתיישב, המצרפי חוזה סביב לפרסם במרכז היטב כדי ליצור טבעת רקמה מלוכדת. 6,7 טבעות אלה יכולים להיות מתורבת במשך כמה ימים לפני קציר מכני עבור ניתוח, פיזיולוגית ביוכימית או היסטולוגית. הראינו כי אלה תאים שמקורם ברקמה טבעות התשואה על 100-500 כוח kPa האולטימטיבי מתיחה 8 אשר עולה על הערך דיווח על אחרים מהונדסים בונה רקמת כלי דם בתרבית לתקופות דומות (&lt;30 kPa). 9,10 התוצאות שלנו מראות כי תאים חזקים הנגזרות דור וסקולרית טבעת רקמה יכולה להיות מושגת בתוך פרק זמן קצר, והיא מציעה את ההזדמנות להערכה כמותית ישירה של תרומות של תאים תאים שמקורם מטריצה ​​(CDM) על מבנה רקמת תפקוד כלי הדם.

מאמר זה מתאר שיטה צדדי כדי ליצור תאים שמקורם ברקמה טבעות על ידי הרכבה עצמית הסלולר. לתאי שריר חלק seeded לתוך בצורת טבעת המצרפי בארות agarose חוזה ליצירת חזקים תלת ממדי (3D) ברקמות בתוך 7 ימים. מילימטר בקנה מידה טבעות רקמה תורמת בדיקות מכניות לשמש כאבני בניין להרכבת רקמות.

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

בכל שנה, מאות אלפי חולים עוברים ניתוח מעקף של העורקים הכליליים בארצות הברית.1 כשליש מחולים אלו...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מבני רקמה תלת-ממדיים מתאיים מצוברים וממטריקס שמקורו בתאים, אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח תפקודי. דבר זה מושג תחילה על ידי עיבוד שבבי של תבנית פוליקרבונט ליצירת בארות טבעתיים בעלות תחתית עגולה. לאחר מכן, שופך poly dimethylsiloxane או PDMS על תבנית הפוליקרבונט כדי ליצור תבנית יצוף.לאחר מכן, תבנית ה-PDMS משמשת ליצירת בארי aros. השלב הסופי הוא זריעת תאים לתוך בארי ה-aros כדי לאפשר להם להתרכז וליצור טבעות רקמה לכידות. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להשיג הרכבה עצמית תאית והנדסת רקמות באמצעות סוגי תאים שונים, והיא מאפשרת ניתוח של תרומת התאים והמטריצה החוץ-תאית הנגזרת מהם למבנה הרקמה ולתפקודה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני גישות אחרות להנדסת רקמות הוא היכולת לייצר מבני רקמה המורכבים כולית מתאים ומהמטריצה החוץ-תאית שהם מייצרים במהירות רבה יותר ממה שדווח בעבר, ובפורמט המאפשר ניתוח מכני. התחילו בשיוף של חתיכת פוליקרבונט בעובי של חצי אינץ' כדי ליצור 15 בארות טבעתיות בעלות תחתית עגולה עם קוטר עמוד מרכזי של שני מילימטרים. נקו את תבנית הפוליקרבונט כדי להסיר שאריות פלסטיק שנוצרו בתהליך השיוף והניחו לתבנית להתייבש. לאחר מכן, ערבבו PDMS ביחס של 10 ל-1 של בסיס לחומר המקשה. בצעו דגזציה (ניקוי גזים) לתמיסה כדי להסיר את כל בועות האוויר, ולאחר מכן שפכו אותה לתוך תבנית הפוליקרבונט.לאחר מכן, בצעו שנית ניקוי גזים (degassing) של התערובת על התבנית כדי להסיר בועות אוויר שנותרו, והקשיחו את ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך ארבע שעות. בזמן שה-PDMS עובר הקשחה, המיסו 2% AROS ב-DMEM. לאחר ההקשחה, הסירו בזהירות את תבנית ה-PDMS על ידי קילוף איטי מהפוליקרבונט, לאחר מכן שטפו את ה-PDMS בסבון ובמים והעבירו אותו לאוטוקלב יחד עם תמיסת ה-DMEM AROS. כעת, הניחו את תבנית ה-PDMS שעברה עיקור באוטוקלב על משטח מאוזן ומלאו אותה ב-AROS מומס, תחילה על ידי העברת AROS באמצעות פיפט לכל אחת מהתבניות של העמודים המרכזיים, ולאחר מכן על ידי העברת AROS למרחב שסביבם.המתינו עד שה-aros יתגבשו למשך כ-15 דקות. לאחר מכן, הפכו את התבנית כדי לשחרר את ה-aros מה-PDMS. גזרו את עודפי ה-aros מסביב לכל אחת מהבארות, ואז מקמו בארת aros אחת בכל בארה של פלטת 12 בארות.הוסיפו מצע גידול תאים מסביב לבאר ה-aros מבלי לכסות את חלקו העליון של הבאר. לאחר מכן, הכניסו את הצלחות לאינקובטור כדי לאפשר להן להגיע לשיווי משקל בעוד התאים מוכנים. כאשר התאים מגיעים ל-90%confluence, בצעו trypsin לתאי שריר חלק מעורק אבירטי של חולדה ו-resus.שHה תאים בריכוז של 5×10⁶ תאים למיליליטר. לאחר מכן, העבירו בפיפט 100 µL מת сусפנזיית התאים לכל אחת מבארות ה-aros שהגיעו לשיווי משקל. השתמשו בתנועה סיבובית כדי לפרוס את התאים בכל אחת מהבארות.הניחו את הפלטות באינקובטור למשך 24 שעות ללא הפרעה. החליפו את המצע בכל יומיים על ידי שאיבת המצע מסביב לבאר ולאחר מכן מילוי מחדש של כל באר עד שהתבנית של ה-aros תהיה טבולה לחלוטין. ובסיום התרבית, מלאו צלחת פטרי קטנה ב-PBS.הוצאו כל טבעת מהתבנית שלה על ידי החלקתה מעל העמוד המרכזי. הניחו את הטבעות בצלחות פטרי עם PBS Center, וטבעת אחת תחת מערכת הדימות הדיגיטלית. השתמשו בתוכנה לזיהוי קצוות כדי למדוד את עובי הטבעת בארבעה מיקומים: למעלה, למטה, משמאל ומימין להיקפה.לביצוע בדיקת מתיחה חד-צירית. הצמידו דגימת טבעת לשני תפסני חוט דקים. הריחו את התפסנים עד להפעלת עומס קריעה של 5 mN על הטבעת.לאחר מכן, הזינו את שטח החתך שחושב ממדידות העובי ורשמו את אורך המדידה (gauge length). בצעו שמונה מחזורי טעינה מקדימים (pre-cycle) לטבעת בין עומס הקריעה ל-50 kilo pascal. הפעילו מאמץ בקצב של 10 millimeters per minute; לאחר מחזור הטעינה המקדימה השמיני, משכו עד לכשל בקצב של 10 millimeters per minute.עבור כל טבעת, מדדו את מאמץ המתיחה הסופי ואת מאמץ הכשל, וחשבו את מודול המשיק המקסימלי מהנתונים שנרכשו. בנוסף למחקרים פונקציונליים in vitro, טבעות תאים חיים אלו יכולות גם להתמזג ליצירת צינורות רקמה. השתמשו במספריים כירורגיים כדי לחתוך את קצות צינורות הסיליקון בזווית ליצירת קצוות אלכסוניים, ולאחר מכן בצעו אוטוקלב לצינורות הסיליקון בזמן שהם עוברים את תהליך האוטוקלב.מלאו צלחת פטרי במצע, העבירו מחזיקי צינורות סיליקון מותאמים שעברו סטריליזציה למדף בטיחות ביולוגית והניחו אותם בצלחת פטרי ריקה. לאחר מכן, הסירו את הטבעות מבארות ה-aros והניחו אותן בצלחת הפטרי המלאה במצע. הניחו את צינורות הסיליקון באותה צלחת פטרי כדי להרטיב אותם לפני השימוש.השתמשו בפינצטה כדי להניח את קצהו של צינור סיליקון במרכז הטבעת והחליקו בעדינות את הטבעת על צינור הסיליקון. החליקו את הטבעות עד למגע אחת עם השנייה על ידי דחיפה עדינה שלהן לסירוגין בשני הכיוונים לאורך הצינור. לאחר הרכבת הטבעות, יישרו את צינורות הסיליקון בתוך תומכי הפוליקרבונט והבריגו את שני חלקי התומך זה לזה.הוסיפו 55 milliliters של מצע לצחנית הפטרי. החליפו את המצע מדי שלושה ימים לאורך תקופת התרבית כדי להסיר את צינורות הרקמה. ראשית, מלאו צחנית פטרי ב-PBS.לאחר מכן, שחררו את צינורות הסיליקון מהמחזיק מפוליקרבונט והשתמשו בפינצטה כדי להחליק את צינורות הרקמה מהצינור הסיליקוני אל תוך הצלחת. כאשר הפעולה מבוצעת נכון, התאים שוקעים לתחתית בארי הלוליות ומתכווצים תוך 24 שעות מההצבה כדי ליצור טבעת רקמה מסביב לעמוד המרכזי בלוליית ה-Agarro; זהו גרף מייצג של עקומת מאמץ-מעיכה שהתקבלה מבדיקת מתיחה חד-צירית של טבעת רקמה בעובי שני מילימטרים שנוצרה מתאי שריר חלק של חולדה. ערכי חוזק המתיחה הסופי, מודול המתיחה המקסימלי ומעטפת הכשל משמשים לאחר מכן להשוואת התכונות המכניות של דגימות טבעות רקמה שגודלו תחת פרמטרי תרבית שונים.ניתן לשלוט בתכונות המכניות של טבעות רקמה על ידי שינוי פרמטרי התרבית, כולל מספר התאים להשבה, משך התרבית, מצע התרבית וסוג התאים שבהם נעשה שימוש. בנוסף לתאי שריר חלק של חולדה, תאי שריר חלק ראשוניים של אדם יוצרים טבעות רקמה בעלות חוזק מתיקה דומה.תאי גזע מזנכימליים אנושיים מצטברים אף הם ליצירת טבעות, אך הם לא היו חזקים מספיק לצורך בדיקה מכנית. המערכת שלנו מאפשרת ייצור של מבני רקמה מהונדסים מתאים תאים בלבד, פשוט על ידי זריעת תאים לתוך בארי הארוס (aros wells) המותאמים שלנו. לאחר עיבוד תבנית הפוליקרבונט הראשונית, אנו יכולים לייצר מספר בלתי מוגבל של תבניות PDMS שניתן להשתמש בהן ליצירת התבניות, כך שאין צורך בציוד נוסף.המערכת היא רב-גונית בכך שהשתמשנו במספר סוגי תאים שונים במערכת כדי ליצור טבעות רקמה, ולכן מערכת זו עשויה לשמש פוטנציאלית הן ליישומים של הנדסת רקמות והן למחקרים in vitro של תרומת התאים והמטריצה החוץ-תאית למבנה הרקמה ולתפקודה.

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ליצירת מבנים מאורגנים מאוד של רקמה מורכבת, יש להרכיב מספר חומרים וסוגי תאים לכדי קומפוזיט משולב.  עיצוב קומבינטורי זה משלב יריעות תאים שכבתיות ספציפיות לאיבר עם שני חומרים נפרדים שמקורם ביולוגית המכילים בסיס מטריצה סיבי חזק, ותאי אנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדשים.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

בעבודה זו אנו מציגים טכניקה לייצור מהיר של רקמות כלי דם חיות על ידי תרבית ישירה של קולגן, תאי שריר חלק ותאי אנדותל. בנוסף, מתואר פרוטוקול חדש לאפיון מכני של רקמות כלי דם מהונדסות.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

כתב יד זה מתאר את היצירה של רקמות לב מהונדסות מוגדרות באמצעות ביטוי סמני פני השטח ומיון תאים. לאחר מכן ניתן להשתמש ברקמות המוגדרות בביו-ריאקטור רב-רקמתי כדי לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב על מנת לספק מערכת מודל פונקציונלית, אך מבוקרת, של הלב האנושי.

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיית הדפסה ביולוגית באמצעות מערכת הפקדה רובוטית אוטומטית המשלבת רמזי הנחיה טופוגרפיים חרוטים עם תצהיר מדויק של תא הנושא דיו הידרוג'ל. התאים המודפסים מועברים ישירות לתכונות החרוטות ומסוגלים לחוש ולהתמצא איתם.

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

כלי דם מהונדסים Scalable ישפרו ישימות קליניות. באמצעות מדריכי 3D מודפס ניכרים בקלות, טבעות של שריר חלק בכלי דם נוצרו ומוערמות לצורה צינורי, ויצרו שתל וסקולרית. שתלי יכול להיות בגודל כדי לענות על המגוון של ממדים עורקים אנושיים כלילית פשוט על ידי שינוי גודל המדריך מודפס 3D.

Scaling של שתלי כלי דם שהונדס בשיטות מדריכי 3D מודפס ואת שיטת נחת הטבעת

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה בדיית רקמות עצמית שהורכב טבעות בגדלים משתנים באמצעות תבנית מותאמת אישית פלסטיק מודפס 3D. PDMS התשלילים נרפאים ב כייר מודפס 3D; אז agarose הוא ליהק את התשלילים PDMS נרפא. התאים הם נזרע לתוך בארות agarose וכתוצאה מכך היכן הם מצטברים לטבעות רקמות.

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

במסמך זה אנו מציגים שיטה מהירה, נתיישב ועלות נמוכה בדיית בתבניות polydimethylsiloxane מותאם אישית יכול לשמש לייצור המבוסס על הידרוג רקמות מהונדסים עם לסימולציה. בנוסף, אנו מתארים תוצאות הערכות מכני, היסטולוגית שנערכו על רקמות הלב מהונדסים המיוצר בעזרת טכניקה זו.

מותאם אישית מהונדסים תרביות רקמה בתבניות של מאסטרים נחרטו לייזר

נדגים שיטה לבניית אסיפה מבוססת על תא בודד (3D) תלת-ממדי ללא לגרדום מלאכותי.

מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

מוצג כאן פרוטוקול ליצירת רקמות חיבור מהונדסות לתרבות מקבילה של 48 רקמות בלוח רב-בארות עם מוטות כפולים, המתאימים למחקרים מכאניסטיים, מידול מחלות ויישומי סינון. הפרוטוקול תואם פיברובלסטים מאיברים ומינים שונים ומודגם כאן עם פיברובלסטים לב ראשוניים אנושיים.

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.

הדגמה של תרבית יריעות תאים בהרכבה עצמית ויצירה ידנית של אורגנואיד תלת-ממדי דמוי גיד/רצועה באמצעות פיברובלסטים עוריים אנושיים

חקור שיטה ליצירת טבעות רקמות תלת-ממדיות מתאי שריר חלק באמצעות הרכבה עצמית בתבניות אגרוז. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביומכני של תרומת התאים והמטריצה החוץ-תאית למבנה הרקמה.

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

גלה סרטונים נוספים