חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפיק חלבונים רקומביננטיים טהורים מאוד באמצעות הליך טהרה באפinity (זיקה) בשני שלבים. כדי להשיג זאת, תג טהרה ביספציפי המבוסס על דומיין קושר אלבומין משובט לתוך וקטור ביטוי המכיל את הגן הרלוונטי, ולאחר מכן מבוצע ביטוי של חלבון ההיתוך ב-e coli. כשלב שני, ליסאט בקטריאלי המכיל את חלבון המטרה עובר טהרה בעמודה כרומטוגרפית עם אלבומין של סרום אנושי (human serum albumin) או HSA מקובע.

לאחר מכן מבוצע ניקוי נוסף בעמודת MAB select superior resistance או sure המכילה דומיין Z מנחול (immobilized) שנגזר מחלבון A של סטפילוקוקוס. פעולה זו מביאה למוצר טהור מאוד המתאים ליישומים תובעניים. לאחר מכן, רמת הטוהר מוערכת באמצעות SDS page ובמידת הצורך, באמצעות ספקטרומטריית מסות, כדי להבטיח שהחלבון המבוקש נוקה בהצלחה עד להומוגניות; התוצאות מראות ניקוי יעיל לאחר שני שלבים עוקבים בהשוואה לשלב יחיד עם תג הניקוי הביספציפי החדש שנעשה בו שימוש בפרוטוקול זה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניקוי זיקה (affinity purification) בשלב אחד, הוא שניתן להגיע לחלבון טהור באמצעות פרוטוקול פשוט המשתמש בידית זיקה אחת בלבד, ללא קשר לתכונותיו של חלבון המטרה.

ניתן להשתמש בשיטה זו עבור חלבונים בעלי מאפיינים מגוונים מאוד. כמו כן, מכיוון שהתג קטן מאוד, הוא מיוצר בקלות על ידי המארח החיידקי. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את הליך הטיהור הזה ימצאו אותו פשוט וברור מאוד.

שלב קריטי הוא התאמת ה-pH של הדגימה לפני טעינתה לעמודה השנייה. תג טיהור קטן בעל שתי זיקות מובנות פותח על ידי שילוב של אתר קישור נוסף בתוך דומיין קישור לאלבומין שנגזר מחלבון G של סטרפטוקוקוס. דומיין הקישור לאלבומין, המורכב מ-46 חומצות אמינו, מתקפל למקבץ יציב של שלושה הליקסים ומכיל אתר קישור לאלבומין בסרום אנושי (HSA), הממוקם בעיקר על ההליקס השני. באמצעות רנדומיזציה גנטית של 11 חומצות אמינו חשופות על פני השטח הממוקמות בהליקס הראשון והשלישי, הנדסו משטחי קישור חדשניים. מספר סבבים של מיון ביופגי (biopanning) מול דומיין Z שנגזר מחלבון A של סטפילוקוקוס, עם הספרייה הקומבינטורית המובעת על פאג', הובילו למולקולה דו-ספציפית שכוונתה A BDZ one, בעלת זיקה הן ל-HSA והן לדומיין Z. כדי להכין את הפלסמיד לביטוי של תג ההיתוך הדו-ספציפי, הכינו את מקטעי ה-PCR של הגן A BDZ one, המוקפים באתרים למסיר (restriction sites) מתאימים לצורך שילוב בקצוות של הגן המטרה בפלסמיד הביטוי. חתכו את מקטעי ה-PCR של A BDZ one ואת וקטור הביטוי המטוהר המכיל את הגן הרצוי באמצעות אנזימי ההגבלה הנבחרים בבופר תגובה מתאים, וטהרו את התוצרים לפני הליגציה.

בשלב הבא, בצעו ליגציה של פרגמנט ה-A BDZ המגולח לתוך וקטור הביטוי המכיל את הגן הרצוי, והעבירו את תוצר הליגציה לתוך חיידקי e coli בתהליך טרנספורמציה. פזרו את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר, המתוספות באנטיביוטיקה מתאימה לסלקציה. בצעו סריקת PCR למספר מושבות ואמתו את רצף קסטת הביטוי שהתקבלה באמצעות ריצוף DNA.

לבסוף, הכין את הפלסמיד מתרבית לילה של מושבה שרצפה אומתה, והעבר אותה למאבח הזריחה המועדף להבעת חלבון המטרה. כאשר התג החדש מחובר לקציו, תחילה תזריע מושבה בקטריאלית בודדת לתוך 10 milliliters של מרק סויה טריפטיק (tryptychs soy broth) המועשר בחמישה גרמים לליטר של תמצית שמרים ובאנטיביוטיקה המתאימה; דגרי ב-150 RPM וב-37 degrees Celsius למשך לילה. למחרת, תזריע מיליליטר אחד מתרבית הלילה לתוך 100 milliliters של מצע טרי, ותשרה את הבעת החלבון.

כאשר התאים מגיעים לשלב הצמיחה הלוגריתמי. לאחר השראת ייצור החלבון, דגרו את התאים ב-150 RPM וב-25 °C למשך לילה, ואספו את התאים למחרת באמצעות סנטריפוגציה. טיהור זיקה אורתוגונלי של חלבון היתוך A BDZ one מושג באמצעות טיהור ראשוני בעמודה עם HSA או zoma מקובעים. לאחר מכן מבוצע שלב טיהור עוקב, המשתמש בזיקה השנייה של התג הדו-סגולי.

מדיות כרומטוגרפיות שבהן מומיובל את דומיין Z, כגון MA select sure, זמינות בקלות לניקוי נוגדנים. בעוד ש-HSA ניתן להצמיד כימית למדיות כדי לספק מטריצה שנייה להמשך ניקוי זיקה אורתוגונלי. השעה, השעה את המשקע ב-25 milliliters של באפר הרצה. לאחר מכן, השביה את התאים באמצעות סוניקציה בעוצמה של 60% amplitude ובפולסים של שנייה אחת, ולאחריהם הפסקה של שנייה אחת, למשך שלוש דקות בסך הכל.

לאחר צנטריפוגציה של הדגימה, סננו את הנוזל העליון המכיל את חלבון המטרה דרך מסנן של 0.45 מיקרון לפני המשך הניקוי. לאחר מכן, בצעו שיווי משקל לעמודת HSA spheros של נפח של מיליליטר אחד, או לעמודה מופעלת NHS המצומדת ל-HSA, באמצעות 10 נפחי עמודה של בופר הרצה בקצב של מיליליטר אחד לדקה במערכת מתאימה לניקוי חלבונים. לאחר השגת שיווי משקל, טענו את הליזאט הבקטריאלי בקצב של 0.5 מיליליטר לדקה, החזירו את קצב הזרימה למיליליטר אחד לדקה ושטפו את העמודה עם חמישה נפחי עמודה של בופר הרצה, ולאחריהם חמישה נפחי עמודה של בופר שטיפה.

בצע אלוציה של הדגימה באמצעות בופר אלוציה בקצב של מיליליטר אחד לדקה ואסוף את הפראקציות. נטר את הבליעה באורך גל של 280 ננומטר כדי לבחור פראקציות משיא האלוציה. לצורך ניקוי נוסף,אחד את הפראקציות בעלות ריכוז החלבון הגבוה ביותר, ולאחר מכן דלל אותן פי שניים.

יש לוודא כי בופר ההרצה נמצא בשימוש וכי ה-pH הוא סביב ניטרלי. שלב זה קריטי להיקשירה של החלבון לדומיין Z. במידת הצורך, יש להוסיף Tris-HCl בריכוז 1 M ב-pH 8 כדי להעלות את ה-pH.

בשלב הבא, טען את הדגימה בקצב של 0.5 milliliters לדקה אל תוך עמודת לכידה (trap MA) בנפח של one milliliter, ובחר בעמודת sure שהושרה עם תמיסת ריצה (running buffer) של sure. לאחר איפוס קצב הזרימה ל-one milliliter לדקה, שטוף את העמודה עם חמישה נפחי עמודה של תמיסת ריצה של sure. לאחר מכן, בצע אלוציה של החלבונים באמצעות 0.2 molar acetic acid ב-pH 2.7 עבור חלבונים רגישים.

ניתן לנטרל את ה-EIT באופן ישיר בעת האיסוף על ידי הוספה של T tris. ניתן להשתמש ב-H-C-L-S-D-S page כדי להעריך את טוהר החלבון. חשוב לחזר את הדגימה באופן מלא, שכן free cyte ב-A BDZ one עלול לגרום לדימרזציה של המוצר בתנאים שאינם מחזרים.

כשלב סופי, ניתן לנתח את המשקל המולקולרי של המוצר המטוהר באמצעות ספקטרומטריית מסות לאחר טיהור לפי הפרוטוקול האורתגונלי בעמודת HSA, ולאחריו עמודת MA select sure. דגימות שונות שנאספו במספר נקודות טיהור נותחו באמצעות SDS page. הדגימות כללו את התג A BDZ one עצמו, כמו גם שלושה חלבוני מטרה אנושיים שונים המחוברים ל-AB DZ one, המייצגים מחלקות מסיסות, משקלים מולקולריים ונקודות איזואלקטריות שונות.

נתיבים 1 עד 4 מראים ליזאטים של חלבונים לפני ניקוי עבור שלושת חלבוני היתוך AB DZ one השונים ועבור תג ה-AB DZ one עצמו. נתיבים 5 עד 8 מראים את התוצאות משלב הניקוי של החלבונים באמצעות HSA. לבסוף, נתיבים 9 עד 12 נובעים משלב הניקוי הסופי באמצעות mAbs select Sure.

בנוסף, נותחו כאן דגימות שהושגו מאותם ליזטים שטוהרו בסדר הפוך באותן עמודות. נתיבים אחת עד שלוש מראים ליזטים לפני טיהור, בעוד שנתיבים ארבע עד שש נלקחו לאחר שלב הטיהור הראשון בעמודת MAB Select Sure. המוצרים בעלי הטוהר הגבוה בנתיבים שבע עד תשע הם תוצאה של טיהור ה-HSA הסופי.

התוצאות מראות בבירור את התועלת בשימוש בתג כפול ובשני שלבי טיהור ספציפיים מאוד. למרות שמושגת רמת טוהר סבירה לאחר שלב הטיהור הראשוני, כפי שניתן לראות בג'לים, השלב הבא מניב מוצר טהור מאוד המתאים ליישומים תובעניים במיוחד. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את שלב הטיהור המרכזי בשיטה זו תוך מספר שעות על ידי אדם אחד, כדי להשיג חלבון רקומביננטי בדרגת טוהר גבוהה המתאימה ליישומים שונים רבים.

לדוגמה, לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בביומולקולות המופקות ליישומים אחרים, כגון מחקרי אינטראקציה כדי לענות על שאלות כמו חוזק הקישור של קומפלקס. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה מעמיקה של האופן שבו ניתן להשיג מוצר חלבון טהור באמת באמצעות שימוש בתג זיקה כפול זה.