Name: חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: למד שיטת טיהור חלבונים רקומביננטיים בשני שלבים באמצעות תג ביספציפי קטן. הפרוטוקול משתמש בכרומטוגרפיית זיקה עם אלבומין ודומיין Z להשגת טוהר גבוה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

פרויקט זה מומן על ידי קנוט אליס ולנברג קרן המועצה למחקר שוודי.

1. שיבוט של היתוך היעד gene/ABDz1-tagged לבנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שברי PCR של הגן ABDz1 מוקף אתרי הגבלה מתאים קשירת N-מסוף הגן היעד בביטוי פלסמיד (א ABDz1 פלסמיד המכיל זמין באופן חופשי באמצעות הסכם העברת חומר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב מטוהרים ביטוי וקטור ושברי PCR עם אנזימי הגבלה נבחר חיץ תגובה הולמת. לטהר את המוצרים לפני קשירת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור שבר מוגבלת ABDz1 לתוך וקטור ביטוי המכיל את הגן של עניין להפוך את המוצר קשירת ל E. coli (בשיטה המקורית זן RR1ΔM15 שימש 8). מורחים תאים טרנספורמציה על צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה הבחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR מסך מושבות אחדות ורצף לאמת את הקלטת הביטוי וכתוצאה מכך על ידי רצפי DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פלסמיד מתרבות הלילה של verif רצףהמושבה ied ולהפוך לזן הביטוי המועדף (ב E. coli השיטה המקורית רוזטה (DE3), אירוח pRARE פלסמיד כדי לשפר את הייצור של החלבונים המקודדים על ידי הגנים האנושיים, שימשו). </li></ol> 2. חלבון הביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבת חיידקים אחת לתוך 10 מ"ל של מרק סויה tryptic בתוספת תמצית g / l 5 שמרים אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בסל"ד 150 ב 37 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 1 מ"ל של תרבות לילה בינוני 100 מ"ל ו טרי להשרות ביטוי חלבון (במקור 1 mM איזופרופיל-β-D-thiogalactoside כאשר operon החלבי נוצל) כאשר התאים מגיעים לשלב צמיחה לוגריתמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בסל"ד 150 במהירות של 25 תאים ° C במשך הלילה הקציר על ידי צנטריפוגה. </li></ol> 3. זיקה אורתוגונלית טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור בתוך חיץ 25 מ"ל ריצה (25 מ"מ טריס-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% (w / v) Tween 20, pH 8.0) ולשבש הדואר תאים על ידי sonication ב משרעת 60% ו 1.0/1.0 פולסים דקות 3. צנטריפוגה מדגם ולסנן את חלבון המטרה המכיל supernatant (0.45 מיקרומטר) לפני טיהור נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן בין 1 מ"ל HSA טור Sepharose או עמודה NHS פעילה, יחד בעבר עם HSA על פי המלצות של הספק, עם 10 כרכים עמודה (CV) של הפעלת המאגר ב 1 מ"ל / דקה על מערכת טיהור חלבונים מתאים. טען את lysate חיידקי ב 0.5 מ"ל / דק 'ולאחר מכן לאפס את קצב הזרימה עד 1 מ"ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ רץ ואחריו 5 קורות חיים של חיץ כביסה (5 מ"מ NH 4 Ac, pH 5.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute המדגם עם חיץ elution (0.5 מ 'HAc, pH 2.5) בשעה 1 מ"ל / דקה לאסוף את השברים, הקליטה לפקח על 280 ננומטר לבחור שברים מהפסגה eluted לטיהור נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים עם ריכוז החלבון הגבוהה ביותר, לדלל פעמיים במאגר ריצה בטח (20 פוספט מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 7.2) ולוודא pH הוא בסביבות נייטרלי. הוסף 1 M טריס-HCl pH 8 להגדיל את ה-pH במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם על 0.5 mL / min על טור 1 HiTrap מ"ל MabSelect בטח כי כבר equilibrated עם קורות חיים של 10 חיץ לרוץ בטח בבית 1 מ"ל / דקה. אפס את קצב הזרימה עד 1 מ"ל / דקה לאחר הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ ריצה בטח (שלב 5) ו elute את החלבונים עם 0.2 מ 'HAc, pH 2.7. עבור חלבונים יעד רגיש eluate ניתן לנטרל ישירות על ידי תוספת של טריס-HCl על האוסף. </li></ol> אם הפעולות chromatographic מתהפכים eluate מ MabSelect את הטור בטח יכול להיות מדולל מפעיל המאגר (שלב 3.1) ו-pH עלה ל סביב 8 על ידי תוספת של 1 M טריס-HCl. באופן כללי, פסגות צרה הם נצפו כאשר המטריצה ​​בטח מועסק בשלב השני. 4. הערכת טוהר על ידי אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג'ל polyacrylamide (SDS-PAGE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את השברים מטוהרים עלהפחתת SDS-PAGE, ואם תרצה, לנתח את משקל מולקולרי של המוצר מטוהרים על ידי ספקטרומטריית מסה. חשוב להפחית באופן מלא את המדגם מאז ציסטאין חופשי ABDz1 עלול לגרום dimerization של המוצר תחת אי - הפחתת התנאים. </li></ol> 5. נציג תוצאות: כהוכחה עקרוני, טיהור זיקה אורתוגונליים בהנחיית תג ABDz1 הוערך במשך שלושה חלבונים היעד האנושי המייצג כיתות מסיסות שונה, משקולות מולקולרית נקודות isoelectric (טבלה 1). הגן היה ABDz1 התמזגו גנטית הגנים היעד המבנים התבטאו החיידק, תרשים 2 מציג תרשים זרימה של כל השלבים השיטה ברציפות. לאחר טיהור ידי פרוטוקול אורתוגונליים, דגימות שנאספו בנקודות שונות נותחו על ידי SDS-PAGE (איור 3). התוצאות מראות בבירור את התועלת של תג כפולה בשני שלבים לטיהור מאוד ספציפיות. למרות טוהר סבירה achieved לאחר שלב הטיהור הראשוני כפי שניתן לראות מן הג'לים, הצעד רצופים התשואות מוצר טהור מאוד גם מתאים מאוד יישומים תובעניים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. עיצוב הספרייה קומבינטורית המשמש מבחר של תג ABDz1 bispecific. 46 אמינו אלבומין מחייב חומצה תחום מתקפל לחבילה של שלושה יציב הסליל והוא מכיל אתר קשירה עבור אלבומין בסרום האדם נמצא בעיקר הסליל השני. עד גנטית אקראי eleven משטח חשוף חומצות אמיניות הממוקם הסליל הראשון והשלישי, משטח מחייב הרומן תוכנן. באחת עשרה תפקידים מצוינים באיור ממוספרות לפי Kraulis et al. 9. בעקבות biopanning נגד דימר של תחום-Z של חלבון staphylococcal עם הספרייה קומבינטורית הביע על הפאג, את המולקולה bispecific ABDz1 זוהה. באיור 2. תרשים זרימה פשוט עבור פרוטוקול זיקה אורתוגונליים טיהור. PCR-קטע המכיל את רצף ABDz1 הוא ligated (N-סופני) עם הגן של עניין וקטור ביטוי מתאים. המוצר קשירת הופך ל E. coli לאימות רצף והכנת פלסמיד. בעקבות השינוי לארח ביטוי, תרבות בקנה מידה גדול עבור ביטוי חלבון רקומביננטי מוגדר מתרבות לילה ראשונית. חיידקים נקצרים על ידי צנטריפוגה ו lysed ידי sonication לייצר lysate בקטריאלי המכיל את חלבון המטרה. לאחר שלב הסינון כדי להסיר חלקיקים מוצקים שיורית, lysate הוא נתון טיהור זיקה אורתוגונליים על מערכת טיפול הנוזל על ידי עובר שני צעדים טיהור ברציפות. פסגות eluted משני השלבים לטיהור נדגמים הוערכו על ידי SDS-PAGE כדי להעריך את טוהר לעומת tהוא lysate לפני הטיהור. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> באיור 3. SDS-PAGE ניתוח של חלבונים היעד הביע וטיהר ב היתוך עם ABDz1. דגימות שנלקחו lysate החיידק של שלושה חלבונים ביטוי היתוך ABDz1, המייצגים תכונות שונות, ואת תג ABDz1 עצמה נאספו יחד עם דגימות הפסגות המתאימה טיהור על עמודה HSA ואחריו MabSelect בטוחה עמודה (A) . Lanes 1-4 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 5-8 מתוך טיהור HSA (השלב ​​הראשון) ואת נתיבי 9-12 מתוך טיהור MabSelect בטח (השלב ​​השני). דוגמאות נטענים, לפי הסדר הבא: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 ו ABDz1. בנוסף, רכשה דגימות מן lysates אותו מטוהרים בסדר הפוך על עמודות זהה נותחו (B). Lanes 1-3 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 4-6 וrom MabSelect טיהור בטוחה (השלב ​​הראשון) ואת הסמטאות 7-9 מתוך טיהור HSA (השלב ​​השני). דוגמאות הועמסו באותו סדר כמו ב (א) אלא את תג עצמו אינו כלול. מתוך תוצאות אלה ברור כי בשיטה זו שני שלבים התשואות חלבונים מטוהרים ללא סדר הפעולות מוחלים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ב </td><td> יעד חלבון Uniprot ג </td><td> מולקולרית משקל (KDA) </td><td> מסיסות בכיתה ד </td><td> מולקולרית משקל המוצר של היתוך (KDA) </td><td> Isoelectric נקודה המוצר היתוך </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17.4 </td><td> 4 </td><td> 23.7 </td><td> 8.5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10.8 </td><td> 3 </td><td> 17.1 </td><td> 4.9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8.9 </td><td> 5 </td><td> 15.2 </td><td> 6.8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקל מולקולרי של תג ABDz1 לבדו הוא 6.3 kDa, הצבע isoelectric 6.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון מטרה מייצג חלק של החלבון Uniprot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסיסות מעמד של שבר חלבון עם N-ABP מסוף 6 שלו 10. </li></ol> טבלה 1. חלבונים יעד ומוצרי היתוך עם תג ABDz1 להעריך הוכחה במחקר העיקרון. שלושה חלבונים אנושיים ייחודיים עם משקל מולקולרי מסיסות שונה, נקודת isoelectric נבחרו ביטוי וטיהור על ידי הגישה את הזיקה אורתוגונליים.

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הזיקה אורתוגונליים טיהור פרוטוקול המוצג כאן מאפשר טיהור יעיל של מגוון רחב של חלבונים היעד. על ידי שילוב של אתר הקישור הטבועה תחום אלבומין מחייב עם משטח מחייב רומן, תג קטן חלבון bispecific פותחה. זה מאוד פשוט לנצל את תג שכן הוא יכול פשוט לשכפל ו לידי ביטוי היתוך חלבון כלשהו של עניין וקטור כל ביטוי מועדף. ציוד סטנדרטי זמין ברוב המעבדות יכול להיות מועסק לטיהור שני שלבים החלבון. מאז פונקציה של תג ABDz1 תלוי קיפול נכון של התחום ביעילות לחשוף משטחים שני שלה מחייב, השיטה היא מוגבלת חלבונים לידי ביטוי בצורה מסיסים ולא מתאים purifications בתנאים denaturing. סוכני צמצום יש להימנע גם משום שהם מפריעים מחייב של ABDz1 לתחום-Z על המטריצה ​​MabSelect בטח. אורתוגונלית זיקה purification מספק אלטרנטיבה יעילה בשיטות מסורתיות על מנת לספק את הדרישות של חלבונים מטוהרים מאוד יישומים תובעניים רבים. במקביל, שיטה זו מבטלת את הצורך תיוג קומבינטורית כאשר אסטרטגיות טיהור שונים משמשים ברציפות. עבור יישומים הדורשים חלבון מטרה הילידים, אתר מחשוף פרוטאז עשויים להיות הציג לעבד הסרת האנזימטית של תג ABDz1 האפשר 11. יתר על כן, תג ABDz1 הוא התחום הראשון bispecific חלבון קטן מקופל שתואר עד כה. זה ייחודי משום שהוא מספק אסטרטגיה לטיהור תלויה בשני אינטראקציות יעד ספציפי זיקה. בעתיד זה יהיה מעניין להרחיב את הרעיון הזה על ידי פיתוח התגיות bispecific הרומן החדש מחייב לבצע משטחים התואמות שרפים chromatographic זמינה וזולה. לדוגמה, על ידי החלפת חומצות אמינו מעורב מחייב אלבומין עם שאריות בסיסיים, תג תואם iבבורסה כרומטוגרפיה ניתן להשגה. רעיון דומה הוכח יעיל על ידי הממונה על תחום הנדסת-Z כדי ליצור תגי הידוע בשם Z חומצה 12 ו-Z בסיסי 13 תואם חילופי אניון ו קטיון, בהתאמה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> התרבות האמריקאית סוג אוסף </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli רוזטה (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> סויה Tryptic מרק </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> תמצית שמרים </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> הרטט sonicator תא </td><td> Sonics וחומרים </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sepharose </td><td> Pharmacia ביוטק </td><td> לשעבר מוצר </td></tr><tr><td> HiTrap בטח MabSelect </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> NHS המופעל HiTrap HP עמודה </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים bispecific

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

בשל העלויות הגבוהות הקשורות טיהור של חלבונים רקומביננטי הפרוטוקולים צריכים להיות רציונלית. עבור תפוקה גבוהה המאמצים יש ביקוש עבור שיטות כלליות שאינן דורשות חלבון המטרה אופטימיזציה ספציפיות 1. כדי להשיג זאת, תגי לטיהור גנטית יכול להיות התמזגו אל הגן של עניין משמשות 2. ידית זיקה הנפוץ ביותר הוא תג ששה היסטידין, אשר מתאים טיהור תחת שני תנאים מקומיים denaturing 3. נטל מטבולי להפקת תג הוא נמוך, אבל זה לא מספק כמו סגוליות גבוהה כמו המתחרות 1,2 זיקה כרומטוגרפיה אסטרטגיות מבוססות. כאן, תג טיהור bispecific עם שני אתרי קישור שונים על חומצת אמינו 46, תחום חלבון קטן פותחה. תחום אלבומין מחייב נגזרת חלבון G סטרפטוקוקלי ויש לו זיקה חזקה הטבועה אלבומין בסרום אדם(HSA). עשר משטח חשוף חומצות אמינו, לא מעורב אלבומין מחייב 4, חולקו באקראי גנטית כדי לייצר ספריה קומבינטורית. הספרייה חלבון עם הרומן מסודרים באופן אקראי פני השטח מחייבים (איור 1) באה לידי ביטוי על חלקיקים phage כדי להקל על הבחירה של קלסרים על ידי טכנולוגיית התצוגה phage. באמצעות מספר סבבי biopanning נגד dimeric-Z תחום הנגזרות חלבון staphylococcal 5, מולקולה קטנה, bispecific עם זיקה הן HSA ויעד רומן זוהה 6. חלבון הרומן תחום, המכונה ABDz1, הוערך כתגית טיהור לבחירה של חלבונים עם יעד משקל מולקולרי מסיסות שונה, נקודת isoelectric. שלושה חלבונים היעד התבטאו coli Escherishia עם תג רומן התמזגו שלהם N-Termini ואילך זיקה מטוהרים. טיהור ראשוני על עמודה או עם HSA משותק או Z-תחום הביא relatiהמוצרים טהור vely. שני שלבים זיקה טיהור עם תג bispecific הביאו לשיפור משמעותי של טוהר חלבון. התקשורת chromatographic עם ה-Z תחום משותקת, עבור MabSelect למשל בטוח, זמינים לטיהור של נוגדנים HSA יכול בקלות להיות יחד כימית התקשורת לספק את המטריצה ​​השנייה. שיטה זו היא יתרון במיוחד כאשר יש ביקוש גבוה על טוהר חלבון המטרה התאושש. Bifunctionality של התג מאפשר chromatographic שני צעדים שונים כדי לשמש בעוד נטל על חילוף החומרים מארח את הביטוי מוגבל בשל גודל קטן של התג. הוא מספק חלופה תחרותית עד שנקרא תיוג קומבינטורית תגי שם מרובים בשילוב 1,7.

הרומן יעילים שני שלבים זיקה כרומטוגרפיה פרוטוקול פותחה מתואר בפירוט. השיטה מבוססת על תג טיהור קטן עם שתי זיקות מובנה ישים למגוון רחב של חלבונים יעד עם מאפיינים שונים.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

בשל העלויות הגבוהות הכרוכות בטיהור של חלבונים רקומביננטיים, יש לייעל את הפרוטוקולים. עבור מאמצים של סריקה רחבה (high-throughput), קיים...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפיק חלבונים רקומביננטיים טהורים מאוד באמצעות הליך טהרה באפinity (זיקה) בשני שלבים. כדי להשיג זאת, תג טהרה ביספציפי המבוסס על דומיין קושר אלבומין משובט לתוך וקטור ביטוי המכיל את הגן הרלוונטי, ולאחר מכן מבוצע ביטוי של חלבון ההיתוך ב-e coli. כשלב שני, ליסאט בקטריאלי המכיל את חלבון המטרה עובר טהרה בעמודה כרומטוגרפית עם אלבומין של סרום אנושי (human serum albumin) או HSA מקובע.לאחר מכן מבוצע ניקוי נוסף בעמודת MAB select superior resistance או sure המכילה דומיין Z מנחול (immobilized) שנגזר מחלבון A של סטפילוקוקוס. פעולה זו מביאה למוצר טהור מאוד המתאים ליישומים תובעניים. לאחר מכן, רמת הטוהר מוערכת באמצעות SDS page ובמידת הצורך, באמצעות ספקטרומטריית מסות, כדי להבטיח שהחלבון המבוקש נוקה בהצלחה עד להומוגניות; התוצאות מראות ניקוי יעיל לאחר שני שלבים עוקבים בהשוואה לשלב יחיד עם תג הניקוי הביספציפי החדש שנעשה בו שימוש בפרוטוקול זה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניקוי זיקה (affinity purification) בשלב אחד, הוא שניתן להגיע לחלבון טהור באמצעות פרוטוקול פשוט המשתמש בידית זיקה אחת בלבד, ללא קשר לתכונותיו של חלבון המטרה.ניתן להשתמש בשיטה זו עבור חלבונים בעלי מאפיינים מגוונים מאוד. כמו כן, מכיוון שהתג קטן מאוד, הוא מיוצר בקלות על ידי המארח החיידקי. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את הליך הטיהור הזה ימצאו אותו פשוט וברור מאוד.שלב קריטי הוא התאמת ה-pH של הדגימה לפני טעינתה לעמודה השנייה. תג טיהור קטן בעל שתי זיקות מובנות פותח על ידי שילוב של אתר קישור נוסף בתוך דומיין קישור לאלבומין שנגזר מחלבון G של סטרפטוקוקוס. דומיין הקישור לאלבומין, המורכב מ-46 חומצות אמינו, מתקפל למקבץ יציב של שלושה הליקסים ומכיל אתר קישור לאלבומין בסרום אנושי (HSA), הממוקם בעיקר על ההליקס השני. באמצעות רנדומיזציה גנטית של 11 חומצות אמינו חשופות על פני השטח הממוקמות בהליקס הראשון והשלישי, הנדסו משטחי קישור חדשניים. מספר סבבים של מיון ביופגי (biopanning) מול דומיין Z שנגזר מחלבון A של סטפילוקוקוס, עם הספרייה הקומבינטורית המובעת על פאג', הובילו למולקולה דו-ספציפית שכוונתה A BDZ one, בעלת זיקה הן ל-HSA והן לדומיין Z. כדי להכין את הפלסמיד לביטוי של תג ההיתוך הדו-ספציפי, הכינו את מקטעי ה-PCR של הגן A BDZ one, המוקפים באתרים למסיר (restriction sites) מתאימים לצורך שילוב בקצוות של הגן המטרה בפלסמיד הביטוי. חתכו את מקטעי ה-PCR של A BDZ one ואת וקטור הביטוי המטוהר המכיל את הגן הרצוי באמצעות אנזימי ההגבלה הנבחרים בבופר תגובה מתאים, וטהרו את התוצרים לפני הליגציה.בשלב הבא, בצעו ליגציה של פרגמנט ה-A BDZ המגולח לתוך וקטור הביטוי המכיל את הגן הרצוי, והעבירו את תוצר הליגציה לתוך חיידקי e coli בתהליך טרנספורמציה. פזרו את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר, המתוספות באנטיביוטיקה מתאימה לסלקציה. בצעו סריקת PCR למספר מושבות ואמתו את רצף קסטת הביטוי שהתקבלה באמצעות ריצוף DNA.לבסוף, הכין את הפלסמיד מתרבית לילה של מושבה שרצפה אומתה, והעבר אותה למאבח הזריחה המועדף להבעת חלבון המטרה. כאשר התג החדש מחובר לקציו, תחילה תזריע מושבה בקטריאלית בודדת לתוך 10 milliliters של מרק סויה טריפטיק (tryptychs soy broth) המועשר בחמישה גרמים לליטר של תמצית שמרים ובאנטיביוטיקה המתאימה; דגרי ב-150 RPM וב-37 degrees Celsius למשך לילה. למחרת, תזריע מיליליטר אחד מתרבית הלילה לתוך 100 milliliters של מצע טרי, ותשרה את הבעת החלבון.כאשר התאים מגיעים לשלב הצמיחה הלוגריתמי. לאחר השראת ייצור החלבון, דגרו את התאים ב-150 RPM וב-25 °C למשך לילה, ואספו את התאים למחרת באמצעות סנטריפוגציה. טיהור זיקה אורתוגונלי של חלבון היתוך A BDZ one מושג באמצעות טיהור ראשוני בעמודה עם HSA או zoma מקובעים. לאחר מכן מבוצע שלב טיהור עוקב, המשתמש בזיקה השנייה של התג הדו-סגולי.מדיות כרומטוגרפיות שבהן מומיובל את דומיין Z, כגון MA select sure, זמינות בקלות לניקוי נוגדנים. בעוד ש-HSA ניתן להצמיד כימית למדיות כדי לספק מטריצה שנייה להמשך ניקוי זיקה אורתוגונלי. השעה, השעה את המשקע ב-25 milliliters של באפר הרצה. לאחר מכן, השביה את התאים באמצעות סוניקציה בעוצמה של 60% amplitude ובפולסים של שנייה אחת, ולאחריהם הפסקה של שנייה אחת, למשך שלוש דקות בסך הכל.לאחר צנטריפוגציה של הדגימה, סננו את הנוזל העליון המכיל את חלבון המטרה דרך מסנן של 0.45 מיקרון לפני המשך הניקוי. לאחר מכן, בצעו שיווי משקל לעמודת HSA spheros של נפח של מיליליטר אחד, או לעמודה מופעלת NHS המצומדת ל-HSA, באמצעות 10 נפחי עמודה של בופר הרצה בקצב של מיליליטר אחד לדקה במערכת מתאימה לניקוי חלבונים. לאחר השגת שיווי משקל, טענו את הליזאט הבקטריאלי בקצב של 0.5 מיליליטר לדקה, החזירו את קצב הזרימה למיליליטר אחד לדקה ושטפו את העמודה עם חמישה נפחי עמודה של בופר הרצה, ולאחריהם חמישה נפחי עמודה של בופר שטיפה.בצע אלוציה של הדגימה באמצעות בופר אלוציה בקצב של מיליליטר אחד לדקה ואסוף את הפראקציות. נטר את הבליעה באורך גל של 280 ננומטר כדי לבחור פראקציות משיא האלוציה. לצורך ניקוי נוסף,אחד את הפראקציות בעלות ריכוז החלבון הגבוה ביותר, ולאחר מכן דלל אותן פי שניים.יש לוודא כי בופר ההרצה נמצא בשימוש וכי ה-pH הוא סביב ניטרלי. שלב זה קריטי להיקשירה של החלבון לדומיין Z. במידת הצורך, יש להוסיף Tris-HCl בריכוז 1 M ב-pH 8 כדי להעלות את ה-pH.בשלב הבא, טען את הדגימה בקצב של 0.5 milliliters לדקה אל תוך עמודת לכידה (trap MA) בנפח של one milliliter, ובחר בעמודת sure שהושרה עם תמיסת ריצה (running buffer) של sure. לאחר איפוס קצב הזרימה ל-one milliliter לדקה, שטוף את העמודה עם חמישה נפחי עמודה של תמיסת ריצה של sure. לאחר מכן, בצע אלוציה של החלבונים באמצעות 0.2 molar acetic acid ב-pH 2.7 עבור חלבונים רגישים.ניתן לנטרל את ה-EIT באופן ישיר בעת האיסוף על ידי הוספה של T tris. ניתן להשתמש ב-H-C-L-S-D-S page כדי להעריך את טוהר החלבון. חשוב לחזר את הדגימה באופן מלא, שכן free cyte ב-A BDZ one עלול לגרום לדימרזציה של המוצר בתנאים שאינם מחזרים.כשלב סופי, ניתן לנתח את המשקל המולקולרי של המוצר המטוהר באמצעות ספקטרומטריית מסות לאחר טיהור לפי הפרוטוקול האורתגונלי בעמודת HSA, ולאחריו עמודת MA select sure. דגימות שונות שנאספו במספר נקודות טיהור נותחו באמצעות SDS page. הדגימות כללו את התג A BDZ one עצמו, כמו גם שלושה חלבוני מטרה אנושיים שונים המחוברים ל-AB DZ one, המייצגים מחלקות מסיסות, משקלים מולקולריים ונקודות איזואלקטריות שונות.נתיבים 1 עד 4 מראים ליזאטים של חלבונים לפני ניקוי עבור שלושת חלבוני היתוך AB DZ one השונים ועבור תג ה-AB DZ one עצמו. נתיבים 5 עד 8 מראים את התוצאות משלב הניקוי של החלבונים באמצעות HSA. לבסוף, נתיבים 9 עד 12 נובעים משלב הניקוי הסופי באמצעות mAbs select Sure.בנוסף, נותחו כאן דגימות שהושגו מאותם ליזטים שטוהרו בסדר הפוך באותן עמודות. נתיבים אחת עד שלוש מראים ליזטים לפני טיהור, בעוד שנתיבים ארבע עד שש נלקחו לאחר שלב הטיהור הראשון בעמודת MAB Select Sure. המוצרים בעלי הטוהר הגבוה בנתיבים שבע עד תשע הם תוצאה של טיהור ה-HSA הסופי.התוצאות מראות בבירור את התועלת בשימוש בתג כפול ובשני שלבי טיהור ספציפיים מאוד. למרות שמושגת רמת טוהר סבירה לאחר שלב הטיהור הראשוני, כפי שניתן לראות בג'לים, השלב הבא מניב מוצר טהור מאוד המתאים ליישומים תובעניים במיוחד. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את שלב הטיהור המרכזי בשיטה זו תוך מספר שעות על ידי אדם אחד, כדי להשיג חלבון רקומביננטי בדרגת טוהר גבוהה המתאימה ליישומים שונים רבים.לדוגמה, לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בביומולקולות המופקות ליישומים אחרים, כגון מחקרי אינטראקציה כדי לענות על שאלות כמו חוזק הקישור של קומפלקס. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה מעמיקה של האופן שבו ניתן להשיג מוצר חלבון טהור באמת באמצעות שימוש בתג זיקה כפול זה.

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

אנו מתארים שיטה לטיהור זיקה מתויגת-של חלבונים רקומביננטי באמצעות רובוטיקה נוזלית לטיפול. שיטה זו היא בדרך כלל ישימה לטיהור בקנה המידה הקטנה של חלבונים המתויגים המסיסים בפורמט תפוקה גבוהה.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

מקור: בקר, ב. ואחרים. בדיקת דיווח פשוטה מבוססת פלואורסצנציה לזיהוי רכיבים תאיים הנדרשים להעברת שרשרת רעל ריצין A (RTA) בשמרים. J. Vis. Exp. (2017).הסרטון הזה מדגים את טיהור חלבון רקומביננטי עם תגית פוליהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיית אפיניטי מבוססת ניקל. הוא מפרט שלבים מרכזיים, כולל פירוק חיידקים באמצעות סוניקציה, הבהרה וסינון של הליזאט, וקשירה סלקטיבית והשחרור של החלבון המטרה באמצעות אימידזול.

 טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור חלבון חיידקי רקומביננטי

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת הכרומטוגרפיה של זיקה לניקל לטיהור אנזימי פירופוספוקינאז המתויגים בהיסטידין מחיידקי Clostridium difficile.

טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של ניקל: טכניקה לטיהור חלבונים רקומביננטיים מתויגים פוליהיסטידין מליזט תאי חיידקים

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

שיטת טיהור הזיקה הטנדם (TAP) שימשה רבות לבידוד קומפלקסים מקומיים מתמצית תאית, בעיקר איקריוטית, עבור פרוטאומיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיטת TAP המותאם לטיהור קומפלקסים מקומיים למחקרים מבניים.

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

בהליך זה, מבוסס על מעטפת המבוססת על DsRed-בסיס להפקת שרף מיוחד בררני ללכידת נוגדנים חד-שבטיים מתמציות צמחים גולמי או סופרנטנמלים של תרבות התאים, כחלופה לחלבון A.

הופעל מקושרת צולבת מקושרת לפיתוח מהיר של שרפים כרומטוגרפיה של אהדה-לכידת נוגדן כמחקר מקרה

מאמר זה מספק הליך לטיהור זיקה של חלבון רקומביננטי אנושי, דש אנדונוקלאז 1 (FEN1), אשר תויג בתג 6X-היסטידין. הפרוטוקול כולל שימוש בשני עמודי יונים מתכתיים משותקים נפרדים לטיהור החלבון המתויג.

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר 

למד שיטת טיהור חלבונים רקומביננטיים בשני שלבים באמצעות תג ביספציפי קטן. הפרוטוקול משתמש בכרומטוגרפיית זיקה עם אלבומין ודומיין Z להשגת טוהר גבוה.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

גלה סרטונים נוספים