Name: באמצעות מערכי LED משתלמת עבור גירוי-תמונה של נוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: למד שימוש במערכי LED לשליטה אופטוגנטית בנוירונים מבוגרים בחלקי מוח. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של ספיי הפעלה ומציעה פתרון חסכוני לחקר נוירוגנזה בוגרת ושילוב נוירונים במעגלים עצביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי חברת ביטוח החיים &quot;AG2R-La-מונדיאל&quot;, Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), את Agence Nationale de la משוכלל ונדיר &quot;ANR-09-NEUR-004&quot; בתוך המסגרת של נוירון ERA-NET &quot; &quot;תוכנית FP7 על ידי הנציבות האירופית, וקרן פסטר. סבסטיאן וגנר נתמך על ידי קרן Letten.

1. כיול אופטי: Power LED מדידת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מערך LED כדי קירור מקורר באופן אקטיבי על ידי מאוורר וגם להדביק זה aparatus / קירור LED על העדשה collimating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלפת מנורה המשמשים brightfield עם תאורה LED / קירור / מאוורר / מנגנון העדשה. מנגנון זה חייב להיות ממוצבת היטב כך קרן LED collimated נוסע בנתיב אופטי ישר לכיוון העדשה הקבל. ודא heatsink / אוהד מעוגנת כהלכה מכנה משותף של המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כונן את מערך LED עם ספק כוח שיכול לתת פולסים מהיר רבועים של הנוכחי. אספקת כוח זה עשוי להיות נשלט על ידי TTL 5V הדופק שמקורם גנרטור הדופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז קרן collimated לאורך השביל אור מוגדר בין הסרעפת שדה העדשה condensor. באופן אידיאלי, קרן LED יהיה מעט תמלא יותר מדי את הסרעפת השדה נפתח במלואו. בדרך כלל, קרן LED collimated חזק יותר שימלא את הצמצם פחות, תפיק מורדואר כוח על חשבון אחידות. ב ההתקנה שלנו הגדלנו אחידות אור על ידי בחירת עדשה collimating כי מוקרן דימוי מורחבת מעט של מערך ה-LED על מטוס המצומד שלה הסרעפת consenser. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג תאורה קולר על ידי התמקדות את הקבל כך את התמונה של הסרעפת שדה (הסרעפת הקרוב ביותר למקור אור) מתמקדת החדר פרוסה (איור 1). רקמה דקה של נייר העדשה יכול לשמש כמסך הקרנה לדמיין את התמונה ממוקדת של הסרעפת בתחום בעומקים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדחה סדרה של pinholes בקוטר ידוע חומר אטום. מקום אחד כזה pinholes קטן על החיישן של מד הכוח אופטי. הנח את מד הכוח על הבמה הדגימה במרכז מד הכוח על התמונה ממוקדת של הסרעפת השדה פשוט על ידי הזזת מד הכוח עד שהוא נותן קריאה מקסימלית. לצרף את מד הכוח בעמדה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי לפתוח את כל הפתחים (הסרעפת aperature ובתחום הסרעפת). באופן שיטתי להעביר את פרוסת המצורפת תא / כוח מטר ביחס lightpath האופטי ולחשב את האחידות של כוח אופטי בתוך השטח המואר. בנה את העלילה אחידות עבור המערכת שלך. אם המיקרוסקופ כשורה קולר עם תאורה ממוקדת במוקד של אובייקטיבי, ההספק המרבי צריך להיות ישירות מתחת ליעד, ואזורים מחוץ להתמקד הזה צריך עכשיו לקבל כמות ידועה של כוח על פי העלילה אחידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל גודל של חריר, לבנות עקומת תקן של כוח אופטי לעומת פני השטח חריר. על ידי התאמת קלט הנוכחי למערך ה-LED, להפיק את עקומת במספר רמות הספק וממנו לחשב את כל עקומת כוח לכל mm2. אם מערך LED היא לשמש עבור אופטיקה תיקון, הקפד להציג אלמנטים אופטיים הדרוש תיקון (מעבים, pinholes ומסננים) לדעת כמה אור מועבר תחת תאורה תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Flipping את מד הכוחמול המטרה, לחשב את עוצמת התאורה ב 470nm כאשר המנורה כספית מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פרוסה לחיות לחדר, ולבנות מחדש את העיקולים על מנת לקבוע את תקן כוח האור המועבר דרך רקמת המוח פיזור. </li></ol> 2. נוהל לחתוך Electrophysiology חלק א: הכנת Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי (60 מ"ג / ק"ג קטמין ו 2mg/kg Xylazine) ו לערוף את העכבר. מנתחים את המוח מלאכותי בנוזל השדרה מוחין (ACSF, במ"מ: 124 NaCl, KCl 3, 1.3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1.25 NaHPO 4, 20 גלוקוז, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, pH 7.4 כאשר בועות בתערובת של O2 95% ו 5% CO 2 5,1), נזהרת שלא לפגוע נורות חוש הריח. הפרד את שתי ההמיספרות ומניחים על אגר עם משטח הגחון אפילו עם קצה אחד (סעיפים אופקי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק אגר פני השטח הגבי של האונה כל קליפת המוח כדי vibratome צ'אק, ולאט לאט למלא את האמבט קר כקרח ACSF. פורסים מפני השטח הגחון ב 300 סעיפים מיקרומטר, העברת כל סעיף כדי התחמם (34-36 ° C) ACSF מחומצן, ולאפשר להם להתאושש במשך 30-45 דקות. </li></ol> חלק ב ': מדידה תיקון Loose הסף את ספייק <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהביא את פרוסות לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, בעדינות במקום פרוסת בחדר הקלטה של ​​החדר תחת מיקרוסקופ טפטוף מתמיד של ACSF מחומצן. בסיכון יתר מגרה נוירונים ChR2 נגוע, בנוכחות EYFP-ChR2 ניתן לאשר תחת epifluorescence (איור 2a) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודות זכוכית על חולץ פיפטה (סאטר P-97). מילוי זה אלקטרודה עם ACSF. כאשר הניח באמבטיה ACSF ההתנגדות טיפ צריך להיות בין 70-10 MOhms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תאורה פלורסנט, לאתר הפרוסה תא עצב בריא ChR2-EYFP עם מורפולוגיה בשלה. כמו כן לאתר סומה של נוירון תחת אופטיקה תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם לחץ חיובי קל עבר קצה האלקטרודה, מנמיכים את האלקטרודה תיקון כלפי הנוירון פלורסנט מזוהה. כאשר איש הקשר קרום מורכב, במהירות לשחרר לחץ חיובי וליישם כמות קטנה וקצרה של יניקה דרך קצה. חותם גיגה אוהם צריך להיעשות בין הממברנה פלזמה קירות אלקטרודה את התיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם אם גיגה חותם לא נוצר, אם האלקטרודה הוא מספיק קרוב פעילות הנוירון פלורסנט spiking צריך לייצר פוטנציאל למדידה בשדה המקומי. הפעל ChR2 בנוירון הזה מהבהב על ידי מינונים שונים של אור. בגלל אור במינון היא פונקציה של כוח הן LED ומשך, לחשב כמה הרבה אור יש צורך לעורר פוטנציאל פעולה בכל כוחות מרובים המשכים (איור 2b). כמו כן לצפות כמה spiking מתרחשת תחת אור מנורת כספית. </li></ol> 3. נציג תוצאות: על מיקרוסקופ שלנו (אולימפוס BX51WI), LED שלנו היא iקו n עם 2 פתחים ו עדשה הקבל, ובכך שמירה על lightpath המקורי של המנורה, מפעל מותקנת קשת. על ידי סגירת שני הסרעפת שדה הסרעפת aperature, אנחנו יכולים להשיג ניגודיות brightfield מספיק מהדק הקלטות התיקון (איור 1b). עם דיאפרגמה כל במלואה לפתוח לנו לחשוף את הפרוסה לשלטון האור המרבית channelrhodopsin ההפעלה (איור 1 א). על מיקרוסקופ שלנו, זו תצורה תיקון מייצרת אור כי צפיפות הוא כ שלושה סדרי גודל נמוך יותר צפיפות השדה המקסימלי מלא (4.1 μW / 2 מ"מ לעומת 6.88 mW / מ"מ 2). אנו רואים תיוג החזקה של גרגיר מבוגר יליד נורת חוש הריח ועל נוירונים periglomerular שבועות לאחר ההדבקה lentiviral של נודדות neuroblasts בזרם נודדות מקורי (איור 2a) הקלטה רופף-תיקון מ יחיד מבוגר יליד ChR2-EYFP להביע תא גרגיר מציינת כי 5 ms גירוי על האימרהאממ כוח (6.88 mW / מ"מ 2) מספיקה כדי לעורר spiking (איור 2b). מאז רמת הביטוי משתנה בין התאים, את כמות האור שעוברת את הסף אל ספייק ישתנו וצריך תיאר סטטיסטית לכל סוג תא של עניין. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. LED הגדרת מערך עבור photostimulation מלא שדה תיקון-clamp electrophysiology פרוסה. כדי להפעיל channelrhodopsin (ChR2) אנו פרוייקט קרן collimated בחזרה דרך פתחים פתוחים אופטיקה מעבה (א). תצורה זו ניתן לשנות לתוך ניגודיות גבוהה אופטיקה תיקון מלא על ידי סגירת הסרעפת שדה רוחב ויסות של הסרעפת שדה (ב). קיצורים: א מאוורר, גוף קירור ב, מערך LED ג, ד collimating העדשה, ה ראי, דיאפרגמה ו שדה, הסרעפת ז הצמצם, העדשה הקבל ח, ט saבשלב mple, י אובייקטיבי. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> באיור 2. מקדימה של פרוסת אופקי 300μm של הנורה חוש הריח של מהדק תיקון כל שדה photostimulation (א). נגוע Lentivirally מבוגר יליד תאים גרגיר להביע ChR2-EYFP ניתן לראות מקרין מליבה של הנורה חוש הריח. האור במינון הנדרש לעורר spiking ניתן למצוא על ידי הגדלת משך הזמן של פלאש LED (ב). סף עבור תא זה היה גרגיר 5ms בעצימות LED מלאה (2.43mW/mm 2). סולם ב (א) = 500μm, היקף (ב) = 50ms.

<ol><li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li>
<li>Apicella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+Cells+in+Piriform+Cortex+Receive+Convergent+Input+from+Distinct+Olfactory+Bulb+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli.</a> Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).</li>
<li>Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature. 8, 1263-1263 (2005).</li>
<li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+the+first+synapse+in+olfaction%3A+development+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis.</a> The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-breakers%3A+optical+technologies+for+probing+neural+signals+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).</li>
<li>Grossman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+optical+excitation+using+ChR2+and+micro-LED+array%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array.</a> Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).</li>
<li>Dhawale, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-redundant+odor+coding+by+sister+mitral+cells+revealed+by+light+addressable+glomeruli+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse.</a> Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).</li>
<li>Weick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+control+of+transplantable+human+ESC-derived+neurons+via+optogenetic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting.</a> Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).</li>
<li>Toni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+born+in+the+adult+dentate+gyrus+form+functional+synapses+with+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells.</a> Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+Localised+to+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment.</a> PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.</li>
<li>Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בשנים האחרונות אנו עדים התפוצצות הפופולריות של כלים optogenetic עבור מחקר המוח 6. כתוצאה מכך, חשוב יותר ויותר כדי להוריד את מחסום הכניסה עבור מעבדות המעוניינים להתחיל להשתמש בכלים חדשים אלה. כאן אנו מתארים כיצד לנהל retrofitting עלות פשוט נמוך כיול של המתקן תיקון-clamp קונבנציונאלי, כך שניתן לעשות שדה מלא גירוי אופטי של channelrhodopsin-לבטא נוירונים. בפרט, אנו מיישמים את הטכניקה הזאת כדי לחקור את חוש הריח של neurogenesis מבוגר נורה במיוחד כדי לשלוט נוירונים שזה עתה נול...

<table><tbody><tr><td>קטמין</td><td>אימאלג' (Imalg)&amp;#232;ne 1000</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>רומפון</td><td></td><td>2%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>&amp;&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHPO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למתיחת פיפטות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150T-10</td><td>קוטר חיצוני 1.5 ממ"ק/קוטר פנימי 1.17 ממ"ק</td></tr><tr><td>מערך LED</td><td>Bridgelux</td><td>BXRA-C2000</td><td></td></tr><tr><td>עדשת קולימציה</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDC1</td><td>קוטר קרן של 40 מ"מ</td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>A1W Electronik</td><td>HKO2800</td><td>2.8 אמפר</td></tr><tr><td>מד מדהור סיבי/אופטי (Optical power meter)</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM 100</td><td></td></tr><tr><td>גוף קירור </td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>מאוורר</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>ויברטום (Vibratome)</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

באמצעות מערכי led משתלמת עבור גירוי-תמונה של נוירונים

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Electrophysiology פרוסה רגילה אפשרה לחוקרים לחקור רכיבים בודדים של המעגלים העצביים על ידי הקלטה התגובות החשמלית של תאים בודדים בתגובה 1,2 מניפולציות חשמלי או תרופתי. עם המצאת שיטות בקרה אופטית נוירונים ממוקד גנטית (optogenetics), חוקרים כעת יש רמה חסרת תקדים של שליטה על קבוצות ספציפיות של נוירונים בהכנת פרוסה רגילה. בפרט, רגישים channelrhodopsin-2 (ChR2) מאפשר לחוקרים להפעיל נוירונים עם 3,4 אור. על ידי שילוב של כיול מדוקדק של photostimulation מבוססי LED של ChR2 עם electrophysiology פרוסה סטנדרטיים, אנו מסוגלים בדיקה עם בפירוט רב יותר את תפקיד המבוגר יליד interneurons ב הנורה חוש הריח, את ממסר המרכזי הראשון של מערכת חוש הריח. שימוש בביטוי ויראלי של ChR2-YFP במיוחד מבוגר, יליד נוירונים, אנחנו יכולים לשלוט באופן סלקטיבי צעיר מבוגר, יליד הנוירונים בסביבה של מבוגריםד נוירונים בוגרים. שליטה אופטית שלנו משתמשת במערכת LED פשוט וזול, ואנחנו מראים כיצד מערכת זו יכולה להיות מכויל כדי להבין איך הרבה אור היא צריכה לעורר spiking פעילות נוירונים בודדים. לפיכך, הבזקים קצרים של אור כחול יכול לשלוט מרחוק את דפוס ירי ChR2-transduced תאים שזה עתה נולד.

למבוגרים יליד נוירונים להביע ChR2 ניתן לטפל בהכנות פרוסה אלקטרו על מנת לבחון את תרומתם כלפי פונקציה של מעגלים עצביים חוש הריח.

באמצעות מערכי LED משתלמת עבור גירוי-תמונה של נוירונים

אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטית של פרוסות אפשרה לחוקרים לבחון רכיבים בודדים של מעגלים עצביים על ידי הקלטת תגובות חשמליות של...

מטרת פרוצדורה זו היא להכין ולהפעיל מרחוק מערכי LED כדי לשלוט בפעילות עצבית בחתכי מוח. הדבר מבוצע באמצעות חתכים in vitro מבעלי חיים המבטאים channel REDSIN two בנוירונים, ובשימוש במערך LED בשילוב עם מיקרוסקופ כדי להפעיל נוירונים אלו. סרטון זה עוסק באופן כיול של LED ומיקרוסקופ כדי לספק עצימות אור ידועה לתא החיתוך.באמצעות מערך זה, ניתן למדוד במדויק את ספי תגובת ההפעלה של נוירונים המבטאים את ערוץ שתיים בתגובה לגירוי אור, וזאת באמצעות גירוי בשדה רחב של נוירונים המבטאים את אופסין ערוץ שתיים. טכניקה זו מאפשרת בקרה אופטית מדויקת זמנית של אוכלוסייה נוירונלית גדולה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אופטוגנטיות קיימות, כולל כאלו המשתמשות בלייזרים או בשיטות מבוססות תריס, הוא עלותה הנמוכה מאוד והעובדה שניתן להתאימה בקלות למיקרוסקופ patch clamp קיים.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוגנזה במבוגרים, כולל השאלה כיצד פעילות מעצבת את השילוב של נוירונים חדשים במוח הבוגר. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות עד לטיפולים או לאבחונים המבוססים על תאי גזע עצביים בבגרות, שכן היא מציעה בקרה זמנית מדויקת על פעילותם של נוירונים שנולדו בבגרות המשתלבים במעגלים עצביים קיימים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההשלכות התפקודיות של נוירוגנזה במבוגרים, ניתן לבצעה גם בכל הכנה in vitro.נוירונים המבטאים אימוץ ערוצים המכילים. התחל בבחירת מערך LED המפיק את שיא העוצמה שלו באורך הגל הרצוי. בנוסף, בחר את המערך בעל דירוג הזרם המקסימלי. שלב את מערך ה-LED במיקרוסקופ.התחילו בחיבור מערך ה-LED למאוורר המשמש כגוף קירור (heat sink) באמצעות משחה תרמית כדי להגביר את יעילות גוף הקירור. לאחר מכן, הסירו את נורת ה-LED המקורית בעלת ההספק הנמוך ממכלול העדשה שלה וחברו את נורת ה-LED בעלת ההספק הגבוה יותר לעדשה. כעת החליפו את מנורת השדה המואר (Brightfield) במערכת ה-LED שהורכבה, וודאו שהמאוורר מקושר באופן מאובטח להארקה המשותפת של המערכת.מיקום מדויק של מערכי ה-LED נחוץ כדי להבטיח שקרן האור תהיה בקו אחד עם העדשה. יש להשיג תאורת קולר (Kohler illumination) על ידי מיקוד המעבה כך שדמותו של הסרעפת השדה תהיה ממוקדת בתא הפרוסות וממורכזת תחת נתיב האור של העדשה. פיסת נייר עדשות דקה יכולה לסייע במיקוד דמות המפתח האחורי בעומקים אחרים.כעת, קדחו חורי סיכה בקטרים ידועים בחומר אטום שיכול לשמש כמפתח (aperture) עבור מד ההספק. הניחו את אחד מחורי הסיכה הקטנים הללו מעל החיישן של מד ההספק האופטי. לאחר מכן, קבעו את מד ההספק למיקרוסקופ כדי למקד את המקונדנסור על חור הסיכה.מקם ידנית את מד העוצמה עד לקבלת קריאה מקסימלית. קבע את מד העוצמה במיקום זה. אם הערך המקסימלי במד העוצמה נמצא מעל למישור הפרוסה, הגדר מחדש את תאורת קולר (Kohler illumination) במישור זה.בשלב הבא, פתחו לחלוטין את כל המפתחים. הזו את מד ההספק באופן שיטתי ביחס לנתיב האור האופטי באמצעות מניפולטורי הבמה. עם הסיום, מדדו את אחידות ההספק האופטי בתוך האזור המואר על ידי נטילת קריאות הספק שיטתיות בסריג סביב ההספק המקסימלי, אשר אמור להימצא תחת המוקד של העדשה. כאשר המיקרוסקופ מוגדר כראוי עם תאורה מקוררת הממורכזת במוקד העדשה, ההספק המקסימלי של המערך אמור להיות באזור מוקד זה; אזורים מחוץ למוקד אמורים כעת לקבל כמות ידועה של הספק בהתאם לתרשים האחידות.כעת, מדדו את ההספק המקסימלי עבור כל גודל של חור סיכה (pinhole). בידע על קוטר המקדח ששימש ליצירת כל חור סיכה, שרטטו את ההספק האופטי כפונקציה של שטח חור הסיכה. מכיוון שחורי הסיכה שנקדחו אינם מושלמים, מיצוע של ערכים אלו יניב הערכה טובה של צפיפות ההספק האופטי. מערך ה-LED ישמש לתיקוני אופטיקה.ודאו שאתם לוקחים בחשבון את כל האלמנטים האופטיים הדרושים לביצוע ה-patch בעת בניית גרף ההספק וגרף האחידות. לדוגמה, במיקרוסקופים רבים ישנו מסך דיפוזר (diffuser screen) שניתן להטות ולהשתמש בו, אשר יקריב הספק לטובת אחידות. הכינו פרוסות רקמת מוח בשיטות סטנדרטיות, ובזמן שאתם מאפשרים לפרוסות להתאושש במשך 30 עד 45 דקות ב-A CSF מחומם, הכינו את פיפטות ה-patch.לאחר שהרקמות התאוששו, מקמו בעדינות פרוסה בתא ההקלטה של המיקרוסקופ תחת פרפוזיה רציפה של A CSF מחומצן. ודאו את נוכחותם של ערוצי EYFP ו-redsin בשני הערוצים באמצעות פלואורסצנציית epi תחת תאורה פלואורסצנטית. אתרו בפרוסה נוירון EYFP בריא בערוץ שני בעל מורפולוגיה בוגרת.לאחר מכן, אתרו את סומת הנוירון תחת אופטיקת ה-patch וצרו אטום של giga ohm בין ממברנת הפלזמה לדפנות של אלקטרודת ה-patch. אם האלקטרודה סגורה מספיק כלפי נוירון בעל פוטנציאל פעולה (spiking neuron), פעילות ספונטנית אמורה להפיק פוטנציאל שדה מקומי מדיד גם ללא אטום של giga ohm. כעת, הפעילו את channel opsins 2 בנוירון זה על ידי הבהוב של מינונים שונים של אור; מכיוון שמינון האור הוא פונקציה של הספק ה-LED ושל משך הזמן, חשבו כמה אור נדרש כדי לעורר פוטנציאל פעולה עבור מספר ערכי הספק ומשך זמן.מיקרוסקופ Olympus BX 51 wi הוגדר עם LED בקו אחד עם שתי מחיצות (apertures) ועדשת קונדנסור. ניגודיות שדה בהיר (brightfield) מספקת להקלטת patch clamp הושגה על ידי סגירת דיאפרגמת השדה ודיאפרגמת הצמצם. תרשים אחידות של עוצמת אור ה-LED נבנה באזור סביב שדה הראייה של העדשה, כפי שסומן באמצעות העיגול המקווקו.כאשר כל הדיאפרגמות פתוחות לחלוטין, הפרוסות נחשפו לעוצמת אור מקסימלית לצורך הפעלת ה-channel adoptin. תצורה זו מייצרת אור העוצמתי פי שלושה סדרי גודל מהתצורה המשמשת לוויזואליזציה של patch clamp. סימון נרחב של נוירוני גרנול ונוירונים פרי-גלומרולריים שנולדו בבגרות בבצל האפוף נצפה ארבעה שבועות לאחר זיהום לנטיבירי של נוירובלסטים נודדים בזרם ההגירה הרוסטרלי (rostral migratory stream).הקלטות patch רפויה (loose patch) מערוץ בודד של תא גרנולר המבטא EYFP ו-Adoptin הצביעו על כך שעבור נוירון זה, גרייה של חמישה מילי-שניות בעוצמה מרבית הספיקה כדי לעורר פריקה (spiking). ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה במהלך אחר צהריים אחד. חשוב לזכור לאחר הליך זה לנטר תמיד את הציוד ואת ההגדרות כדי לוודא שאין סחיפה (drift) לאורך זמן. מאז פיתוחן, טכניקות אופטוגנטיות אלו סללו את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לחקור תמסירה ואינטגרציה סינפטית במספר אורגניזמי מודל, כגון תולעת, זבוב, עכבר ואפילו פרימטים.

using-affordable-led-arrays-for-photo-stimulation-of-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

סרטון זה מדגים הליך לניתוח קישוריות סינפטית בין קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) לבין נוירוני אמיגדלה באמצעות פרוסות מוח אמיגדלה חריפות מעכברים. תאי העצב קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית בעכברים אלה מבטאים צ'נלרודופסין שהתמזג עם חלבון פלואורסצנטי. הצ'אנלרודופינים מאפשרים זרימת יונים ויצירת פוטנציאל פעולה בנוירונים קליפתיים קדם-מצחית קדם-מצחית האמצעית עם הפעלת האור. כתוצאה מכך, נוירוני קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית משחררים מוליכים עצביים שנקשרים לנוירוני אמיגדלה פוסט-סינפטיים, ומפעילים זרמים...

הדמיה ומיפוי של מסלולים עצביים בפרוסת מוח של אמיגדלה

הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

כאן אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יציבות ומבודדות היטב של יחידה אחת מאינטרנוירונים מעכבים שזוהו בקליפת המוח של העכבר המורדם. תאי עצב המבטאים ChR2 מזוהים על ידי תגובתם לאור כחול. השיטה משתמשת בציוד הקלטה חוץ-תאי סטנדרטי, ומשמשת כחלופה זולה להדמיית סידן או תיקון מונחה חזותית.

מדריך ל בשנת vivo הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

מתוארת שיטה לגירוי פעילות חשמלית של תרביות תאים במבחנה עם אור נראה, המבוססת על שימוש בפולימרים אורגניים מוליכים למחצה.

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

בלב, אירועים מולקולריים לתאם את פונקצית חשמל התכווצות של האיבר. סט של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה מקומיות הציגו כאן מאפשר ההקלטה של ​​משתני הסלולר לבבות שלמים. זיהוי מנגנונים בהגדרת תפקוד הלב הוא קריטי להבנה כיצד הלב עובד תחת מצבים פתולוגיים.

בשדה מקומי מיקרוסקופ פלואורסצנטי: הדמיה איתותי הסלולר לבבות שלמים

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים אופטוגנטיים לבקרת ביטוי גנים באור אדום ואדום רחוק באמצעות PhyB ו-PIF3. כלולות הוראות שלב אחר שלב לבניית מערכת תאורה פשוטה וגמישה, המאפשרת שליטה על ביטוי גנים או אופטוגנטיקה אחרת באמצעות מחשב.

בניית מערכת תאורה פשוטה ומגוונת לניסויים אופטוגנטיים

כאן אנו מציגים את שיטת הייצור של מערכת אופטרודה עם סיבים אופטיים להעברת אור ומערך אלקטרודות להקלטה עצבית. ניסויי In vivo עם עכברים מהונדסים המבטאים את channelrhodopsin-2 מראים את ההיתכנות של המערכת לגירוי אופטוגנטי סימולטני ורישום אלקטרופיזיולוגי.

מערך Optrode לאפנון אופטוגנטי סימולטני והקלטה עצבית חשמלית

ההתפתחויות האחרונות בחקר הכאב מדגישות את הפוטנציאל של פוטונוירומודולציה באמצעות דיודות פולטות אור ירוק (GLED) כטיפול לא תרופתי. GLED מווסת את מסלולי הכאב, ומציע הקלה יעילה בכאב. מאמר זה נועד לתקנן ולחדד את פרוטוקולי החשיפה ל-GLED, לשפר את העקביות במחקרים ולקדם את היישום הקליני של טיפול זה.

אופטימיזציה של טכניקות פוטו-נוירומודולציה כדי להעריך את תפקידן של דיודות פולטות אור ירוק בניהול כאב

למד שימוש במערכי LED לשליטה אופטוגנטית בנוירונים מבוגרים בחלקי מוח. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של ספיי הפעלה ומציעה פתרון חסכוני לחקר נוירוגנזה בוגרת ושילוב נוירונים במעגלים עצביים.

באמצעות מערכי LED משתלמת עבור גירוי-תמונה של נוירונים

גלה סרטונים נוספים