Name: Electroporation של Mesenchyme Craniofacial (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למד את שיטת האלקטרופורציה להזרקת מולקולות טעונות למזנכימה קרניו-פאציאלית בזחלי Xenopus laevis בשלב 28. שיטה זו מאפשרת מניפולציה מדויקת של רקמות פנים וגולגולת בתהליך ההתפתחות העוברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ננסי Papalopulu ואת בויאן Bonev לסיוע עם electroporation Xenopus. אנו מודים גם מארק את דיון על קריאה ביקורתית, ג&#39;רמי גרין וג&#39;ון שוולינגפורד לדיונים וחברי מועיל של המעבדה ליו על תמיכתם. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של BBSRC (BB/E013872/1) ואת האמון Wellcome (081880/Z/06/Z) כדי KJL.

חלק 1 א. ציוד מיקרוסקופ: היקף סטריאו לנתח זקוף במטרה צריכת חשמל נמוכה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתח / Pulse Generator: BTX ECM 830 מערכת כיכר electroporation Wave </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה חולץ: P-87 micropipette פולר (החברה סאטר Instrument, CA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Manipulator: גס, או בשילוב גס קנס תלוי בהכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעל micropipette: כלים המדע פיין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה: תוצרת בית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation קאמרית: תוצרת בית </li></ul> בצורת אלקטרודות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור 8 ס"מ של טוהר גבוהה 0.4 מ"מ תיל טונגסטן (גודפלו) ו להטביע את נקודת האמצע מזרק 1ml באמצעות מרק (אנו משתמשים Blu-Tack). השאירו 4 טונגסטן ס"מ חוט חשוף מקצה המזרק ואת קצה לכופף לצורה-L, 1 ס"מ מהקצה (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך קצה, כך בסופו של דבר באמצעים 0.5 מ"מ אורך. Tהטיפ שלו הוא הסופית אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה מקבילה עודף תיל טונגסטן כדי מזרק ולהשתמש בו כדי לחבר את מחולל דופק אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך קבלת זוג אלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף אלקטרודות מחולל גל מרובע הדופק באמצעות כבלים DC. </li></ol> Electroporation קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השורה התחתונה של צלחת 90 ​​מ"מ עם פלסטלינה ~ 5 רעיל מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צלחת עם התקשורת electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מס '5 מלקחיים של שען לגלף היטב בצורת האות T (איור 2). גם ארוך צריך למדוד ~ 2 מ"מ x 2 מ"מ x 10 מ"מ קצר ~ 2 מ"מ x 2 מ"מ x 5 מ"מ. המנה electroporation ניתן לכבס ולעשות בהם שימוש חוזר. </li></ol> חלק 1B. ריאגנטים דנ"א או מקרומולקולות טעונה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipettes: 1 מ"מ רחב 4 "ארוך בורוסיליקט זכוכית נימים (WPI, TW100-F) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התקשורת: רגיל אמפיבי מדיה (NAM) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &gt; 10 X במלאי: 1100 mM NaCl, 20KCl mM, 10 mM Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 X NAM: מדולל מתוך המאגר 10x מניות, עם 0.1 מ"מ NaHCo 3 ו - 0.2 mM Na 3 PO 4. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Xenopus laevis ראשנים, שלב 28 </li></ul> ה-DNA הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פלסמידים ביטוי תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend DNA לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μl ב nuclease חינם H 2 0. </li></ol> * יש לנו הצלחה עם וקטורים המכיל מקדם חזק CMV, כגון pCS2 + [16]. לניתוח השושלת, אנחנו בדרך כלל כוללים DNA קידוד חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP pCS2 +) בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl. [ריכוזי ה-DNA בין 0.1-3 מיקרוגרם / μl נבדקו גם. מצאנו כי ריכוזים מתחת 0.8 מיקרוגרם / μl תאים שכותרתו יעיל, בעוד ריכוזי DNA יותר מ 2 מיקרוגרם / &amp; Mu; אני לא לשפר את יעילות electroporation]. Morpholino oligonucleotide הכנה: (הערה:. MOS צריך להיות fluoresceinated (3'-carboxyfluorescein שונה) או טעונים אחרת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend morpholino oligonucleotides (MOS) (Genetools, <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a> ) בריכוז של 2 מ"מ ב nuclease חינם H 2 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot חום של פתרון המניה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הריכוז הסופי של mM 0.5 במים nuclease חינם. </li></ol> * 0.1-1mm MO פתרונות נבדקו. 0.5 mM פתרונות MO היו מספיק electroporation של תאים mesenchymal רבים. Micropipettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן micropipettes מ בורוסיליקט זכוכית נימים (1 מ"מ רוחב, 4 "ארוך, WPI לא. TW100-F). השתמש חולץ מחט להכין micropipettes עם להתחדד ארוך 8-12 מ"מ טיפ נאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראש קצה ~ 2 מ"ממקצה באמצעות מלקחיים, יצירת לשבור משוננים. </li></ol> מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת דגירה: הכן טרי 3 / 4 רגילה אמפיבי מדיה (NAM) ממלאי 1x. הוסף 0.025 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת electroporation: כאמור לעיל, עם 0.1% בנזוקאין (סיגמא, 06950). </li></ol> 2. Electroporation Micropipette ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו micropipette עם פתרון 1 ~ הזרקת μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure micropipette ב micromanipulator ומתחברים microinjector (Picospritzer II). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זווית micropipette ב 50 ° מן השולחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הלחץ הזרקה ב 20 PSI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול micropipette להזריק 30 nl לכל הדופק. </li></ol> ראשן הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 28 הבמה הזחלים Xenopus ידי דוגרים בתקשורת electroporation במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הראשנים מרדים לתוך תא electroporation מלא התקשורת electroporation. מיקום העוברבתוך הארוך גם כך הראש נח צומת הטי עם הצד הגבי למטה בצד הגחון חשוף. הראש צריך להיות מוגבה מעט לעומת הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות מאובטח הראשן היטב עם הסובבים פלסטלינה. (הערה:.. אם הראשן אינו מאובטח, הוא עשוי להתעוות מגע אלקטרודה במהלך electroporation במקרה זה לבטל את ראשן כמו רקמות הפנים ייפגעו קשות) </li></ol> Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת טיפ micropipette האחורי מיד בלוטת מלט לתוך mesenchyme הפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 30 פתרון nl לתוך mesenchyme. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette לסגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ליישר טיפים אלקטרודה במקביל הראש של העובר (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 8 50 ms, קטניות 20mV רבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת אלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ובזהירות לשחרר הראשן מבאר ולהעביר 3 / 4 NAM, 0.025 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הראשנים ניתן מודגרות ב 3 / 4 NAM, 0.025 מ"ג / מ"ל ​​overnight, או יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך עוברים electroporation יעיל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 24 שעות. </li></ol> 3. נציג תוצאות: השימוש מולקולות ניאון מאפשר סינון קל של עוברים electroporated. איור 4 מראה טיפוסי של אצווה MO electroporated הראשנים ~ 12, 48 ו - 96 שעות לאחר electroporation, מודגרות על 14.5 ° C. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, MOS ניתן דמיינו מיד לאחר electroporation ו להימשך מספר ימים לאחר electroporation. מניסיוננו, הקרינה מתבטא בחולשה בשלב 46 (~ 5 ימים לאחר מכן). ב סחוסים, הקרינה פוחתת באופן דרמטי לאחר תחילת התמיינות (~ רח' 42), אולם MO הקרינה נמשכת חזק יותר סוגי תאים אחרים כגון האנדודרם בלוע. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה כי oligonucleotides משולבות רקמות craniofacial מספר כולל סחוס. Oligonucleotide פלואורסצנציה גלעתים קרובות להיות דמיינו ברקמות משני צדי הראש. זהו כנראה עקב דיפוזיה מהירה של הפתרון הזרקת ברחבי mesenchyme craniofacial משוחרר לפני electroporation. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg"> איור 1 אלקטרודות ביתי. בצורת תיל טונגסטן מצורף מזרק 1 מ"ל באמצעות חומר רעיל או מרק. (א) אלקטרודה הסופית אמצעים 5 מ"מ. (ב) צרף זוג אלקטרודות, כך Termini לרוץ במקביל. אלקטרודות מחוברות על ידי גנרטור הדופק כבלים DC. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg"> איור 2 קאמרית electroporation. (א) 90 מ"מ צלחת מרופדת פלסטלינה מלא מדיה תא T בצורת חרוט עם מלקחיים לא שען של 5. (ב) צד ארוך צעדים 2 מ"מ X 2 מ"מ X10 מ"מבעוד צעדים קצרים 2 מ"מ X 2 מ"מ X 5 מ"מ. ראש העובר מונח בצד, T-בצומת עד הגחון. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg"> איור 3 הממחישות סכמטי הליך electroporation. 28 סנט הראשן ממוקם בתא electroporation, בצד הגחוני למעלה. Micropipette מוכנס לתוך הפנים בלוטת מלט הבסיסית mesenchyme. להזריק. Micropipette יוסר בצורת אלקטרודות מיושרים במקביל משני צדי הראש. החל eight 50 מילישניות, 20 mV פולסים מרובעים. לסגת אלקטרודות. לגדל ראשנים לשלבים הרצוי. Visualise MOS או ביטוי של GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg"> איור 4 ראשנים נציג 12 (א), 48 (ב) ו 96 (ג) שעות electroporation פוסט (שלבים 30, 34 ו 44 בהתאמה). ("-B") פלורסנט MO ניתן דמיינו בתוך mesenchyme craniofacial בבית צביes 30 ו 34. Fluorescence ניתן להבחין סחוסים בשלב 44 (ראש חץ, C'-C "). במעיים היא autofluorescent מאוד.

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li>
<li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li>
<li>Falk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Electroporation+in+vivo+within+the+Intact+Developing+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).</li>
<li>Kuriyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tsukushi+controls+ectodermal+patterning+and+neural+crest+specification+in+Xenopus+by+direct+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22of+BMP4+and+X-delta-1+activity.+Development%22%5BJournal%5D)">Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation.</a> of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).</li>
<li>Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+effective+gene+knock-down+in+early+chick+embryos+using+morpholinos+but+not+pRFPRNAi+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors.</a> Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).</li>
<li>Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> Embo. J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109, 205-216 (2002).</li>
<li>Grossin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+rat+articular+cartilage+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation.</a> Faseb. J. 17, 829-835 (2003).</li>
<li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li>
<li>Takahashi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+cathepsin+K+in+synovium+leads+to+progression+of+osteoarthritis+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits.</a> Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).</li>
<li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens%3A+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
</ol>

המחברים אין ניגוד אינטרסים.

בסרטון הזה, אנחנו הדגימו את ההיתכנות של משלוח electroporation בתיווך גנים לתוך mesenchyme הפנים של Xenopus ראשנים. בגישה זו, אנו יכולים לעקוף את השפעות ההתפתחות המוקדמים של מניפולציה תפקוד הגן מאפשר לנו למקד רקמות ספציפיות בנקודות זמן מאוחר יותר. המחקרים שלנו מראים כי באוכלוסיות הטרוגנית של תאים mesenchymal craniofacial יכול להיות מושפע, מאפשר לנו לבחון את שושלת היוחסין של תאים electroporated כמו גם דרישות אוטונומי התא חלבונים של עניין. בשילוב עם הדמיה לחיות, אנחנו יכולים להשתמש בגישה זו כדי לחקור תפקוד גנים, במשך הזמן, במהלך ההתפתחות craniofacial. שיטה זו מדגישה את הרומן נהילות של Xenopus לחקר organogenesis. אנו צופים כי בשיטה זו ניתן להתאים באופן כללי ללמוד המורפוגנזה והבחנה של רקמות אחרות.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

electroporation של mesenchyme craniofacial

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation היא שיטה יעילה של אספקת DNA ו מקרומולקולות טעונים אחרים לרקמות בנקודות זמן מדויק במקומות מדויקים. לדוגמה, electroporation שימש בהצלחה רבה ללמוד ההתפתחות העצבית ואת רשתית ב Xenopus, עוף עכבר 1-10. עם זאת, חשוב לציין כי כל המחקרים הללו, החוקרים לא היו המיקוד הרקמות הרכות. כי אנו מעוניינים בפיתוח craniofacial, התאמנו שיטה למקד mesenchyme הפנים. כאשר חיפשנו את הספרות, גילינו, להפתעתנו, דיווחים מעטים מאוד מוצלח של העברת גנים לתוך רקמת סחוס. רוב המחקרים הללו היו מחקרים ריפוי גנטי, כגון משלוח siRNA או החלבון לתוך שורות תאים chondrogenic, או במודלים של בעלי חיים של דלקת פרקים 11-13. במערכות אחרות, כגון עוף או עכבר, electroporation של mesenchyme הפנים כבר מאתגר (communicat אישייונים, מחלקת פיתוח Craniofacial, KCl). החוקרים שיערו כי electroporation לרקמות procartilaginous ו סחוסי ב Xenopus יכול לעבוד טוב יותר. במחקרים שלנו, אנו מראים כי העברת גנים לתוך סחוסים הפנים מתרחשת ביעילות בשלבים מוקדמים (28), כאשר primordium הפנים מורכבת עדיין של רקמות רכות לפני בידול הסחוס. Xenopus היא מערכת החולייתנים נגיש מאוד לניתוח של פיתוח craniofacial. מבנים Craniofacial הם בקלות רבה יותר גלוי Xenopus מאשר כל מודל חוליות אחרים, בעיקר משום עוברי Xenopus הן מופרות באופן חיצוני, דבר המאפשר ניתוח בשלבים המוקדמים, והקלה על הדמיה ברזולוציה לחיות תא בודד, כמו גם שימוש חוזר של 14 אמהות. בין הדגמים חוליות פיתוח חיצונית, Xenopus שימושית יותר לניתוח craniofacial מאשר דג הזברה, כמו זחלים Xenopus הם גדולים יותר, קל יותר dissect, ובאזור הפנים פיתוח נגיש יותר מאשר באזור הדמיה המקבילה דגים. בנוסף, Xenopus היא אבולוציונית קרוב יותר לבני אדם מאשר דג הזברה (~ 100 מיליון שנה קרובה) 15. לבסוף, בשלבים אלה, ראשנים Xenopus הם שקופים, והביטוי מקביל של חלבונים או מולקולות ניאון תאפשר ראיה קל של הסחוסים מתפתחות. אנו צופים כי גישה זו תאפשר לנו במהירות וביעילות מבחן מולקולות מועמד במערכת מודל vivo.

הסחוסים Craniofacial לפתח בקשר הדוק עם רקמות אחרות וקשה לתפעל חיות לחיות. אנחנו משתמשים electroporation לספק כלים מולקולריים במהלך הצמיחה של השלד craniofacial תוך עקיפת תופעות העוברית המוקדמת. גישה זו תאפשר לנו לבחון ביעילות מולקולות מועמד<em&gt; In vivo.</em

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

אלקטרופורציה היא שיטה יעילה להחדרת DNA ומולקולות טעונות גדולות אחרות לרקמות בנקודות זמן מדויקות ובמיקומים מדויקים.

המטרה הכללית של הליך זה היא להחדיר באמצעות אלקטרופורציה מקרו-מולקולות טעונות לתוך המזנכימה הקרניו-פציאלית. זאת על ידי מיקום ראשוני של עובר בשלב 28 תחת הרדמה בתוך תא האלקטרופורציה. השלב הבא הוא הזרקה מיקרוסקופית של התמיסה המכילה את המקרו-מולקולות הטעונות לתוך המזנכימה הקרניו-פציאלית ב-C.מיד לאחר מכן מופעל זרם חשמלי, ובכך מוכנסים הנוקלאוטידים הטעונים לתוך התאים. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הדמיה של הרקמה שעברה אלקטרופורציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שינויים ברקמות הפנים הגולגולתיות.ניתן לנתח תוצאות אלו in vivo או ברקמה מקובעת באמצעות פלואורסצנציה, מיקרוסקופיה או אימונוהיסטוכימיה. היתרון העיקרי של אלקטרופורציה על פני שיטות קיימות כגון מיקרו-הזרקה ומוטציה הוא השליטה הרקמתיות והזמנית בכלים המולקולריים שלנו; את הפרוצדורה נדגים היום ג'קי טבלר (Jackie Tabler), פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי. זוג האלקטרודות בצורת L הדרושות לפרוצדורה זו עשויות מחוט טונגסטן בטוהר גבוה בעובי 0.4 millimeter; עבור כל אלקטרודה, חתכו תחילה שמונה סנטימטרים מהחוט.לאחר מכן, השתמשו בחומר דביק כגון blue tack כדי לקבע מזרק של one milliliter בנקודת האמצע של תיל הטונגסטן, כך שארבעה centimeters של התיל יישארו חשופים מקצה המזרק. כופפו את הקצה לצורת L במרחק של one centimeter מהסוף. קצצו את הקצה כך שאורכו יהיה 0.5 centimeters.קצה זה הוא הדגם של האלקטרודה; העבירו את שארית תיל התונגסטן במקביל למזרק. הוא ישמש לחיבור מחולל פולסי האלקטרודה לאחר ייצור האלקטרודה השנייה. הדביקו את זוג האלקטרודות זו לזו באמצעות סרט דביק, כך שחיבורי האלקטרודות יעברו במקביל, במרחק של סנטימטר זה מזה.לבסוף, חברו את האלקטרודות למחולל פולסים של גל ריבועי באמצעות כבלי DC. כדי להכין את תא האלקטרופורציה המותאם אישית, רפדו את תחתיתו של צלח בנפח 90 מילימטר עם כחמישה מילימטרים של חימר למידול מסוג plaster scene שאינו רעיל. מלאו את הצלח בתמיסת אלקטרופורציה כך שסביב חומר המידול יהיה טבול.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה של שעונים מספר 5 כדי לח刻 בתוך סצנת הגבס באר בצורת T ליצירת האלקטרופורציה. הצד הארוך של הבאר צריך למדוד כ-2 mm על 2 mm על 10 mm, והצד הקצר צריך להיות 2 mm על 2 mm על 5 mm. מיקרו-פיפטים להליך זה עשויים מקפילריות של זכוכית סיליקט.השתמשו במכשיר למשיכת מחטים (needle puller) כדי להכין מיקרופיפטים עם קונוס באורך של 8 עד 12 מילימטרים וקצה דק; מעכו את הקצה במרחק של כשני מילימטרים מהקצה באמצעות פינצטה, כדי ליצור שבירה משוננת להכנת המיקרופיפט. ראשית, מלאו אותו בכשמיקרוליטר אחד של תמיסת הזרקה, שבהדגמה זו מכילה אוליגנוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית. לאחר מכן, קבעו את המיקרופיפט במיקרו-מניפולטור והטו את המיקרופיפט בזווית של 50 מעלות ביחס לשולחן העבודה.הגדירו את לחץ ההזרקה ל-20 PSI וכיילו את המיקרופיפט להזרקת 30 liters לכל פולס. כהכנה לאלקטרופורציה, הרדימו זחלי xeno בשלב 28 על ידי הדגרה למשך חמש דקות. העבירו את השבב המורדם אל תא האלקטרופורציה בתוך מדיום אלקטרופורציה, שהוא מדיום דו-מינתיים רגיל המכיל 0.1% Benzocaine.המלא במדיום לאלקטרופורציה. החלק המאתגר ביותר בפרוצדורה הוא החדרת המיקרו-פיפט לתוך השבב. לכן, כדי להבטיח הצלחה, יש לקבע את העובר בחוזקה רבה ואז להפעיל במהירות את הזרם לאחר ההזרקה המיקרוסקופית.מקם את העובר בתוך הבאר הארוכה כך שהראש ינוח בצומת ה-T. כאשר הצד הגבי פונה כלפי מטה והצד הבטני חשוף, והראש מורם מעט ביחס לזנב, קבע בעדינות את השפנפן בבאר באמצעות הגבס שמסביב. חשוב לקבע את השפנפן כדי למנוע ממנו להתכווץ במהלך האלקטרופורציה, מה שעלול להוביל לנזק חמור לרקמות הפנים.כדי להתחיל בהליך זה, הכניסו את קצה המיקרו-פיפט מיד מאחורי בלוטת הצמנט (cement gland) אל תוך הרקמה הפציאלית. הזריקו 30 nanoliters של תמיסה אל תוך המזנכימה, והסירו את המיקרו-פיפט. יישרו במהירות את קצות האלקטרודות במקביל לראש העובר, והפעילו שמונה פולסים ריבועיים של 20 millivolt למשך 50 millisecond כל אחד.לאחר מכן, השב את האלקטרודות באמצעות פינצטה. שחרר בזהירות את השבב מהבאר. לאחר מכן, השתמש בפיפט כדי להעביר את השבב ל-threequarter nom בריכוז 0.025 mg/mL.ניתן להדגיר את השבבים שעובדו עם Gentamycin במצע זה למשך לילה או לפרק זמן ארוך יותר לאחר 24 שעות. יש לסנן את השבבים באמצעות מיקרוסקופיה פלורסצנטית כדי לוודא פרוקטורציה יעילה. השימוש במולקולות פלורסצנטיות מאפשר סינון קל שלו של העוברי שעברו אלקטרופורציה.איור זה מציג קבוצה טיפית של ראשניות שעברו אלקטרופורציה של מורפו-אוליגונוקלאוטידים כ-48 ו-96 שעות לאחר האלקטרופורציה, בשלבים 30, 34 ו-44 בהתאמה. ניתן להבחין במורפו-אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים בתוך הרקמה הקרניו-פציאלית בשלבים 30 ו-34.בשלב 44 ניתן לזהות פלואורסצנציה בסחוסים המסומנים על ידי ראשי החיצים הלבנים. האזור בעל האוטופלואורסצנציה הגבוהה הוא המעי. בעקבות הליך זה, ניתן לעקוב אחר השושלת של תאי electro וכן אחר הדרישות המולקולריות לחלבונים רלוונטיים.ניתן לשלב גישה זו עם טכניקות של דימוי חי כדי לחקור תפקוד גנים לאורך זמן במהלך ההתפתחות הקראניו-פציאלית.

electroporation-of-craniofacial-mesenchyme

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תא בודד electroporation (SCE) היא טכניקה מיוחדת המאפשרת משלוח של ה-DNA או מקרומולקולות אחרים לתוך תאים בודדים בתוך הרקמה בשלמותה, כולל ההכנות vivo. כאן אנו בפירוט את הליך SCE של פלורסנט לצבוע או פלסמיד דנ"א לתוך הנוירונים במוח שלם של laevis Xenopus הראשן.

תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות...

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.

Electroporation שטח pial ילודים

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

כפול בתוך הרחם מאפשר מיקוד אוכלוסיות תאים כי הם מופרדים באופן זמני. טכניקה זו שימושית כדי להמחיש אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים אלה באמצעות חלבונים פלורסנט בתנאים נורמליים, אך גם לאחר ניסויים פונקציונליים כדי perturb גנים של עניין.

כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב אלקטרופורציה in vivo וניתוק עצבים של שריר levator auris longus (LAL). הליך זה מאפשר לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של חלבונים שמקורם בשריר בהתחדשות הסינפסה העצבית-שרירית.

משולב באלקטרופורציה של Vivo ועצבוב מחדש לטווח קצר של שריר השלד של שריר השלד Auris longus

כאן, אנו מציגים את המניפולציה הגנטית החריפה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים על ידי אלקטרופורציה. מודלים אלה של אורגנואידים בקליפת המוח נוחים במיוחד להזרקה מכיוון שניתן לזהות בקלות מבנים דמויי חדרים לאחר החיתוך, מה שמאפשר חקירה תפקודית של התפתחות קליפת המוח האנושית, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה קליפת המוח.

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

למד את שיטת האלקטרופורציה להזרקת מולקולות טעונות למזנכימה קרניו-פאציאלית בזחלי Xenopus laevis בשלב 28. שיטה זו מאפשרת מניפולציה מדויקת של רקמות פנים וגולגולת בתהליך ההתפתחות העוברי.

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

גלה סרטונים נוספים