תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle
January 9th, 2012
Bicelles הם תערובות שומנים / amphiphile כי לשמור על חלבונים בממברנה (הפרלמנט) בתוך bilayer השומנים אבל יש שלב התנהגות ייחודית המאפשרת תפוקה גבוהה סינון על ידי רובוטים התגבשות. טכניקה זו ייצרה בהצלחה מספר ברזולוציה גבוהה מבנים משני מקורות פרוקריוטים ו האיקריוטים. וידאו זה מתאר פרוטוקולים ליצירת תערובת lipidic bicelle, המאגדת חברי פרלמנט לתוך התערובת bicelle, הקמת crystallizations ניסויים (באופן ידני, כמו גם רובוט) וקריסטלים קצירת מן המדיום.
סרטון זה ידגים שיטה להקמת ניסויי התגבשות בתפוקה גבוהה של חלבוני ממברנה מטוהרים באמצעות תאי B ליפיים. תאי B ראשונים מוכנים על ידי ערבוב שומן וחלבון ממברנה מטוהר משולב בתערובת תאי B וניסויי התגבשות מבוצעים באמצעות בדיקה ויזואלית של רובוט ננו-ליטר. שימוש במיקרוסקופ אור רגיל חושף את נוכחותם של גבישים.
לאחר היווצרותם, ניתן לחלץ ולהקפיא את גבישי החלבון לצורך איסוף נתונים וקביעה מובנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבשל התנהגות הפאזה הייחודית של תאי B, ניתן להשתמש בציוד סטנדרטי ורובוטיקה הקיימים במעבדה לצורך התגבשות. הגדרת תאי B היא טכניקה כל כך פשוטה ומאפשרת לך להוציא את חלבון ממברנת המטרה שלך מחומר הניקוי של התא שלי, ולהניח אותו במדיום שמן.
זה נותן לך סט חדש לגמרי של תנאים לסינון. זוהי שיטה כל כך פשוטה ששימשה בהצלחה על חלבוני ממברנה רבים שפשוט אין סיבה לא לנסות אותה. השלב הראשון בהתגבשות מבוססת תאי B הוא הכנת תערובת אמפי שומנית היוצרת תא B.
תהליך זה דורש מאמץ ניכר והוא גוזל זמן רב ביותר. שים לב שהשלמת הפעולה עשויה להימשך מספר שעות. תאי B יכולים להיווצר במגוון שילובי אמפי ליפידים ובטווח רחב של ריכוזים.
לנקודות התחלה מוצעות, ראה טבלה אחת בפרוטוקול הכתוב הנלווה התחל בהכנת מיליליטר אחד של תערובת קפסו 35% DMPC ביחס מולארי של 2.8 לאחד. לשם כך, שקלו 0.26 גרם DMPC ו-0.09 גרם צ'אפו בשפופרת. הביאו את הנפח ל -1.0 מיליליטר באמצעות מערבולת מים נטולת יונים את התערובת.
לאחר מכן, מחממים את התערובת לכ-40 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שהיא הופכת לדמוית ג'ל לאחר מכן. הניחו את הצינור על קרח. הדגימה צריכה להיות נוזלית כמו שוב.
לאחר מכן מערבולת שוב למשך מספר דקות, המשיכו לרכוב על אופניים בשלבי ההתחממות, הקירור והמערבולת עד להמסה מלאה של השומן. שימו לב שככל שמבוצעים מחזורים נוספים, התערובת עלולה להיות עכורה עם הקירור בסיום. התערובת תהיה ג'ל שקוף בטמפרטורת החדר או מעליה, וניתן להניח נוזל צמיג על קרח על ידי תאים במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
לאחר מכן, חלבונים מטוהרים משולבים במדיום תאי B. זהו תהליך פשוט ויש לבצע אותו באותו יום של התגבשות, המוצג בחלק הבא של הסרטון. הפשירו את תערובת תאי ה-DMPC capso B בטמפרטורת החדר עד שהפאזה משתנה לג'ל שקוף.
מניחים את התערובת על קרח כדי להנזיל אותה ואז מערבלים אותה לזמן קצר כדי ליצור מחדש שלב תאי B הומוגני. מנקודה זו ואילך, שמור את תערובת תאי B והחלבון המטוהר על קרח. זה ישמור על תא B בשלב נוזלי, מה שהופך אותו לנוח לפיפטינג.
לאחר מכן, הוסף את תערובת תאי B לחלבון המסיס המטוהר ביחס של אחד לארבעה, נפח לנפח. לאחר מכן פיפטה בעדינות למעלה ולמטה עד שהתמיסה הופכת צלולה והומוגנית. אם מופיעות בועות, בקצרה, סובב אותן בצנטריפוגה על השולחן.
דגרו את התערובת על קרח למשך 30 דקות לפחות כדי לקדם שילוב מלא של החלבון בתאים. תערובת החלבון לפי תאים מוכנה כעת לניסויי התגבשות. ניסויי התגבשות יודגמו באמצעות רובוט התגבשות יתושים.
מגניב, צלחת תחתונה של 96 באר וולט על ידי הנחתה על קרח. הכניסו את תערובת החלבון לפי תאים לצלחת כדי להבטיח שצמיגות התמיסה תהיה מינימלית. שמור את החלבון על ידי תערובת תאים על קרח עד לשלב האחרון.
לרובוט המשמש כאן יש חמש פלטפורמות. הנח את המיקרו-פלטה המכילה את המאגר על פלטפורמה שלוש ואת מכסה ההתגבשות שעליו יחולקו הטיפות על פלטפורמה חמש. לאחר מכן הנח את החלבון לפי לוחית התא על הפלטפורמה הקרובה ביותר למצב החלוקה.
זה מבטיח שהחלבון לפי תערובת התאים הוא האחרון שנאסף על ידי הרובוט והוא משתחרר מיד. באמצעות התוכנה ליזום את הריצה, הרובוט יאסוף את תמיסת המאגר ואחריה את החלבון אחר תערובת התאים ויחלק אותם על המכסה כטיפות כדי למנוע חימום וצמיגות מוגברת במהלך החלוקה. אין לתכנת את היתוש לערבב את המאגר עם החלבון לפי תערובת תאים ברגע שהריצה.
הסר את לוחית החלבון של תא הקנייה מהמכשיר והנח אותה על קרח. הסר את המכסה מהמכשיר והנח אותו על הצלחת המכילה את תמיסת המאגר כך שהטיפות הפוכות. דגרו את הצלחת בחום של 20 מעלות צלזיוס.
שים לב שטמפרטורות אחרות עשויות להיבדק גם להיווצרות גבישים ואופטימיזציה. טמפרטורות גבוהות יותר גורמות לשלב הלמלר, שיש לו את היתרון של ארגון החלבון בשכבות. ניתן לבדוק טמפרטורות בין ארבע מעלות צלזיוס ל-20 מעלות צלזיוס.
טמפרטורות מתחת לארבע מעלות צלזיוס עלולות לגרום לשומנים לשקע לאורך פרקי זמן ממושכים ביום הראשון, השלישי ושבועי לאחר מכן, העריכו את מראה הגביש וצמיחתו באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי. מוצגות כאן תמונת שדה בהיר ותמונת UV של גבישים בצורת מחט שנצפו במצב תקיפה בלבד. פלואורסצנטיות לא זוהתה מהגבישים, מה שמצביע על תוצאה חיובית כוזבת בתמונה זו.
גביש בצורת מוט נוצר כאשר מתיל פרופאן דיול שימש כמשקע. הגביש זוהר מדי שבוע המצביע על כך שייתכן שמדובר בגביש חלבון, אך נמצא כלא פרו-עקשן באמצעות עקיפה של קרני רנטגן. מוצג כאן גביש שנצפה כארבעה שבועות לאחר הקמת הניסויים.
הקרינה החזקה תחת אור UV מאשרת שמדובר בגביש חלבון. כפי שצפיתם בסרטון הזה. ברגע שתאי B זמינים, ניתן לערבב אותם ישירות עם חלבון מטוהר ומנקודה זו והלאה ההתגבשות מתקדמת כמעט בדיוק כמו פרוטוקולים סטנדרטיים מבוססי דטרגנטים.
יתרון מובהק נוסף הוא היכולת לסמם תאי B עם שומנים ספציפיים למטרות אופטימיזציה. יש באמת הרבה צדדיות בטכניקה והיא כל כך פשוטה לשימוש שצריך לנסות אותה לכל פרויקטי התגבשות חלבון הממברנה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
סרטון זה מדגים שיטה להגדרת ניסויים של גיבוש תפוקה גבוהה של חלבוני קרום מטוהרים באמצעות ביסלים ליפידיים. הטכניקה מאפשרת שילוב של חלבוני קרום במדיום ליפידי, מה שמקל על תהליך הגיבוש.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- גיבוש חלבון קרום
- ביופיזיקה
רקע
- ביסלים הם תערובות ליפיד/אמפיפיל שמייצבים חלבוני קרום בתוך דו-שכבה ליפידית.
- טכניקה זו כוללת התנהגות פאזה ייחודית המועילה לסינון תפוקה גבוהה.
- היא הצליחה לייצר מבנים ברזולוציה גבוהה ממקורות שונים.
- ניתן להשתמש בציוד מעבדה סטנדרטי לניסויי גיבוש.
מטרת המחקר
- להדגים את הכנת הביסלים לגיבוש חלבון קרום.
- להראות כיצד לשלב חלבוני קרום בתערובת הביסלים.
- לתאר את התהליך של הגדרת ניסויי גיבוש.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת ביסלים על ידי ערבוב ליפיד וחומר מרחיב.
- שילוב של חלבוני קרום מטוהרים בתערובת הביסלים.
- ניסויי גיבוש שבוצעו באמצעות רובוט ננו-ליטר.
- בדיקה ויזואלית של גבישים באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי.
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של גבישי חלבון מתערובת הביסלים.
- ניתן לחלץ את הגבישים ולהקפיא אותם לצורך איסוף נתונים.
- הטכניקה מאפשרת שימוש יעיל בציוד מעבדה סטנדרטי.
- יכולות תפוקה גבוהה משפרות את תהליך הגיבוש.
מסקנות
- ביסלים מספקים מדיום בר קיימא לגיבוש חלבון קרום.
- השיטה מפשטת את המעבר של חלבונים ממרחיב לסביבות ליפידיות.
- גישה זו יכולה להוביל לקביעה מבנית משופרת של חלבוני קרום.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Membrane protein crystallization remains a bottleneck in structure-based drug discovery due to protein hydrophobicity and instability in detergent micelles. The lipidic bicelle method provides a more native-like lipid environment that improves protein stability and crystal quality, enabling reliable structural data for target validation. This approach supports early-stage mechanistic de-risking by facilitating high-resolution insights into drug-binding pockets and conformational states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural determination of membrane proteins in a lipidic milieu that better preserves native conformation and ligand-binding sites.
- Operational Value: Reduces reliance on extensive detergent screening by providing a standardized lipidic matrix for crystallization trials.
- Predictive Value: High-quality crystals support accurate modeling of protein-ligand interactions, improving confidence in target engagement hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces diffraction-quality crystals that enable atomic-level resolution for structure-guided drug design.
- Operational Value: Compatible with standard nanoliter liquid-handling robotics, allowing integration into existing high-throughput crystallization pipelines.
- Scalability: Low viscosity of bicelle-protein mixtures facilitates automated dispensing and reduces technical barriers to automation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Structures obtained via bicelle crystallization inform the design of selective inhibitors with improved pharmacokinetic profiles.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of conformational states relevant to allosteric modulation and gating mechanisms.
- Preclinical Model Relevance: Supports structure-based optimization of leads targeting disease-associated membrane proteins from diverse organisms.
Pipeline & Workflow Integration
The bicelle method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing structural data that informs medicinal chemistry and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of membrane protein architecture and ligand-binding sites in a near-native lipid environment.
- Screening: Generates crystallization conditions compatible with robotic screening, increasing throughput and condition coverage.
- Analytics: Yields X-ray diffraction data that provides electron density maps for accurate model building and ligand pose validation.
- Translational Research: Connects atomic structures to functional assays, enabling correlation of binding affinity with structural perturbations.
- Enterprise Reuse: Bicelle formulations can be standardized and stored for repeated use across multiple membrane protein targets, reducing reagent variability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves success rate of membrane protein crystallization by mimicking the lipid bilayer environment.
- Operational Value: Uses standard laboratory equipment and robotics, eliminating need for specialized high-viscosity handling tools.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by reducing time-to-structure for challenging membrane protein targets.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on high-confidence structural insights into target druggability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling and membrane protein biochemistry to optimize lipid:detergent ratios and protein incorporation.
- Depends on access to crystallization robotics and controlled-temperature incubation systems for trial setup and monitoring.
- Necessitates standardization of bicelle preparation protocols across teams to ensure reproducibility of crystallization outcomes.
- Involves optimization of lipid composition (e.g., DMPC:CHAPSO ratios) and precipitant screening to match protein-specific crystallization needs.
- Limited by the need for cold handling during preparation to maintain bicelle fluidity and prevent premature phase transitions.
