תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

סרטון זה ידגים שיטה להקמת ניסויי התגבשות בתפוקה גבוהה של חלבוני ממברנה מטוהרים באמצעות תאי B ליפיים. תאי B ראשונים מוכנים על ידי ערבוב שומן וחלבון ממברנה מטוהר משולב בתערובת תאי B וניסויי התגבשות מבוצעים באמצעות בדיקה ויזואלית של רובוט ננו-ליטר. שימוש במיקרוסקופ אור רגיל חושף את נוכחותם של גבישים.

לאחר היווצרותם, ניתן לחלץ ולהקפיא את גבישי החלבון לצורך איסוף נתונים וקביעה מובנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבשל התנהגות הפאזה הייחודית של תאי B, ניתן להשתמש בציוד סטנדרטי ורובוטיקה הקיימים במעבדה לצורך התגבשות. הגדרת תאי B היא טכניקה כל כך פשוטה ומאפשרת לך להוציא את חלבון ממברנת המטרה שלך מחומר הניקוי של התא שלי, ולהניח אותו במדיום שמן.

זה נותן לך סט חדש לגמרי של תנאים לסינון. זוהי שיטה כל כך פשוטה ששימשה בהצלחה על חלבוני ממברנה רבים שפשוט אין סיבה לא לנסות אותה. השלב הראשון בהתגבשות מבוססת תאי B הוא הכנת תערובת אמפי שומנית היוצרת תא B.

תהליך זה דורש מאמץ ניכר והוא גוזל זמן רב ביותר. שים לב שהשלמת הפעולה עשויה להימשך מספר שעות. תאי B יכולים להיווצר במגוון שילובי אמפי ליפידים ובטווח רחב של ריכוזים.

לנקודות התחלה מוצעות, ראה טבלה אחת בפרוטוקול הכתוב הנלווה התחל בהכנת מיליליטר אחד של תערובת קפסו 35% DMPC ביחס מולארי של 2.8 לאחד. לשם כך, שקלו 0.26 גרם DMPC ו-0.09 גרם צ'אפו בשפופרת. הביאו את הנפח ל -1.0 מיליליטר באמצעות מערבולת מים נטולת יונים את התערובת.

לאחר מכן, מחממים את התערובת לכ-40 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שהיא הופכת לדמוית ג'ל לאחר מכן. הניחו את הצינור על קרח. הדגימה צריכה להיות נוזלית כמו שוב.

לאחר מכן מערבולת שוב למשך מספר דקות, המשיכו לרכוב על אופניים בשלבי ההתחממות, הקירור והמערבולת עד להמסה מלאה של השומן. שימו לב שככל שמבוצעים מחזורים נוספים, התערובת עלולה להיות עכורה עם הקירור בסיום. התערובת תהיה ג'ל שקוף בטמפרטורת החדר או מעליה, וניתן להניח נוזל צמיג על קרח על ידי תאים במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

לאחר מכן, חלבונים מטוהרים משולבים במדיום תאי B. זהו תהליך פשוט ויש לבצע אותו באותו יום של התגבשות, המוצג בחלק הבא של הסרטון. הפשירו את תערובת תאי ה-DMPC capso B בטמפרטורת החדר עד שהפאזה משתנה לג'ל שקוף.

מניחים את התערובת על קרח כדי להנזיל אותה ואז מערבלים אותה לזמן קצר כדי ליצור מחדש שלב תאי B הומוגני. מנקודה זו ואילך, שמור את תערובת תאי B והחלבון המטוהר על קרח. זה ישמור על תא B בשלב נוזלי, מה שהופך אותו לנוח לפיפטינג.

לאחר מכן, הוסף את תערובת תאי B לחלבון המסיס המטוהר ביחס של אחד לארבעה, נפח לנפח. לאחר מכן פיפטה בעדינות למעלה ולמטה עד שהתמיסה הופכת צלולה והומוגנית. אם מופיעות בועות, בקצרה, סובב אותן בצנטריפוגה על השולחן.

דגרו את התערובת על קרח למשך 30 דקות לפחות כדי לקדם שילוב מלא של החלבון בתאים. תערובת החלבון לפי תאים מוכנה כעת לניסויי התגבשות. ניסויי התגבשות יודגמו באמצעות רובוט התגבשות יתושים.

מגניב, צלחת תחתונה של 96 באר וולט על ידי הנחתה על קרח. הכניסו את תערובת החלבון לפי תאים לצלחת כדי להבטיח שצמיגות התמיסה תהיה מינימלית. שמור את החלבון על ידי תערובת תאים על קרח עד לשלב האחרון.

לרובוט המשמש כאן יש חמש פלטפורמות. הנח את המיקרו-פלטה המכילה את המאגר על פלטפורמה שלוש ואת מכסה ההתגבשות שעליו יחולקו הטיפות על פלטפורמה חמש. לאחר מכן הנח את החלבון לפי לוחית התא על הפלטפורמה הקרובה ביותר למצב החלוקה.

זה מבטיח שהחלבון לפי תערובת התאים הוא האחרון שנאסף על ידי הרובוט והוא משתחרר מיד. באמצעות התוכנה ליזום את הריצה, הרובוט יאסוף את תמיסת המאגר ואחריה את החלבון אחר תערובת התאים ויחלק אותם על המכסה כטיפות כדי למנוע חימום וצמיגות מוגברת במהלך החלוקה. אין לתכנת את היתוש לערבב את המאגר עם החלבון לפי תערובת תאים ברגע שהריצה.

הסר את לוחית החלבון של תא הקנייה מהמכשיר והנח אותה על קרח. הסר את המכסה מהמכשיר והנח אותו על הצלחת המכילה את תמיסת המאגר כך שהטיפות הפוכות. דגרו את הצלחת בחום של 20 מעלות צלזיוס.

שים לב שטמפרטורות אחרות עשויות להיבדק גם להיווצרות גבישים ואופטימיזציה. טמפרטורות גבוהות יותר גורמות לשלב הלמלר, שיש לו את היתרון של ארגון החלבון בשכבות. ניתן לבדוק טמפרטורות בין ארבע מעלות צלזיוס ל-20 מעלות צלזיוס.

טמפרטורות מתחת לארבע מעלות צלזיוס עלולות לגרום לשומנים לשקע לאורך פרקי זמן ממושכים ביום הראשון, השלישי ושבועי לאחר מכן, העריכו את מראה הגביש וצמיחתו באמצעות מיקרוסקופ אור סטנדרטי. מוצגות כאן תמונת שדה בהיר ותמונת UV של גבישים בצורת מחט שנצפו במצב תקיפה בלבד. פלואורסצנטיות לא זוהתה מהגבישים, מה שמצביע על תוצאה חיובית כוזבת בתמונה זו.

גביש בצורת מוט נוצר כאשר מתיל פרופאן דיול שימש כמשקע. הגביש זוהר מדי שבוע המצביע על כך שייתכן שמדובר בגביש חלבון, אך נמצא כלא פרו-עקשן באמצעות עקיפה של קרני רנטגן. מוצג כאן גביש שנצפה כארבעה שבועות לאחר הקמת הניסויים.

הקרינה החזקה תחת אור UV מאשרת שמדובר בגביש חלבון. כפי שצפיתם בסרטון הזה. ברגע שתאי B זמינים, ניתן לערבב אותם ישירות עם חלבון מטוהר ומנקודה זו והלאה ההתגבשות מתקדמת כמעט בדיוק כמו פרוטוקולים סטנדרטיים מבוססי דטרגנטים.

יתרון מובהק נוסף הוא היכולת לסמם תאי B עם שומנים ספציפיים למטרות אופטימיזציה. יש באמת הרבה צדדיות בטכניקה והיא כל כך פשוטה לשימוש שצריך לנסות אותה לכל פרויקטי התגבשות חלבון הממברנה.