ניצול של ננו גבישים פוטוניים Plasmonic ו מניפולציה מיקרו ו Nanoparticle משופרת

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ללכוד עצמים ביולוגיים בגודל מיקרוני באמצעות פינצטות פלסמוניות וגבישי פוטוניים. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור המצע הפלסמוני או המצע של הגביש הפוטוני. לאחר מכן, הדגימה הביולוגית מוכנה על ידי הוספת BSA לתמיסת התאים ויצירת מרווח הולם עבור תמיסת התאים מתחת לכיסוי הזכוכית העליון.

לאחר מכן, הלייזר מיושר למיקרוסקופ, אשר הותקנה בו מערכת הסינון המתאימה. כעת המיקרוסקופ ממוקד על הדגימה והלכידה מבוצעת. לבסוף, ניתן ללכוד חלקיקים בגודל מיקרו או נאנו בעוצמה פגיעה מופחתת, בעזרת ננו-מבנים פלסמוניים או גבישים פוטוניים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון פינצטות אופטיות קונבנציונליות, הוא שהמרה של השדות האופטיים באמצעות ננו-מבנים פלסמוניים וגבישים פוטוניים מפחיתה את העוצמה הדרושה ללכידה של חלקיקים קטנים כמו תאים, ובנוסף היא אינה דורשת קרן ממוקדת מאוד, דבר המפחית את הסיכון לנזק פוטו-כימי של התאים כתוצאה מחשיפה לקרינה. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומים ביולוגיים רבים, כגון אינטראקציה בין תאים ובחינת כוחות שונים בביולוגיה. היא יכולה לשמש גם ככלי שימושי לייצור בננו-טכנולוגיה ומיקרו-טכנולוגיה על ידי אספקת מניפולציה מדויקת של מיקרו-וננו-חלקיקים. כדי ליצור מערך של ננו-חלקיקי זהב, השתמש במאדה e-beam ובשכבת כרום כשכבת הידבקות, ואדה זהב על כיסוי זכוכית (cover slip) לעובי של 20 nanometers.

נקה את הדגימה באמצעות פלזמה של חמצן למשך כדקה אחת כדי להסיר זיהומים אורגניים מהפני השטח. לאחר השראה של השכבה היחידה (monolayer) של הפוליסטירן להתארגן עצמית, טפטף או מזג את הנוזל על הדגימה, הדגר אותה למשך כשעה, ולאחר מכן השתמש בנפח גדול של מים כדי לשטוף את הכדורים שאינם נספחים, והשאר לייבוש באוויר. לאחר התאיידות השכבה היחידה, אדה שכבה שנייה של זהב בעובי 20 nanometer על כדורי הלטקס בשכבה היחידה, כדי ליצור מערך רנדומלי של ננו-חלקיקי זהב.

מערך הננו-חלקיקים מוכן כעת לדגימה הביולוגית. הניחו את שקופית הננו-חלקיקים שהוכנה על במה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השלב הבא הוא הכנת גרעיני תאים של עכבר ללכידה אופטית.

התחל עם גרעיני תאי עכבר המסומנים ב-aine orange כדי למנוע מהגרעינים להיצמד לתשתית. הנח את גרעיני התאים במבחנה קטנה והוסף 10% BSA ב-PBS בריכוז של BSA אחד ל-10, תוך ערבוב באמצעות וורטקס. לאחר מכן, טפטף בעזרת פיפטה חמישה µL של תמיסת ה-BSA עם הגרעינים על גבי הפיתוך המוכנה.

כדי ליצור מרווח בין הגרעינים לבין לית המכסה, הנח ערימה של שני ליתי מכסה משמשים כמעצבי מרווח מסביב לטיפה, ולאחר מכן הנח לית מכסה נוסף מעל. עבור לכידה ודימוי סימולטני, השתמש בתצורת מיקרוסקופ פלואורסצנציה מותאמת אישית, הכוללת מסנן עירור מעקף ושני מפליקרים דיכרואיים מותאמים אישית. הפינצטה האופטית נבנית על ידי העברת לייזר הליום-ניאון בהספק 35 milliwatt דרך מיקרוסקופ zes axio imager D one M, המצויד בסט מסננים GFP 17, אשר שונה כדי לאפשר לקרינת לייזר של 633 nanometer להגיע לדגימה.

המיקרוסקופ ימיקד את קרן הלייזר על הדגימה, ולאחר מכן הקרן תעבור עקיפה על ידי מצע הננו-חלקיקים הפלסמוניים או על ידי סריג העקיפה. כדי לדימות של גרעיני התאים, שקוטרם כחמישה מיקרון, השתמשו ב-Zeiss LDEC epi plan עם עדשה של Neola 50 x. התחילו בהנחת הדגימה על העדשה ומיקוד במישור שבו נמצא מספר הגרעינים הגדול ביותר, שכן הם מונחים על פני השטח של המצע.

בשלב הבא, התמקדו במיקרוסקופ בגרעין שברצונכם ללכוד, על ידי איתור גרעיני תאים הצפים בחופשיות מעל שכבות התאים שעל פני השטח. לאחר מכן, מקמו את נקודת מלכודת הלייזר מעל החלקיק. בנקודה זו, הוא אמור להילכד ולשמור על מיקומו בנקודת הלייזר גם כאשר הבמה נעה.

גרעיני העכברים שנמצאים במישור המוקד של המיקרוסקופ יסחפו ככל הנראה עם זרם מיקרו-פלואידי קל הנגרם מחימום הדגימה ומהתאיידות, אך הגרעינים במלכודת יישארו במיקום אחד. איור זה מציג מיקרוגרף של מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של ננו-חלקיקי זהב בהרכבה עצמית, שלכל אחד מהם קוטר של כ-450 ננומטרים. כאן מוצגת תמונה של מיקרוסקופיה אופטית סורקת בשדה קרוב (nearfield) של המצע הפלסמוני שבו התפלגות הננו-חלקיקים היא דלילה, המראה את הקרינה בשדה הקרוב.

אורך הגל של לייזר העירור הוא 633 nanometers; כאן מוצג ספקטרום של יעילות פיזור של המצע הפלסמוני המראה שיא ב-624 nanometers. ספקטרום של יעילות בליעה של המצע הפלסמוני מראה שיא ב-668 nanometers. ננו-ספירות זהב המפוזרות באופן אקראי על פני מישור דו-ממדי של ריבוע בגודל one by one.

מיקרומטרים מוצגים כאן. כל עיגול כחול מייצג את מרכז הננו-ספירה. בלוחות אלו מוצגות התפלגויות של שדה פיזור במישורי תצפית, המקבילים למערך הננו-ספירות האקראי.

תרשימים אלו מציגים את עוצמות הלייזר המינימליות לשמירה על המלכוד כפונקציה של קצב הזרימה של הנוזל הסובב. באמצעות לכידה פלסמונית, כל עוצמות האור נמדדו במישור הדגימה תחת עדשת המיקרוסקופ. כל פאנל מציג את תוצאות המדידה עבור חלקיקי פוליסטרין בודדים בעלי קטרים שונים.

התמונות המוכנסות מציגות את תמונות המיקרוסקופ המתאימות של החלקיקים. סריג המقياس בכל התמונות מייצג אורך של five micrometers. מוצג כאן שיפוע הקו המתואם העובר דרך הראשית בגרפים הקודמים לעומת גודל החלקיקים.

עבור לכידה פלסמונית. פס השגיאה מציגים את סטיות התקן של ההתאמות הליניאריות. התוצאות מראות כי חלקיקים גדולים יותר דורשים עצימות לייזר גבוהה יותר כדי לשמור על יציבות לכידה נאותה.

סכימה זו מציגה לכידה אופטית משופרת המשתמשת בננו-מבנים מחזוריים במימד אחד (1D). קרן האור הפוגעת עוברת עקיפה על ידי הננו-מבנה המחזורי בשדה רחוק. מוצגת כאן התפלגות העוצמה של האור עם שני קיטובים מאונכים על פניו של מדרג אלומיניום.

עם מחזוריות של 417 ננומטר שהתקבלה באמצעות סימולציות של התחום המוגדר בשיטת ההפרשים הסופיים בזמן, ההתפלגות מנורמלת לעוצמה על פני שטח אלומיניום שטוח. דמויות אלה מראות את פוטנציאל הלכידה עבור חלקיקים הנמצאים ישירות מעל פני השטח המדורגים לעומת מיקום החלקיק. עבור חרוז פוליסטירן של CA 350 ננומטר וחרוז פוליסטירן של DA מיקרומטר אחד, העיגולים הלבנים ממחישים את גדלי החלקיקים.

התמונות המוקטנות מציגות את פוטנציאל הלכידה מעל פני שטח שטוחים של אלומיניום. עבור גודל חלקיקים זהה לצורך השוואה. הערכים נורמלו עבור כל גודל חלקיק.

עבור כל דגמי הסימולציה של FDTD, שדה הראייה הוא 10 על שמונה מיקרומטרים רבועים. כאן מוצגים יעילות הלכידה ועוצמת הלכידה המינימלית שנמדדו עבור חרוזי פוליסטירן בגדלים שונים, כאשר קיטוב האלומה ניצב לקווי המדרג (grading lines). התמונה המוכנסת מראה אסימטריית לכידה ביעילות הלכידה עבור העתקת חרוז פוליסטירן בגודל 3.87 מיקרומטר, בניצב ובמקביל לקווי המדרג.

כאן מוצג ייצוג סכמטי של זווית התרגום של החלקיק. תמונה זו מראה את ההגברה מול כיוון התרגום עבור קיטובים וגדלי חלקיקים שונים. אסימטריה גדולה, המסומנת בקו רציף, מתקבלת עם אור פגוע המקוטב בניצב למדרג, והקו המקוקוואו.

אסימטריה קטנה מתקבלת כאשר האור הפוגע מקוטב במקביל למדרג. פאנלים אלו מייצגים הדגמה של לכידת חלקיק פוליסטירן פלואורסצנטי של 590 nanometer. העיגול האדום מציין את מיקום נקודת הלייזר, כיוון שאור הלייזר היה עמום מדי כדי להיראות בתחילה.

החלקיק נלכד בתוך הנקודה בעוצמה גבוהה יותר. כאשר העוצמה יורדת, התנועה בראונית של החלקיק גוברת על כוח הלכידה, מה שמאפשר לחלקיק להימלט. במקרה זה, עבור גרעין של תא סרטן שחלות פלואורסצנטי שנלכד, העוצמה המינימלית הנדרשת להבניית הלכידה הייתה 16 micro watts per micrometer squared, שהושגה באמצעות עדשת אובייקטיב 20 x.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליצור מלכודת אופטית בעוצמה נמוכה למניפולציה לא פולשנית של דגימות ביולוגיות בגודל מיקרו וננו, תוך שימוש במצעים בעלי ננו-מבנה פלסמוני וקריסטל פוטוני.