שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

המטרה הכוללת של הליך זה היא למזער את הפירוק של תמונות ביולוגיות הנגרמות על ידי חללי האוויר בעלי הצמח כדי לקבל תמונות ברורות יותר של תאים חיים בתוך העלה. אם העלה מותקן במדיום הרכבה מימי ופלואורופור נרגש על ידי לייזר, חללי אוויר לא מלאים רבים ושינויים במקדם השבירה בתוך הרקמה המוצגת בכתום מגבילים את עוצמת האות עמוק מתוך הרקמה בתמונה המתקבלת. אם העלה מותקן במקום זאת לפי קו פלואורו או PFD, עירור הלייזר המתקבל של הפלואורופור פחות מוחלש ומאפשר שידור טוב יותר של אותות הנפלטים.

בסופו של דבר, השימוש במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי סורק עם מדיום ההרכבה PFD נותן תמונות ברורות של תאים חיים בתוך עלה הצמח בעומק שהוא יותר מכפול מהאפשרי כאשר משתמשים במדיום הרכבה מימי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו קיבוע או הרכבה של עלים ומדיה מימית, הוא שהיא מפחיתה את השבירה בתוך מילוי המזו ומאפשרת הדמיה מדויקת יותר של תאים חיים עמוק יותר בתוך העלה, שהולך לבעייתי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי הצמח, כגון טיפול במילוי מזו, ביולוגיה של התא ואיתות in vivo, קולוניזציה של עלים על ידי פתוגנים ואינטראקציות מילוי פתוגנים, אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הביולוגיה הבסיסית של הצמח.

ניתן ליישם אותו גם על רקמות שבירה אחרות העשירות במרחב האווירי כגון ספירלות תובנה או ריאת בעלי חוליות. הדגים את ההליך הזה יהיה ד"ר ג'ורג' ליטלג'ון מהמעבדה שלי להר ליף. דגימות ב-PFD מתחילות בהכנת שקופית מיקרוסקופ עם אטם חדיר גז של פולי דימתיל סלואן או P-D-M-S-P-D-M-S הוא פולימר ויסקו-אלסטי שניתן לעצב כדי לספק תא המותאם לדרישות הניסוי.

אזנו את ה-PFD באוויר על ידי ניעור נפח קטן של PFD בבקבוק מלא באוויר. ניתן להשיג זאת גם על ידי בעבוע אוויר דרך ה-PFD לאחר מכן, שפוך את ה-PFD לצלחת פטרי פתוחה וצף שתיל שלם או עלה בלו על הנוזל למשך חמש דקות. הרקמה צריכה להיות שקופה המזכירה רקמה מזוגגת.

עלים עשויים להיראות כהים או בהירים יותר מאשר לפני החשיפה ל-PFD, בהתאם לתנאי התאורה ולגיל הרקמה בה נעשה שימוש. לבסוף, מלאו את תא ה-PDMS ב-PFD שווה אוויר והעבירו בזהירות את דגימות הרקמה מצלחת הדגירה לצלחת ה-PDMS. אטום את השקופית עם כיסוי, החלקה ותמונה.

על פי דרישות הניסוי, עלים של חודשים הודגרו במשך חמש דקות בתרחיף של חלבון פלואורסצנטי ירוק רקומביננטי או GFP. בבדיקה מיקרוסקופית של דגימות עלים מודגרות PFD מראה שרוב חללי האוויר מוצפים ב-GFP רקומביננטי תלוי ב-PFD. ה-GFP הוא בירוק, והאדום מייצג כלורופיל, לוטו פלואורסצנטי ותאי מילוי מזו דליטים.

ניכר כי העלה מוצף עם הדגירה ב-PFD, אך כיסי אוויר מדי פעם עשויים להישאר מים אינם מציפים את העלה בתנאים אלה. כאן, אופסיס משאיר את נוגה, גרסה של YFP, הממוקמת בציטוזול מודגרת ומורכבת בסריקת לייזר אוויר, מים או PFD. מיקרוסקופיה קונפוקלית של הדגימות מראה יתרון של PFD על פני אוויר ומים עם עלייה כפולה בעומק ההדמיה.

כאשר משווים PFD ומים לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש עד 10 דקות אם מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי דלין היקפי ממיס לכה וטפלון, אך הוא תואם לשומן סיליקון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בכל דלין פלורו כמדיום הרכבה לשיפור ההדמיה בתאים של עלי צמחים.

אל תשכח שבעוד שלכל פלואורו דלין אינו רעיל, אנו ממליצים לאמץ נוהלי בטיחות סטנדרטיים בעת ביצוע הליך זה.