שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative
16 בינואר 2012
אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק הדמיה ארבידופסיס thaliana עלה רקמה עם השפעה פיזיולוגית מינימלית.
המטרה הכללית של הליך זה היא למזער את הדגרדציה של תמונות ביולוגיות הנגרמת מחללי אוויר בעלי העלה, כדי להשיג תמונות ברורות יותר של תאים חיים בתוך העלה. כאשר העלה מורכב במצע הרכבה מימי ופלואורופור מעורר על ידי לייזר, חללי אוויר רבים שאינם מלאים ושינויים במקדם השבירה בתוך הרקמה (המוצגת בכתום) מגבילים את עוצמת האות המגיע מעומק הרקמה בתמונה המתקבלת. אם העלה מורכב במקום זאת ב-per fluoro deline או PFD, עירור הלייזר של הפלואורופור נחלש פחות ומאפשר תמסורת טובה יותר של אותים שנפלטו.
בסופו של דבר, שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת בלייזר עם תוך המבואת PFD מעניק תמונות ברורות של תאים חיים בתוך עלה הצמח בעומק הגבוה פי שניים מהעומק האפשרי בעת שימוש בתוך מבואת מי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קיבוע או הרכבת עלים ותוכי מבואת מי, הוא שהיא מפחיתה את השבירה בתוך המזופיל ומאפשרת דימוי מדויק יותר של תאים חיים בעומק רב יותר בתוך העלה, דבר שהיה בעייתי עד כה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במדעי הצומח, כגון בחינת ביולוגיה של תאי המזופיל ואיתות in vivo, קולוניזציה של עלים על ידי פתוגנים ואינטראקציות של פתוגנים עם המזופיל, ובכך לספק תובנות לגבי ביולוגיה בסיסית של צמחים.
ניתן ליישם זאת גם על רקמות שבירה גבוהות אחרות העשירות בחללי אוויר, כגון שבלולי תמניות או ריאות של חולייתנים. ד"ר George Littlejohn מהמעבדה שלי ידגים את ההליך הזה ב-Mount Leaf. הכנת דגימות ב-PFD מתחילה בהכנת סלייד למיקרוסקופ עם אטם חדיר לגז מפולידימეთילסילוקסן, או P-D-M-S; P-D-M-S הוא פולימר ויסקו-אלסטי שניתן לעצב אותו כדי לספק תא המותאם לדרישות הניסוייות.
יש להביא את ה-PFD לשיווי משקל עם אוויר על ידי ניעור נפח קטן של PFD בבקבוק מלא באוויר. ניתן להשיג זאת גם על ידי הזרמת בועות אוויר דרך ה-PFD. לאחר מכן, יש למזוג את ה-PFD לצהיבת פטרי פתוחה ולהניח שתיל שלם או עלה גזור לצוף על הנוזל למשך חמש דקות. הרקמה אמורה להפוך לשקופה, באופן המזכיר רקמה מזגגית (vitrified tissue).
העלים עשויים להיראות כהים או בהירים יותר מאשר לפני החשיפה ל-PFD, תלוי בתנאי התאורה ובגיל הרקמה שבה נעשה שימוש. לבסוף, מלאו את תא ה-PDMS ב-PFD מאוורר והעבירו בזהירות את דגימות הרקמה מפטריית האינקובציה לתא ה-PDMS. אטמו את הזריקה בעזרת כיסוי זכוכית (coverslip) ובצעו דגימה תמונית.
בהתאם לדרישות הניסוי, עלים של חודש הובאו לדגירה למשך חמש דקות בתמיה של חלבון פלואורסצנטי ירוק רקומביננטי או GFP. בבדיקה מיקרוסקופית של דגימות עלים שדוגרו ב-PFD, נראה כי רוב חללי האוויר מוצפים ב-GFP רקומביננטי התלוי ב-PFD. ה-GFP מופיע בירוק, והצבע האדום מייצג כלורופיל, פלואורסצנציית לוֹטוֹ ותאי מזוֹפיל.
ניכר כי העלה מוצף בעת דגירה עם PFD, אך ייתכן שכיסים בודדים של אוויר יישארו. במצב זה, מים אינם מציפים את העלה. כאן, עלי opsys המבטאים Venus, וריאנט של YFP הממוקם בציטוזול, דוגרו והורכבו באוויר, במים או ב-PFD לסריקה בלייזר. מיקרוסקופיה קונפוקלית של הדגימות מראה יתרון של PFD על פני אוויר ומים, עם עלייה של פי שניים בקירוב בעומק הדימוי.
בעת השוואה בין PFD למים, ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן לבצעה תוך חמש עד 10 דקות אם היא מבוצעת כראוי. במהלך ביצוע הליך זה, חשוב לזכור ש-peripheral delin ממיס לק ציפורים וטפלון, אך הוא תואם לגריז סיליקון. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש ב-per fluro delin כמצע הרכבה לשיפור הדימות בתאי עלי צמחים.
אל תשכחו כי למרות ש-per fluoro decalin אינו רעיל, אנו ממליצים לאמץ נהלי בטיחות סטנדרטיים בעת ביצוע פרוצדורה זו.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את השימוש ב-perfluorodecalin כמדיום הרכבה חודר לשיפור עומק הדימוי ברקמת עלה של Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממזערת את ההשפעה הפיזיולוגית תוך שיפור הבהירות של תמונות של תאים חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של הצמחים
- טכניקות דימות
- ביולוגיה של התא
רקע
- חללי אוויר בעלי פืช פוגעים באיכות של תמונות ביולוגיות.
- תוכני הרכבה מימי מגבילים את עוצמת האות בדימות.
- פרפלואורדקלין (PFD) מפחית את השבירה ומשפר את הדימוי.
- ניתן להחיל טכניקה זו על רקמות אחרות בעלות מקדם שבירה גבוה.
מטרת המחקר
- לשיפור עומק הדימוג של תאים חיים בעלי עלים של צמחים.
- לקבלת תמונות ברורות יותר לצורך חקר הביולוגיה של הצמח.
- לסיוע במחקר על ביולוגיה של התא ואינטראקציות עם פתוגנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תא PDMS חדיר לגזים.
- השגת שיווי משקל של PFD עם אוויר.
- דגירה של דגימות עלים ב-PFD.
- דימוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת בלייזר.
תוצאות עיקריות
- PFD מאפשר העברה טובה יותר של אותות שנפלטו.
- עומק הדימוי גבוה פי שניים לפחות בהשוואה למדיומים מימיים.
- מרבית חללי האוויר בעלים מוצפים ב-PFD.
- ניתן לבצע את הטכניקה במהירות וביעילות.
מסקנות
- פרפלורודקלין הוא מדיום קיבוע יעיל עבור דימות.
- שיטה זו משפרת את חקר התאים החיים בצמחים.
- יש להקפיד על נהלי בטיחות סטנדרטיים במהלך הפרוצדורה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי ברזולוציה גבוהה של רקמות צמחים חיים מוגבל לעיתים קרובות על ידי חוסר התאמה במקדם השבירה וחללי אוויר, אשר פוגעים באיכות האות ובעומק החדירה. שימוש ב-perfluorodecalin (PFD) כמצע דימוי חודר מאפשר ויזואליזציה עמוקה וברורה יותר של תאים חיים ללא פגיעה פיזיולוגית. יכולת זו תומכת בתובנות ביולוגיות מהימנות ובעלות כושר ניבוי גבוה יותר בשלבי הגילוי המוקדמים ובשלבי פיתוח הבדיקות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תהליכים תאיים ואיתות ברקמות צמחים שלמות ורלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.
- מפחית ארטיפקטים אופטיים, ובכך תומך בתיקוף מדויק יותר של מטרות פונקציונליות במטריצות ביולוגיות מורכבות.
- משפר את רמת הביטחון החזויה עבור היפותזות ביולוגיות המשך על ידי מזעור ארטיפקטים הנגרמים מדימות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מקל על הכנת דגימות חיות עם נגישות אופטית עבור בדיקות דימות כמותיות.
- תומך בתנאי דימות הניתנים לשחזור על ידי מזעור אי-התאמות במקדם השבירה והנחתת אות.
- מאפשר הערכה אמינה של רהפורטרים פלואורסצנטיים וסמנים תאיים בתהליכי סריקה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ניתן להחלה על רקמות אחרות עשירות בחללי אוויר, דבר התומך ברציפות תרגומית במודלים של צמחים ופוטנציאלית גם במודלים של בעלי חיים.
- מספק הפחתת סיכונים מנגנונית על ידי מתן אפשרות לתנאי דימות דמויי in vivo עבור מחקרים פרה-קליניים.
- משפר את ההלימה בין תוצרי דימות משלב הגילוי לבין הדרישות של המודל הפרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
דימות מבוסס PFD משלב בין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח בדיקות (assays), ומאפשר ויזואליזציה ברמת דיוק גבוהה, החל מבדיקת השערות ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך במחקרים מונחי-השערה על ידי מתן אפשרות לדימוי עמוק של רקמות חיות עם מזעור של ארטיפקטים.
- סריקה: מספק פלטי דימוי כמותיים הניתנים לשחזור לצורך ניתוח השוואתי של תנאי ניסוי.
- אנליטיקה: משפר את אמינות המדידה על ידי הפחתת אובדן אות ועיוות אופטי בעומק.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מתודולוגיות דימוי במערכות צמחים ובעלי חיים שבהן חללי אוויר מהווים גורם מבלבל.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע שיפור דימוי בעל יישום רחב עבור מודלים ביולוגיים מגוונים הדורשים ויזואליזציה של רקמות עמוקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בדימות רקמות חיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי העבודה בדימות ושיפור השחזוריות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת הפרויקט (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים ביולוגיים באיכות גבוהה יותר בשלבים מוקדמים של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי הפחתת מחסומים טכניים של דימות ברקמות מורכבות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית וטיפול במדיה של פרפלואורופחמן (perfluorocarbon).
- נדרשים תאי דימות וחומרים תואמים, מכיוון ש-PFD ממיס סוגים מסוימים של פלסטיקים ולכות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולי דימות והכנת דגימות.
- ניתן להתאימו לרקמות שונות עשירות בחללי אוויר מעבר לעלי Arabidopsis, תוך התחשבות בדרישות הספציפיות של כל רקמה.
- מגבלות מעשיות כוללות כיסי אוויר שיוריים מדי פעם ואילוצים של תאימות חומרים.
