השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד כמותית את פעילויות ויסות הגנים של אלמנטים רגולטוריים של CIS או CRE הפעילים במהלך התפתחות מטמורפית של דרוזופילה מלאן. התחל בשיטות אינטגרציה ספציפיות לאתר כדי ליצור שורות של CREs המשולבים באופן טרנסגני כטרנסגנים מדווחים. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו, השג דגימות טרנסגניות של שלב ההתפתחות הנכון.

הסר דגימות מהפאב החיצוני והרכיב אותן על מיקרוסקופ זכוכית. המשך שקופית כדי לתעד את הרמה והדפוס של ביטוי חלבון מדווח פלואורסצנטי בדגימות הרכבה שלמות על ידי ניתוח מיקרוסקופי קונפוקלי. לבסוף, כמת את רמת ביטוי חלבון המדווח הפלואורסצנטי עבור תמונות קונפוקליות מוקלטות באמצעות כלי התוכנה Image J.

תוצאות אלה מקצות רמה של פעילות ויסות גנים כדי לסייע לאלמנט רגולטורי ולהקל על מחקרי ביטוי גנים השוואתיים נוספים על גרסאות CRE ששונו. הליך זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח ומרגיש עניין בוויסות גנים וכיצד ויסות הגנים הזה מקודד. הדנ"א מרגיש כמו ביולוגיה התפתחותית ואבולוציונית.

הליך זה פותח כדי לספק תובנות לגבי אלמנטים רגולטוריים של ציס המתפקדים במהלך התפתחות מטמורפית של דרוזופילה מלנוגסטר. עם זאת, באופן עקרוני, ניתן ליישם אותו על אלמנטים מווסתים של חבר העמים המתפקדים בשלבי התפתחות אחרים ומינים אחרים של זבוב פירות, או אפילו אורגניזמים מודלים אחרים. על מנת להרחיב קווים טרנסגניים, הגדר שני בקבוקונים עם מספר זבובים זכרים ונקבות בימים מתחלפים.

מעבירים את הזבובים מאחד הבקבוקונים לבקבוקון חדש. חזור על זה במשך שבוע. בתום שבועיים, ודא שזבובי הפירות הטרנסגניים נעים בין שלבי התפתחות זחלים למבוגרים.

התחל לשלב דגימות בסוף שלב הזחל השלישי כאשר נוצר חדר המיון. שימו לב שהדגימה אינה ניידת. ה-ER מתרכך בלבן והכדורים נמנעו לציין נקודת זמן זו.

כאפס HAPF. הבחין בין זכרים לנקבות על ידי נוכחות בלוטות מין הממוקמות דו-צדדית ליד נקודת האמצע של הגוף המופיעות כמעגלים שקופים לבימוי על סמך אורך המטמורפוזה. באפס HAPF, העבירו דגימות לבקבוקון טרי באמצעות מברשת לחה.

הוסף חתיכת מגבון קים והרטיב במים כדי למנוע מהדגימות להתייבש. כעת, דגרו את הבקבוקון ב-25 מעלות צלזיוס עד ל-HAPF הרצוי. לחלופין, שלב דגימות על ידי מיון על סמך זיהוי נוכחותם ומיקומם של מספר סמנים מורפולוגיים כמפורט בטקסט הנלווה.

בעזרת סרט מעבדה, הדביקו פיסת סרט אריזה ללוח חיתוך כשמשטח הסרט הדביק פונה כלפי מעלה. הרטיבו מברשת צבע ומרחו לחות על דגימות בעזרת מברשת צבע. העבירו דגימות למגבון קים.

העבירו דגימות לסרט האריזה והדבקו כשמשטח הגב פונה כלפי מעלה. הניחו לדגימות להתייבש למשך 15 דקות. פתח את חדר המיון בהדרגה באמצעות מלקחיים.

התחל בחלק הקדמי או בסלסול והמשך לכיוון הקצה האחורי. לאחר מכן העבירו pui לטיפת שמן צמיג על שקופית מיקרוסקופ והעריכו את הדגימה במיקרוסקופ עבור דגימות הר שלמות. השתמש במטרת המט"ח או פי 10 כדי להביא את הדגימה למיקוד.

באמצעות תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי, התאם את אורך גל העירור עבור החלבון הפלואורסצנטי הרצוי כדי למנוע פוטוהלבנה. התחל בעוצמת לייזר של חמישה עד 10%אם האות מאכזב, הגדל את העוצמה לפי הצורך על מנת לשפר את יחס האות לרעש. עבור תמונות קונפוקליות, הפעל הגדרות תוכנה שממוצע מדידות פיקסלים מסריקות משוכפלות כגון ממוצע קלמן להשוואות כמותיות של פעילות CRE משתמש בחתך קיסרי שבו הקרינה נראית אינטנסיבית ביותר.

עבור לטבלת חיפוש אזהרת רוויה והתאם את רווח מתח הערוץ והיסט להגדרות שבהן מעט פיקסלים רוויים. במידת הצורך, כוונן את הצמצם הקונפוקלי. לאחר קביעת ההגדרות האופטימליות, הפעל את סריקת ZS כדי לקבל סדרה של תמונות לאורך ציר Z.

בסיום הסריקה, המר את ערימת התמונות להקרנה ושמור קובץ תמונה זה בפורמט TIF. להשוואה כמותית של פעילויות CRE, השתמש באותן הגדרות קונפוקליות עבור כל הדגימות המשוכפלות וקווי הטרנסגן המדווחים. עבור הניסוי עם תוכנית Image J פתח תמונת TIFF להערכה.

לחץ על כפתור הבחירה ביד חופשית ותאר את אזור הדגימה שבו רצוי כמות. כדי לקבל סטטיסטיקה של ערך פיקסלים, לחץ על הכרטיסיה ניתוח ולאחר מכן בחר מדידה. רשום את ניקוד ערך הפיקסל הממוצע מתיבת התוצאות.

אסוף גם ערך פיקסל ממוצע שני מאזור רקע שבו ה-CRE אינו פעיל. כדי לגזור ערך פיקסלים ממוצע מותאם, המשך ליצור סטטיסטיקה של ערכי פיקסלים עבור דגימות משוכפלות. לאחר מכן מההעתק ערכי פיקסלים ממוצעים מותאמים, קבע את הפעילות הרגולטורית הממוצעת עבור A CRE וגם חשב את שגיאת התקן של הממוצע.

ניסוי זה משתמש בעוצמה של פנוטיפ עין ההצלה הלבנה כדי להפוך קווים טרנסגניים להומוזיגוטיים. רקע גנטי מוטנטי של גן לבן עם רצף אתר נחיתה של TTP משמש לשילוב טרנסגנים ספציפיים לאתר. פרטים טרנסגניים, המיזיגוטים והומוזיגוטיים עבור הווקטור המשולב נבדלים על ידי עוצמת הפנוטיפ של צבע העין שניצל על ידי מספר העותקים של הגן המיני לבן המשולב.

קווים הומוזיגוטיים נוצרים לאחר מכן על ידי הכלאה של זבובים זכרים ונקבות עם פנוטיפ צבע העיניים הכהה ביותר. סמנים מורפולוגיים משמשים לקביעת השלב המטמורפי של דרוזופילה במהלך המטמורפוזה מזחל לזבוב פירות בוגר. הדגימה עוברת דרך סדרה של מורפולוגיות סטריאוטיפיות שניתן להשתמש בהן כדי לקבוע את המין ולהתקרב לשלב ההתפתחותי. הנה.

גרסה פראית של CRE המכונה האלמנט הדימורפי מניעה רמות גבוהות של ביטוי מדווח EGFP במקטע הבטן ASIC של נקבת פוי. רצף של 13 זוגות בסיסים בתוך CRE זה נמצא כאתר מקשר לגורם השעתוק DSX והחשיבות in vivo של רצף זה מודגמת על ידי כימות הפעילות הרגולטורית עבור ה-CRE כאשר אתר קשירה זה עובר מוטציה. ניתוחים כמותיים מצביעים על כך שהמוטציה של אתר DSX זה הפחיתה את הפעילות הרגולטורית ל-28 פלוס מינוס 3% מהביטוי מסוג הבר בהקשר של אתר החדרת הטרנסגנים המשמש כאן.

השוואות דומות מעריכות פעילויות רגולטוריות עבור אללים תוך-ספציפיים של CRE או בין CREs אוטולוגיים ממינים נפרדים, למשל, בהשוואה לרמות של EGFP במקטע הנקבי. A 6 המונעים על ידי D Melin Gastric Canin S זן CREs אוטולוגיים עבור המינים D ממריצים ו-D willi הם בעלי פעילויות רגולטוריות שוות ערך ל-75 פלוס או מינוס 4% ואפס פלוס מינוס 0% בהתאמה. ניתן להשתמש בשיטות הליך הבאות כמו הפרעות RNA עם גנים של גורם שעתוק כדי לענות על שאלות נוספות כיצד גנים אלה של גורם שעתוק מקיימים אינטראקציה עם אלמנטים רגולטוריים של CYS.

זה יצוין על ידי עלייה וירידה בביטוי חלבון מדווח פלואורסצנטי המונעים על ידי אלמנטים רגולטוריים של CIS לאחר פיתוחו. הליך זה סלל את הדרך לחוקרים בתחום ויסות הגנים לחקור את החשיבות התפקודית שיש למוטיבים של אלמנטים רגולטוריים ומוטציות מתפתחות על ביטוי גנים.