ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

השיטה שואפת לכמת במדויק מטבוליטים של שומנים ביו-אקטיביים תאיים על ידי שילוב של דילול איזוטופים יציבים, שלב cnor, כרומטוגרפיה נוזלית, לכידת אלקטרונים, לחץ אטמוספרי, יינון כימי וספקטרומטריית מסה. התחל בקצירת דגימות מדיה ותאים והוסף תערובת סטנדרטית פנימית של איזוטופ כבד. חלץ את השומנים הביו-אקטיביים עם ממס אורגני, ולאחר מכן גזור את השומנים הביו-אקטיביים עם מגיב לכידת אלקטרונים והמשך לכמת במדויק את השומנים הביו-אקטיביים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית.

ספקטרומטריית מסה באמצעות ניתוח LCMS של תוצאות ליזאט תאים ומדיה קובעת במדויק את ריכוז השומנים הביו-אקטיביים הממוקדים ואת הרמות של Anant ERs בודדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כרומטוגרפיה נוזלית בשלב הפוך, ספקטרומטריית מסה ושיטות LCMS אחרות, הוא שבודדים ואנטרים מכומתים במדויק באמצעות כרומטוגרפיה של פאזה רגילה לרכב ודילול איזוטופים מיוצבים. הנתונים המתקבלים יכולים לספק תובנה חשובה לגבי המסלולים האנזימטיים הפועלים בתא.

עבור כל צלחת של 10 סנטימטר של דבק, תאים אוספים שלושה מיליליטר מדיה בצינור צנטריפוגה מזכוכית של 10 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של PBS, גרד את התאים מהצלחת והעביר את הדגימה לצינור צנטריפוגה מזכוכית שנייה עד 10 מיליליטר.

הכן שמונה צינורות נוספים עם שלושה מיליליטר PBS לעקומת כיול. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר מתקן הכיול המתאים לכל צינור. יישר כל דגימת בדיקה של אמצעי תרבית התאים שנאספו בשלושה מיליליטר למיצוי שומנים ביו-אקטיביים חופשיים.

הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת סטנדרטית פנימית לכל תקן כיול ושיווי משקל למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לעבד דגימות בחמישה מיליליטר של אתר דתיל ולהניח על שייקר למשך 30 דקות. צנטריפוגה את הדגימות והעברת השלב האורגני העליון לצינורות צנטריפוגה מזכוכית של 10 מיליליטר. המשך לייבש את הדגימות תחת חנקן ראשית, אסוף את דגימות התאים שנקטפו על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש כל משטח בשני מיליליטר PBS על ידי Vortex Reserve 25 מיקרוליטר מכל דגימה לנורמליזציה של ליזאט תאים.

כעת חלקו באופן שווה כל ליזט לצינורות צנטריפוגה מזכוכית של 10 מיליליטר. הוסף שני מיליליטר נוספים של PBS ו-10 מיקרוליטר ISM לכל דגימה על מנת למדוד שומנים תאיים חופשיים ולמנוע פירוק אלקליין של שומנים כגון הפרוסטגלנדינים, השתמש באחת מכל כפילויות דגימה לביצוע מיצוי אתר דתיל, כפי שהוצג קודם לכן. כדי לחלץ שומנים אסטריים, הוסף חמישה מיליליטר של תערובת מתנול כלורופורם לכל אחת מהדגימות הנותרות.

מניחים על שייקר במהירות נמוכה למשך 30 דקות, ואז צנטריפוגה למשך 10 דקות. כעת, אספו את השכבה האורגנית התחתונה וייבשו את הדגימות מתחת לחנקן כדי לעצב את השומנים האסטריים. הוסף 0.5 מיליליטר של 0.4 אשלגן הידרוקסיד רגיל ב-80% מתנול לכל צינור.

דגירה של דגימות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר PBS והתאם את ה-pH שתיים שש עם חומצה הידרוכלורית מרוכזת. לבסוף, הוסף 10 מיקרוליטר של ISM לכל דגימה והמשך למיצוי אתר דתיל לדגימות המיובשות ולתקני הכיול.

הוסף ריאגנטים לנגזרות בסדר שצוין. לאחר מכן מערבלים את הדגימות ודוגרים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. כעת, יבש את הדגימות תחת חנקן לפני האחסון והניתוח.

שיטה זו משתמשת בשילוב של דילול איזוטופים יציב, chii, כרומטוגרפיה נוזלית, לכידת אלקטרונים, לחץ אטמוספרי, יינון כימי וניתוח ספקטרומטריית מסה. להרכיב מחדש את הדגימות ותקני הכיול ב-100 מיקרוליטר של אתנול הקסאן, ולהעביר את כל הדגימות לבקבוקוני HPLC עם הכנסת הדגימות לדגימת הרכב המצוננת. צור רשימה לדוגמה לניתוח.

לאחר מכן, הגדר את שיטות HPLC ו-MS באמצעות הפרמטרים המתוארים בטבלה הראשונה ובטבלה השנייה בפרוטוקול הכתוב הנלווה להפרדת הפאזה הרגילה. חבילה כיראלית, עמודת DH ל-30 מעלות צלזיוס, מזריקים דגימה ומתחילים בריצה. כעת הגדר את ה-MS במצב יונים שליליים באמצעות מקור A PCI.

התחל עם ריק הקסאן כדי לאזן את העמודה. לאחר מכן, הפעל את דגימות תקן הכיול לפי סדר הגדלת ריכוז ה-SM. המשך לעבד דגימות בדיקה של מדיית תרבית לאחר הפרדת HBLC.

הוסף עמודת פוסט מתנול כדי למנוע שקיעה על מחט העטרה. שימוש בנתונים שנוצרו מהתקנים. צור עקומת כיול המתווה שטח דגימה על ציר Y, והריכוז הסטנדרטי על ציר x יגזור את המשוואה Y שווה ל- MX ועוד B.

לבסוף, קבע את ריכוזי דגימת הבדיקה של שומנים ביו-אקטיביים לתא. ליזאטס. נרמל ערכים אלה על ידי חלוקת הריכוז שנקבע של שומן ביו-אקטיבי במספר התאים לצלחת או בסך החלבון המנורמל בשלבים הקודמים. נתונים מניטור תגובות מרובות מצביעים על מספר חומצה לינולאית וארכידונית.

מטבוליטים מחומצנים. 13 ותשע, מחזיקים יחד עם 13 ותשע אודות Oxo המקבילות נגזרות מחומצה לינולאית. בנוסף, מטבוליטים של חומצה ארכידונית ומוצריהם המחומצנים קיימים גם כצפוי.

יש שינוי קטן בזמן השמירה של התקן הפנימי המופחת בהשוואה לתקן הלא מסומן. חשוב לציין, פרוטוקול זה גם מפריד בין חום לאנטרים וקובע מעברים ייחודיים עבור איזומרי הסטריאו שיכולים לנבוע מחמצון אנזימטי של חומצה ארכידונית או מתגובה עם מיני חמצן תגובתיים. לדוגמה, כרומטוגרמה זו מציגה את ההפרדה בין איזומרי הסטריאו r ו-s של חמש.

ניתוח שומני חום הוא טכניקה רבת עוצמה לניתוחים של מיני שומנים רבים. לדוגמה, ניסוי זה מעריך ומכמת פרוסטגלנדינים, איזופ סנס ולויקוטריאן B ארבע. בנוסף לחום ש-Oxo אוכלת ומטבוליטים הידרוקסיליים של אומגה, ניתן לבצע אופטימיזציה של שיטה זו למיצוי שומנים ביו-אקטיביים ממטריצות ביולוגיות אחרות כגון פלזמה, שתן ורקמות.

במקרים מסוימים, שומנים ביו-אקטיביים שימשו כסמנים ביולוגיים לתגובה של עקה חמצונית.