פרוטוקול לאיתור גז הדחה בשלב רדיקלים חופשיים עשן סיגריות רגילה

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את כמות הרדיקלים החופשיים בעשן טבק בזרם הראשי ולהעריך את יכולת הניקוי (scavenging) של מספר נוגדי חמצון. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מסננים המכילים מספר תרכובות ניקוי שונות, כמו גם בקרות ללא מסנן ניקוי. לאחר ההכנה, מבוצע סימולציית עישון בעזרת עשן של סיגריות מחקר, העובר דרך תמיסת לכידה בספין (spin trapping solution).

לאחר מכן נעשה שימוש בתהודה ספין של אלקטרונים (Electron spin resonance), המקוצרת כ-ESR, להקלטת ספקטרומים של רדיקלים שנלכדו וכן של דגימות ייחוס. ספקטרומי ה-ESR שהתקבלו יעברו לאחר מכן אניליזה שגרתית במטרה להפריד את האות של רדיקלי שלב הגז שנלכדו מהרקע, ולכמת את ריכוז הרדיקלים באמצעות דגימת ייחוס. בסופו של דבר, התוצאות מספקות מידע כמותי על תכולת הרדיקלים החופשיים בעשן סיגריות בזרם המרכזי והערכות של קיבולת הסריקה (scavenging capacity) של נוגדי חמצון טבעיים באמצעות ספקטרוסקופיית ESR של לכידת ספין.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לניתוח עשן סיגריות, כגון כרומטוגרפיה גזית, הוא ש-ESR רגישה באופן ספציפי לרדיקלים חופשיים. להשלכות של טכניקה זו עשוי להיות תפקיד בצמצום ההשפעות המסוכנות של עשן סיגריות, מכיוון שרדיקלים חופשיים מהווים קבוצה מרכזית של חומרים קרצינוגניים. שיטה זו יכולה לספק תובנות במחקרי רדיקלים חופשיים בעשן סיגריות, וניתן להחילה גם על מערכות אחרות, כגון פליטות עשן תעשייתי ועשן סיגריות. המרכז הלאומי למחקר ביו-רפואי לטכנולוגיית תהודה ספין אלקטרונית, הידוע גם כ-cert, הוא תוצרי של ניסיוננו הנרחב בפיתוח טכנולוגיית ESR מודרנית.

עבור חוקרים העוסקים בתהודה של ספין אלקטרונים, אנו מציעים מגוון רחב של שירותים עבורם ועבור הקהילה הביו-רפואית. אנו מעמידים את המתקנים שלנו לרשות המשתמשים באופן קבוע כדי להחדיר נוגדי חמצון למסנן סיגריות. ראשית, המיסו את נוגדי החמצון, pycnogenol ותמצית ענבים ב-95% ethanol, והמיסו lycopene באצטון.

כוון את נפחי הממס בהתאם למסיסות נוגדי החיסון. לאחר מכן, ערבב את נוגדי החיסון המומסים עם פחם פעיל תחת תנאים אנאירוביים למשך כ-12 שעות. תנאים אנאירוביים מושגים על ידי הזרמת בועות של Argonne דרך התערובת תוך כדי ערבוב.

לאחר הדגירה, סננו את התמיסה ויבשו תחת ואקום. לאחר מכן, הכניסו את נוגדי החמצון והפחמן למסנן אצטט קונבנציונלי על ידי חיתוך המסנן תחילה לשני חלקים. הכניסו את נוגדי החמצון מהצמח המצופים בין שני חלקי המסנן כדי ליצור "סנדוויץ'" של מסנן נוגדי חמצון, והחזירו אותו אל תוך גליל נייר הסיגריה.

הכינו את מסנן הביקורת באופן דומה למסנן הנוגัด-חמצון, למעט הוספת הנוגัด-חמצון לפני הגדרת הניסוי. יש להוציא את סיגריות המחקר מאריזתן ולשמור אותן בסביבה בעלת לחות קבועה באמצעות תמיסת נתרן ברומיד רוויה למשך יומיים לפחות. הוציאו את גלילי הסיגריות המכילים טבק וחברו אותם למסנן המשולב.

בצעו סימולציית עישון לצורך ניתוח שגרתי בטמפרטורת החדר באמצעות מכשיר עישון בעל פתח אחד, המורכב משואב מים או משאבת ואקום/מדחס אוויר המחוברים למערכת ללכידת ספינים (spin trapping) באמצעות חיבור T עם קצה פתוח אחד. השתמשו במד ספיקה כדי לבדוק את זרימת הגז וכווןו לכ-2.2 standard cubic feet per hour על ידי כיוון שסתום הממוקם בין המשאבה לפתח האוורור. העשנו את סיגריות המחקר באמצעות שאיפה עוצמתית בנפח של 35 milliliters למשך שתי שניות, וחזרו על הפעולה בכל 60 שניות.

יש לסגור את הקצה הפתוח של מכשיר העישון כדי לבצע שאיפות, ולהשאירו פתוח בין שאיפה לשאיפה. כאשר הקצה אינו סגור, זרימת האוויר דרך הסיגריה היא מועטה, מה שמתאים לתנאים שבין השאיפות. בצעו 10 שאיפות עזות עבור כל סיגריה, תוך איסוף רדיקלים חופשיים מהפאזה הגזית על ידי העברת עשן הסיגריה הראשי דרך רפידת סינון של Cambridge, ולאחר מכן ה wpכנסתו לתמיסת לכידת הספין (spin trapping).

מלכודת החנקן הנוזלי מסירה אדי מים מהזרם הראשי של העשן, אך אינה משפיעה באופן מהותי על הרדיקלים בשלב הגז. לאחר הנשיפה האחרונה, העבירו מנה (aliquot) מהתמיסה המלכודת שעברה בועות לשפופרת דגימה מזכוכית בעלת קוטר פנימי של שלושה מילימטרים ואורך של כ-10 אינץ'. מכיוון שחמצן מרחיב ספקטרום ESR ומפחית את רגישות השיטה, הסירו חמצן מהתמיסה באמצעות שיטת freeze-pump-thaw, על ידי טבילה ראשונה של השפופרת בחנקן נוזלי, לאחר מכן ריקום של התמיסה בעזרת משאבת שמן, ולבסוף הפשרה של התמיסה תחת ארגון.

חזרו על שיטת ההקפאה, השאיבה וההפשרה (freeze pump thaw) מספר פעמים. לאחר מכן, אטמו את המבחנה תחת ואקום. המבחנה מוכנה כעת.

עבור מדידות ESR נוספות, רשמו ספקטראלי ESR של פס-X (X-band) בספקטרומטר Bruker EMX בתדר של 9.34 gigahertz. בתנאים סטנדרטיים, עיינו בפרוטוקול הכתוב עבור הגדרות הספקטרומטר האופייניות שנעשה בהן שימוש. עבור ניסויים אלו בצעו 25 צבירות ESR, אשר לוקחות בדרך כלל כ-20 דקות.

למרות שסוכני מלכודת הספין (spin trap) יציבים יחסית בתנאי הניסוי לאחר 12 שעות, עוצמת אותי ה-ESR בתמיסת בנזן פחתה פי חמישה. כדי לכמת את ריכוז סוכן המלכודת, בצע אינטגרציה לספקטרום ה-ESR הראשוני של הנגזרת הראשונה. ספקטרום הבליעה המתקבל מראה רקע של סינגלט רחב, הנובע ככל הנראה מתוצרי פיח וזפת הכלולים בעשן.

לאחר חיסור רקע זה, בצע אינטגרציה של השליש המופרד של הלוכד. חזור על הפעולה פעם נוספת כדי לקבל את ריכוז הרדיקל החופשי. ערכי האינטגרלים הכפולים עבור תמיסת לכידת הספין מושווים לאלו של תמיסת רדיקל ניטרוקס tempo בריכוז ידוע מהניסוי המוצג כאן, כמו גם לחישובים נוספים המופיעים בפרוטוקול הכתוב.

התקבל ריכוז רדיקלים חופשיים בפאזה הגזית של עשן סיגריה בזרם המרכזי של כ-7.1 × 10⁻⁹ מולארי. על סמך נתון זה, נקבע כי המספר הכולל של רדיקלים שנלכדו מהפאזה הגזית של סיגריה שלמה הוא סביב 1.5 × 10¹⁵. במהלך ניסוי זה, מדידות ראשוניות הובילו לאותות ESR חלשים ולשחזור נמוך עקב הלחות בזרימת העשן.

כדי לפתור בעיה זו, התווספה מלכודת חנקן נוזלי למכשיר סימולציית העישון בין מסנן קיימבריג' לבין תמיסת מלכודת הספין. מלכודת החנקן הנוזלי הסירה מים מזרימת עשן הסיגריה הראשית על ידי הקפאה מהירה ולכידה על הדופן הפנימית של צינור הזכוכית. דבר זה שיפר משמעותית את אותות ה-ESR ואפשר קבלת תוצאות עם רמת הדירות גבוהה.

נצפו רמות שונות של אפקט ספיחה של נוגדי חמצון מצמחים על רדיקלים חופשיים בשלב הגז בעשן סיגריות בזרם המרכזי, ושיעורי הספיחה שלהם מוצגים. ליקופן ותמצית גרעיני ענבים הראו את השיעורים הגבוהים ביותר, בעוד ששיעור נמוך יותר נצפה עבור פיקנוגנול. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בפחות משעה אחת אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע הפרוצדורה, חשוב להעביר את העשן דרך מלכודת חנקן נוזלי. פעולה זו משפרת את איכות ספקטרום ה-SR ואת ההדירות לאחר הפיתוח. הטכניקה סייעה לחוקרים בתחומי הבריאות והסביבה לחקור ולהעצים את נוכחותם של רדיקלים חופשיים המהווים סיכון בריאותי בתרכובות נדיפות שונות.

לאחר צפייה בסרטון, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לכמת רדיקלים חופשיים בעשן סיגריות בזרם המרכזי, וזאת במטרה להפחית את ההשפעות המסוכנות של העישון.