Name: שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: למדו שיטות להערכת כימואטרקציה של זרע צפרדע באמצעות מבחני שני תאים ומצלמת זיגמונד. השוואה בין צבירת זרע למעקב וידאו מאפשרת ניתוח כמותי ודינמי של תנועת הזרע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מעבדה קק WM bioimaging לשימוש של וידאו תחנת העבודה שלהם במיקרוסקופ. מחקר זה נתמך על ידי NSF מענק IBN-0615435.

<ol><li>Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+Arbacia+punctulata+spermatozoa+to+resact%2C+a+peptide+from+the+egg+jelly+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer.</a> J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).</li>
<li>Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+velocity+and+induction+of+chemotactic+response+in+mouse+spermatozoa+by+follicular+and+oviductal+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids.</a> J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).</li>
<li>Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+capacitated+rabbit+spermatozoa+to+follicular+fluid+revealed+by+a+novel+directionality-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay.</a> Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).</li>
<li>Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+multimer+formation+of+allurin%2C+a+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+laevis+egg+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).</li>
<li>Al-Anzi, B., Chandler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+egg+jelly+releases+a+sperm+chemoattractant+during+spawning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning.</a> Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).</li>
<li>Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+attraction+to+a+follicular+factor%28s%29+correlates+with+human+egg+fertilizability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).</li>
<li>Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemotaxis+when+the+fraction+of+responsive+cells+is+small--application+to+mammalian+sperm+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small--application to mammalian sperm guidance.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).</li>
<li>Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+spikes+in+the+flagellum+control+chemotactic+behavior+of+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm.</a> EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).</li>
<li>Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+bursts+occur+around+a+local+minimal+concentration+of+attractant+and+trigger+sperm+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).</li>
<li>Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+jelly+proteins+stimulate+directed+motility+in+Xenopus+laevis+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).</li>
<li>Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbaigar%2C+T+%22J.+Androl%22">J. Androl</a>. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractal+analysis+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fractal analysis of capacitating human spermatozoa.</a> Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).</li>
<li>Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+locating+the+female+gamete%3A+the+importance+of+measuring+sperm+trajectories+in+three+spatial+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).</li>
<li>Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors+and+olfactory-like+signaling+mechanisms+in+mammalian+sperm.Mol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol.</a> Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).</li>
<li>Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+Ca2%2B+dynamics+correlate+with+diverse+behavioral+phenotypes+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm.</a> J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).</li>
<li>Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+of+Xenopus+laevis+sperm+exhibits+multiple+gears+and+its+duration+is+extended+by+egg+jelly+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents.</a> Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).</li>
<li>Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis.</a> Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).</li>
<li>Riffell, J. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+flow%3A+the+consequences+of+fluid+shear+for+sperm-egg+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions.</a> J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).</li>
<li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+sperm+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).</li>
<li>Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+as+revealed+with+live+and+synthetic+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs.</a> Biol Bull. 220, 1-5 (2011).</li>
<li>Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+species-specificity+in+mammalian+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis.</a> Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).</li>
<li>Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+from+the+cumulus+cells+is+the+sperm+chemoattractant+secreted+by+the+rabbit+oocyte+cumulus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex.</a> PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).</li>
<li>Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+chemoattractant+secreted+from+human+cumulus+cells+is+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone.</a> Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).</li>
<li>Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+human+sperm+chemotaxis+mediated+by+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone.</a> PLoS One. 4, 8211-82 (2009).</li>
<li>Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sperm+pattern+of+movement+during+chemotactic+re-orientation+towards+a+progesterone+source%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source.</a> Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).</li>
<li>Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte chemotaxis.</a> Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+human+follicular+fluid+contains+a+chemoattractant+for+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+induces+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Progesterone induces human sperm chemotaxis.</a> Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).</li>
<li>Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. llurin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+21+kD+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+egg+jelly%2C+is+homologous+to+mammalian+sperm-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Chemotaxis של תאים על ידי העברת תנועה או amoeboid או שוטונים המופעל השחייה נמצא בהקשרים ביולוגיים רבים במחקר של תופעה זו מחייבת את הזמינות של מבחני מעשי ואמין. כמה דוגמאות של התופעה, כגון משיכה של זרע ביצה קיפודי ים או כינוס של תאים עובש רפש להקים גוף הפרי, יש השפעה ויזואלית מיידית. Quantitation של תופעה זו בוצעה במגוון דרכים כפי שתואר על ידי אייזנבך 18. מבחני אלו כוללים שימוש chemoattractant מלא נימים למשוך הזרע, שימוש נימים שהצטרף מאגרי כדי ליצור שיפוע ושימוש תא Makle...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם פריט </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 24 גם צלחות </td><td> בקטון, דיקנסון </td><td> 35/1147 </td><td></td></tr><tr><td> 12 מ&quot;מ קוטר מוסיף החיצוני עם קרום 12 מיקרומטר נקבוביות </td><td> Millipore </td><td> PIXP01250 </td><td> השתמשנו בעבר שחקן המשנה, קורנינג צלחת transwell # 3403, כעת הופסק </td></tr><tr><td> Zigmond קאמרית </td><td> Neuroprobe </td><td> Z02 </td><td></td></tr><tr><td> שמן סיליקון </td><td> ג&#39;נרל אלקטריק </td><td> SF1154 </td><td> שווה נוזלים דאו קורנינג 550 </td></tr><tr><td> תמונה J תוכנה </td><td> וויין Rasband, שירותי מחקר ענף, המכון הלאומי לבריאות הנפש </td><td> הורדה חינם ב http://rsbweb.nih.gov/ij </td><td> Java התוכנית פועלת על Windows, ליןUX ו-Mac </td></tr><tr><td> MtrackJ תוכנה </td><td> אריק Meijering / Imagescience / <a href="http://www.bigr.nl/">ביו קבוצה דימות</a> , Erasmus MC - מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת רוטרדם </td><td> הורדה חינם ב <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/</a> </td><td> תוכנית Java שפועל על Windows, Linux ו-Mac </td></tr><tr><td> תוכנת Virtual Dub </td><td> <a href="http://www.virtualdub.org/gpl.html">GNU General Licensed אישי</a> תוכנה </td><td> הורדה חינם דרך <a href="http://www.virtualdub.org/index.html">http://www.virtualdub.org/index.html</a> </td><td> הוראות ההתקנה באתר תמונה J תחת plugins; עבור Windows בלבד </td></tr><tr><td> cellSens תוכנה </td><td> אולימפוס </td><td> ראה אתר: <a href="http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070">http://www.olympusamerica.com/seg_section/p</a>roduct.asp? מוצר = 1070 </td><td> בקרות רוכש תמונות ממגוון רחב של מצלמות. יש גם יכולת עיבוד תמונה </td></tr></tbody></table>

שני סוגים של מבחני עבור chemoattraction גילוי זרע צפרדע

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Chemoattraction זרע חסרי חוליות יכולים להיות חזקים מספיק שאפשר במקום טפטפת המכיל את פפטיד אטרקטיבי לתוך ההשעיה זרע מיקרוסקופית לדמיין הצטברות זרע סביב פיפטה 1. Chemoattraction זרע בעלי חוליות כגון צפרדעים, מכרסמים ובני אדם קשה יותר לזהות דורש מבחני כמותי. מבחני אלה שני סוגים עיקריים - מבחני כי לכמת תנועה זרע למקור של chemoattractant, שנקרא הצטברות מבחני זרע, מבחני שבעצם המסלול מסלולי השחייה של זרע בודדים. הצטברות מבחני זרע עשרות המאפשר מהיר יחסית או מאות מבחני להיעשות ביום אחד, ובכך לאפשר תגובה מינון עקומות וקורסים זמן להתבצע במהירות יחסית. אלו סוגים של מבחני נעשה שימוש נרחב כדי לאפיין רבים מערכות chemoattraction מבוססת היטב - לדוגמה, chemotaxis נויטרופילים כדי BACפפטידים terial ו chemotaxis זרע בנוזל הזקיקים. מעקב מבחני זרע יכול להיות עבודה יותר אינטנסיבית אבל להציע נתונים נוספים על אופן chemoattractancts למעשה לשנות את נתיבי שחייה לקחת זרע. סוג זה של assay יש צורך להוכיח את הכיוון של תנועת הזרע יחסית לציר שיפוע chemoattrractant וכדי להמחיש פונה מאפיין או שינויים בכיוון זה להביא את הזרע קרוב יותר אל הביצית. כאן אנו מתארים את השיטות של כל אחד אלה שני סוגים של מבחני. הצטברות זרע assay מנוצל נקרא &quot;שתי קאמרית&quot; assay. זרע דוחי ממוקמים להכניס תרבות צלחת רקמה עם רצפת פוליקרבונט בעל מסנן בקוטר 12 מיקרומטר הנקבוביות. הוספת עם זרע ממוקמים בתוך התרבות רקמות בארות צלחת ובה חיץ chemoatttractant pipetted בזהירות לתוך קרקעית הבאר שבו הרצפה פוגש את הקיר (ראו איור. 1). לאחר דגירה, להכניס העליון המכיל את מאגר הזרע בזהירות removed, והזרע בתא התחתון שעברו דרך הממברנה מוסרים, pelleted וספר מכן על ידי hemocytometer או cytometer לזרום. Assay מעקב זרע מנצל קאמרית Zigmond שפותחה במקור עבור התבוננות chemotaxis נויטרופילים ואת שונה להסתכלות על ידי הזרע של Giojalas ועמיתים לעבודה 2,3. תא מורכב שקופית זכוכית עבה שלתוכו שתי שקתות אנכי כבר במכונה. אלה מופרדים באמצעות פלטפורמה 1 תצפית רחב מ&quot;מ. לאחר היישום של זרע זכוכית, מכסים נטענים לתוך השוקת אחד, סוכן chemoattractant לתוך השני התנועה של הזרע במיקרוסקופ על ידי הפרט דמיינו וידאו. קטעי וידאו מנותח ולאחר מכן באמצעות תוכנה לזיהוי דו מימדי תנועות תא במישור xy כפונקציה של זמן (xyt ערכות נתונים) היוצרות את המסלול של כל הזרע.

ביצים ציפוי תאית סביב ביצים לעתים קרובות שחרור פפטידים, חלבונים ומולקולות קטנות אשר לתקשר עם זרע כדי להנחות אותם אל הביצה ובכך לקדם את ההפריה. שימוש בזרע צפרדע אנו מתארים ולהשוות שני מעמדות של מבחני לשמש כדי לזהות chemoattraction זרע - הצטברות זרע מבחני ומעקב מבחני הזרע.

שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע

משיכה כימית של תאי זרע (chemoattraction) באי-חרשוניים יכולה להיות חזקה מספיק כדי שניתן יהיה להניח פיפט המכיל את הפפטיד המושך בתוך תרחיף של תאי זרע...

בכאן מתוארות שתי שיטות שונות להערכת משיכה כימית (chemo attraction) של תאי זרע במערך של שני תאים. תאי זרע של צפרדע המופעלים מוכנסים תחילה למסננים בעלי תחתית ממбраנה נקבובית המונחים בתוך בארות של פלטה בעלת 24 בארות. לאחר שתאי הזרע נמצאים במקומם, מתווסף בזהירות חומר מושך כימית לתחתית הבארה כדי ליצור מדרג ריכוזים של משיכה כימית.לאחר מכן, מדגרי את תאי הזרע כדי לאפשר להם זמן לחצות את הממברנה נקבובית בתגובה למדרג הכימותקטי. לבסוף, מוציאים את המכניס (insert) ואת תאי הזרע שנדדה לתחתית הבאר במערך הבדיקה בעל שני התאים סופרים באמצעות המוסימטר (hemo cytometer). בסופו של דבר, ניתן להשוות ולכמת את הפעילות של חומרי משיכה כימותקטיים של זרע, למשל, באמצעות ניתוח עקומת תגובה למינון עבור מערך מעקב בתא זיגמן (zigman chamber).ראשית, מדביקים זכוכית כיסוי לתא זיגמן (zigman chamber) באמצעות שמן סיליקון ומניחים אותו הפוך מעל הפתח המעגלי של המיקרוסקופ. לאחר מכן, ממלאים צד אחד של התא בזרע צפרדע פעיל. לבסוף, ממלאים את הצד השני בתמיסת חומר מושך כימי (chemo attractant solution).לאחר חמש דקות, נוצר המעמקיות הכימוטקטית, ובשלב זה ניתן להקליט בוידאו את תנועת הזרעים לאורך המעמקיות. בסופו של דבר, ניתן לנתח את הצילומים שהתקבלו מבדיקת המעקב בתא זיגמונד (zigmund chamber) כדי לקבוע את מהירות הזרעים ואת דפוסי הכימוקינזה ומסלולי התנועה של הזרעים בתגובה למעמקיות של חומר מושך כימי. שתי שיטות אלו לגילוי כימוטקסיס של זרעים הן משלימות והן מניבות סוגים שונים של נתונים.בדיקת שני התאים מאפשרת לזרעים לעבור דרך ממбраנה נקבובית, ובכך מאפשרת כימות של תגובת הזרעים לחומר מושך כימי. הדגמה ויזואלית של בדיקת שני התאים היא קריטית מכיוון ששלבי הוספת הזרעים והחומר המושך הכימי בהתחלה, כמו גם שלבי הסרת הזרעים והמכניסים (inserts) בסוף, דורשים דיוק רב בשימוש במיקרו-פיפטה. בדיקת תאי זיגמונד (zigmund chamber assay) משתמשת בוידאו כדי להקליט שחייה של זרעים במדרג ריכוזים כימואטראקטיבי.דבר זה מאפשר קביעה של פרמטרים דינמיים כגון מהירות וכיוון. היתרון המרכזי של בדיקת מעקב בתא זיגמונד (zigmund chamber) על פני בדיקה בשני תאים הוא שניתן להמחיש ולנתח את שחיית תאי הזרע באמצעות מספר פרמטרים דינמיים. שטפו את תאי הזרע מהאשכים של צפרדע על ידי נקב חורים בקצה אחד והזרקת בופר באמצעות מזרק ומחט בקצה opposite.לאחר שטיפת הזרע מאשכי הצפרדע, העריכו את מספר התאים שנאספו על ידי המוגנבין. לאחר מכן, דללו את תרחיף הזרע המרוכז באמצעות תמיסת רינגר לאוציטים כדי להגיע לצפיפות זרע של 2 × 10⁷ תאים למילליטר. העריכו את תנועתיות הזרע על ידי דילול של 5 µL זרע ביחס של 1:10 עם תמיסת F1, וצפו בתנועה באמצעות אופטיקת ניגודיות פאזה (phase contrast).בעזרת מיקרופיפט, העבירו 700 µL של באפר F1 לכל באר בלוח תרבית רקמה מפלסטיק בעל 24 בארות. לאחר מכן, כדי להפעיל את תנועת הזרע באמצעות הלם אוסמוטי עבור כל בדיקה המתוכננת, דללו 100 µL של תרחיף הזרע עם 900 µL של באפר F1 בטמפרטורת החדר בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה. מקמו אינסרט בעל קוטר חיצוני של 12 mm ונקביות של 12 µm בתוך באר מלאה בבאפר, תוךما וידוא שמיקום האינסרט אינו מרכזי, כך שיישאר מרווח בצד אחד.לאחר מכן, באמצעות מיקרופיפטה עם טיפ חתוך, העבירו מיד 400 µl של זרע המופעל בניידות אל תוך הבאר; מרחו את תמיסת הזרע על דופן המבנית (insert), כך שתזרום מטה אל המסנן שבבסיס המבנית. לאחר מכן, העבירו בזהירות באמצעות מיקרופיפטה 50 µl של חומר פיתיון כימי (chemo attraction agent) לתוך כל באר בלוח, במרווח שבין הבאר למבנית הממוקמת באופן אסימטרי.יש להקפיד להניח את הטיפה בנקודת המפגש בין דופן הבאר לתחתיתה. יש להוציא את הפ pipette מבלי להפר את המערכת. לאחר שכל הבדיקות הוכנו.השאירו את הפלטה בטמפרטורת החדר עד להשלמת דגירה של 50 דקות לבדיקה הראשונה שהחלה. לאחר מכן, תוך כדי ייצוב זהיר של המבחנה (insert) ביד אחת, הפסיקו את הבדיקה על ידי הסרה של מרבית או כל תרחיף תאי הזרע מהתא העליון באמצעות מיקרופיפטה.לאחר העברת הזרה מהתא העליון, הוציאו מיד את המבחנה הפנימית (insert) והשליכו אותה. כעת ערבבו את תרחיפי הזרה בכל באר כדי להחזיר לסביבה את הזרה ששקעה בתחתית. לאחר מכן, העבירו את כל תרחף הזרה מכל באר לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות.הוסיפו פורמלידהריד עד לריכוז סופי של 0.5% נפח לנפח. השקיעו את תאי הזרע המקובעים בכל מבחנה. בעזרת כפתור הלחיצה לעשר שניות, סובבו במיקרו-צנטריפוגה אישית.לאחר מכן, הסירו את כל הנוזל העליון מכל מבחנה למעט 100 µL, והשעיקו מחדש את המשקע בנפח זה. לאחר מכן, דללו 20 µL מתChatItem הזרע ביחס של 1 ל-10 עם מים מזוקקים, וספרו את תאי הזרע באמצעות המוצימטר. באמצעות עדשה של 40 x במיקרוסקופ אנכי, בדיגת שני התאים מספקת תוצאות כמותיות המתאימות למחקרי תגובה למינון או להשוואות בין חומרי משיכה.לדוגמה, מי ביצי של צפרדע מכילים חומר מושך כימי של זרעים, כפי שמוצג באמצעות הסמלים האדומים. מי ביצים גורמים לעלייה ולאחר מכן לירידה במספר הזרעים העוברים דרך הממברנה הנקבובית ככל שמינון החומר המושך הכימי של הזרעים עולה. לעומת זאת, לאלבומין סרום בקר, המיוצג על ידי הסמלים הלבנים, יש השפעה מועטה בטווח המינונים הזה.לפני תחילת בדיקת תא זיגמן (zigman chamber), ודא תחילה שתחנת העבודה של המיקרוסקופ ההפוך מוכנה להקלטה. הגדר את המיקרוסקופ. הפעל את תוכנת בקרת המצלמה כדי לרכוש שבע פריימים לשנייה.בדוק שהמצלמה ממוקדת בפלטפורמת התצפית ושהפלט נשלח למסך המחשב. לאחר מכן, ודא ששדה התצפית המיקרוסקופי כולל את רוב רוחבה של פלטפורמת התצפית או את כולתה. לאחר מכן, הכן תמיחת זרע של צפרדע בבופר Ringer עבורוציטות, ואטרקטור כימי המדולל לריכוז המתאים עם בופר F1, ושמור את שניהם על קרח עד לשימוש.לאחר מכן, התחילו עם תא זיגמונד (zigmund chamber) נקי ויבש. השתמשו במיקרו-פיפט כדי להניח קו של כ-4 µL של שמן סיליקון, במרחק של כ-5 mm ובמקביל לקצה החיצוני של כל שקע. לאחר מכן, הניחו זכוכית כיסוי בגודל 22x40 מ"מ על התא, ובכך אפשרו לשמן הסיליקון להתפשט באופן אחיד עד לקצה החיצוני של כל שקע.כעת הפכו את התא והניחו אותו מעל הפתח העגול הגדול בבמה של המיקרוסקופ. תוך הקפדה שזכוכית הכיסוי לא תיגע בבמה, הפעילו 20 µL של זרע xap בבופר Ringer עבור ציותים (oocyte Ringer's buffer) על ידי ערבוב ביחס של 1 ל-10 עם בופר F1 בטמפרטורת החדר. באמצעות מיקרו-פיפט עם קצה חתוך, שאבו מיד 70 µL של זרע שהופעלה בו מוביליות.לאחר מכן, החזיקו את המיקרו-פיפט בזווית נמוכה והניחו את הקצה בפתח הצדדי. מלאו את ה-trth ואת הגשר באמצעות פעולת נימיות. לאחר מכן, מלאו את ה-trth הנגדי באופן דומה באמצעות תמיסת מושך כימי (chemo attractant), מכיוון שלזרעי XAP יש זמן חיים מוגבל של ניידות.התחילו את צילום הווידאו בתוך שלוש דקות והמשיכו למשך חמש דקות. בדיקת המעקב בתא זיגמן (zigman chamber) מאפשרת מיקרוסקופיה של וידאו של זרעיים השוחים במעגל של גרדיאנט מושכי כימיים (chemo attractant). סרטון זה מציג הקלטה של זרעיים השוחים על פלטפורמת התצפית, כאשר המסלולים שלהם מסומנים באדום כפי שמוצג בדיאגרמה זו.מסלולי תנועת זרעים מורכבים ממקטעים, כאשר כל מקטע מסומן בחץ ומייצג את תנועת הזרע בין פרפרי סרט רצופים. מקטעי המסלול מתעדים את התנהגות השחייה של זרעים בודדים ומדגישים דפוסים כגון מעגלים ופניות. מנתונים אלו ניתן לקבוע את המהירות והכיוון של כל מקטע, או את התכונות של כל המקטעים במסלול מסוים או בקבוצה של מסלולים.למשל, מרחק ליניארי נקי. לווקטור המחבר את תחילת המסלול לסופו יש רכיב בציר x והוא נמצא בזווית theta מציר x כפי שמוצג כאן באדום; theta אמורה להצטמצם והתקדמות בציר x אמורה לגדול כאשר קיים מפל של חומר מושך כימי (chemo attractant). שינויים אלו מעידים על כך שהזרעים מפגינים העדפה לשחות במעלה המפל לעבר החומר המושך הכימי. בעת ביצוע שני הבדיקות הללו, חשוב לזכור כי תשומת לב לטעינה נכונה של הזרעים והחומר המושך הכימי בכל מכשיר היא קריטית להשגת מפל כימוטקטי הניתן לשחזור בביצועי הזרעים.

two-types-of-assays-for-detecting-frog-sperm-chemoattraction

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic...

Assay Chemotaxis סי אלגנס

יכולת התחרותית ההפרש בין...

הבדלי שומה ביכולת תחרותית בזרע<em&gt; דרוזופילה</em

Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

כאן, אנו מציגים מתודולוגיות להעריך spermatozoan הקרומיות, הסלולר תכונה המשויכת מיומנות ההפריה של הזרע. אנו מתארים שלוש טכניקות להערכה fluorimetric של זרע ממברנות: צביעת בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות cytometry זרימה זרע ייעודיים מתקדמים. דוגמאות של שילוב מתודולוגיות של מוצגים.

Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע

הנה, שני מבחני תפוקה בינונית עבור הערכה של השפעות על Ca2 +-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי מתוארים. מבחני אלה יכולים לשמש בקלות ובמהירות מסך כמויות גדולות של תרכובות עבור אפקטים על Ca2 +-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי.

הקרנת מבחני עבור הערכה של השפעות על Ca2 +תפוקה בינונית-איתות ותגובה Acrosome זרע אנושי

זרע חייב לנווט בהצלחה דרך צינור ההטלה כדי להפרות oocyte. כאן אנו מתארים את הבקשה למדידת העברת זרע  בתוך הרחם הדו. הדבר יכול לספק נתונים כמותיים על חלוקת זרע בתוך הרחם לאחר ההזדווגות, כמו גם על מהירות, מהירות כיוונית ותדר היפוך.

מדידת הדרכה זרע ותנועתיות בתוך האלגיה של מערכת הרבייה של האנדרוגינוס

אנו מתארים את היישום של מנתח השטף של מסחטות כדי לנטר שינויים בזמן אמת ב גליקוליזיס וזרחון חמצוני במהלך מדרכיכים זרע העכבר.

באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקר התחרותיות הזדווגות של Aedes aegypti זכר באמצעות צבע פלואורסצנטי כסמן. נקבות היתושים חשופות הן לזכרים מסומנים והן לזכרים לא מסומנים להזדווגות. לאחר ההזדווגות, הזרע שלהם נבדקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את בן זוגם להזדווגות.

באמצעות צבע פלואורסצנטי, רודמין B, כדי ללמוד תחרותיות הזדווגות יתושים Aedes aegypti זכר

כאשר שינוי גורם גדילה ß חלבונים מבשר המשפחה באים לידי ביטוי חוץ רחמי בעוברים קסנופוס laevis, הם עמעם, לקבל מבקעים ומופרשים לתוך blastocoele, אשר מתחיל בפיצוץ מאוחר לשלב gastrula מוקדם. אנו מתארים שיטה לשאיפה של מוצרי מחשוף מחלל הפיצוץ לניתוח אימונובלוט.

ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של קסנופוס laevis עוברים

פרוטוקול זה קובע שיטות לחילוץ וכימות תגובות לפרומון המין הנדיף ב- C. elegans, ומספק כלים לחקר תקשורת כימית ומסלול ניווט.

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

למדו שיטות להערכת כימואטרקציה של זרע צפרדע באמצעות מבחני שני תאים ומצלמת זיגמונד. השוואה בין צבירת זרע למעקב וידאו מאפשרת ניתוח כמותי ודינמי של תנועת הזרע.

שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע

גלה סרטונים נוספים