Name: ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: למד לנטר פעילות קינאז ופוספטאז במחזור התא באמצעות דיווחי FRET בתאי U2 OS חיים. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר שינויים בפוספורילציה במעבר מ-G2 ל-M.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים נתמכים על ידי המועצה למחקר השוודי, הבסיס שוודית למחקר אסטרטגי, החברה השוודית סרטן, החברה השוודית סרטן ילדים, האייק Wibergs הקרן Jeanssons הקרן.

1. הצגת בדיקה לתאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Co-transfect תאים עם סריג בדיקה מבוססות לבין פלסמיד המקנה עמידות. בחר שיטת transfection כי הוא יעיל בסוג התא העניין שלך. עבור תאים U2OS, רמת סידן פוספט שיטות transfection לתת תוצאות נאות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תאים אנטיביוטיקה המתאימה לפחות שבעה ימים. זה מעשיר את כמות התאים המבטאים את בדיקה מגביל את כמות התאים עם רמות ביטוי רעיל, או רמות ביטוי חמור להשפיע על מחזור התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) בחר עבור שיבוטים יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתאי קבוע או לחיות, ודא כי הן CFP ו YFP נמצאים בכל התאים ביחס בקירוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה תאים מסוימים מכילים רק CFP או YFP, רקומבינציה אירעה סביר. רקומבינציה יכולה להתרחש גם במהלך התפתחות חיידקים או אחרי transfection של החללית והוא רשאי במקרה האחרון תלוי באיכות פלסמיד. חזור p פלסמידפיצוי ו linearize הפלסמיד לפני transfection אם הבעיה נמשכת. </li></ol> 2. Ratiometric ניטור סריג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים תאים בתחתית צלחות זכוכית, או תלושי כיסוי הרכבה בתא. ודא כי מנות / תלושי לכסות אינם 1.5 (170 מיקרומטר עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תאים בינוני צמיחה ללא פנול אדום על מיקרוסקופ epifluorescence ממונע עם בקרת טמפרטורה מוגדר 37 ° C. ודא תקנה pH של התקשורת, או על ידי ה-CO 2 או באמצעות ה-CO 2 עצמאית מדיה כגון לייבוביץ-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על תאים באמצעות האור המועבר. אל תסתכל על תאים באמצעות אור ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי רכישת תמונה 12 או 16 ביט באמצעות עירור YFP (YFPex) ו YFP פליטה (YFPem) מסננים מראה dichroic מתאים. השתמש binning מקסימלי זמין עדיין מאפשר רזולוציה subcellular הנדרש. שימוש binning גבוהה כדי להקטין זמן חשיפה או אינטנסיביות חיונית כדי למנוע phototoxicity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליasure או להעריך את עוצמת רקע הרעש המשוער על ידי מדידת או הערכת ממוצע גס, מינימום ערכי הפיקסלים המרבית באזור נטול תאים. שינוי זמן החשיפה ומסננים צפיפות ניטרלי, כך האות הממוצע בתא הוא כ עוצמת הרקע פלוס חמש עד עשר פעמים את ההבדל בין מקס בעוצמות דקות רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי התמונות לא קרובים להיות רווי. העוצמה המקסימלית של התמונה צריך להיות פחות ממחצית של טווח דינמי (למשל מקסימום 2000 בתמונת 12 ביט), כדי לאפשר ההבדלים בעוצמה כאשר תאים להיכנס מיטוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4-2.6 באמצעות עירור ופליטה CFP מסננים YFP ומראה dichroic מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באזורים מרובים עם תאים transfected, למעט באזורים המשמשים נקודת 2.4-2.7, ולוודא כי העוצמה המקסימלית היא פחות ממחצית הטווח הדינמי בכל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ניסוי זמן לשגות רכישת שתי תמונות כל 45 דקות באמצעות YFPex - YFPem ו CFPex - YFPem קובע הסינון. </li></ol> 3. אימות וייעול התנאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות רכשה ולנטר את מחזור התא בזמן מן מיטוזה כדי מיטוזה של תאים המבטאים את החללית transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואת מחזור נמדד זמן תא לנתונים שפורסמו עבור סוג תא בשימוש. לחילופין, סרט untransfected תאים באמצעות רכישת תמונה אחת של אור מועבר רק (DIC למשל או שלב בניגוד) בכל שעה כדי לקבל תא התייחסות זמני המחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של זמן עד מיטוזה מיטוזה מתאים התייחסות תזמוני מחזור התא, המשך לשלב 4. לחלופין, לרכוש מחדש תמונות באמצעות חשיפה קשה יותר, יותר זמן או נקודות מרובות Z-רמות וחזור על שלב 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה בזמן מן מיטוזה כדי מיטוזה לא מתאימות התייחסות מחזור תזמוני התא, הסרט transfected תאים באמצעות רכישת תמונה אחת של אור מועבר רק (DIC למשל או שלב בניגוד) כל שעה ואחריו תמונה אחת בסוףהניסוי כדי לזהות תאים transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים transfected עדיין להראות פעמים מחזור התא יותר, חזור על שלב 1 אבל transfect בדיקה פחות או לבחור עבור שיבוטים יציב המכילים כמויות נמוכות מאוד של בדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים transfected להראות נורמלי מחזור התא פעמים בהעדר אור ניאון, חזור על שלב 2 אבל חשיפה נמוכה יותר על ידי שינוי binning, מסננים צפיפות ניטרלי, זמן חשיפה, זמן בין תמונות. </li></ol> 4. ניתוח סריג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניתוח יכול להתבצע על ידי רוב התוכנות המוקדש במיקרוסקופ. כאן אנו מתארים כיצד לבצע את הניתוח באמצעות ImageJ freeware ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> ) ניצול יחס תוסף פלוס ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות ImageJ. בכל מקרה התמונות שלך הן בפורמט של stac ססגוניותk (למשל DeltaVision), להפריד את הערוצים הנפרדים על ידי הראשון הפיכתם hyperstack: Image-hyperstack מחסנית ל hyperstack ולאחר מכן לפצל אותם ערימות ערוץ אחד באמצעות: Image-hyperstack-להפחית ממדיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפלת YFPex - מחסנית YFPem עם 3 באמצעות: Process-Math-הכפל שלב זה הוא אופציונלי, שכן הוא נועד אך ורק כדי להגביר את בהירות הראייה של התמונות על ידי הקפדה יחסי אינם בטווח בין 0 ל -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב YFPex - מחסנית YFPem, צייר באזור של עניין (ROI) באזור כי הוא נטול תאים, אבל זה קרוב לתא כדי להימדד. תאים שונים באותה תמונה עשויה לדרוש באזורים שונים, כמו גם הרקע ועוצמת אות הוא בדרך כלל החזק במרכז התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההחזר על ההשקעה ROI אל מנהל: Analyze-tools-ROI מנהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את העוצמה הממוצעת של ההחזר על ההשקעה הן YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem: Analyze-מדוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על timepoints מרובים לוודא כי בעוצמות רקע קרוב לתא עניין דומים לאורך כל הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט מדידות לכלול בעוצמה מינימלית: Analyze-Set-Min מידות וערך מקס אפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של אינטרס המכסים את רוב התא ולמדוד את עוצמת מינימלי הן YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem. קח את ההבדל בין עוצמת מינימלי נמדד עוצמת הרקע 4.6 ומחלקים אותו על ידי שני. זה מספק הערכה מוצא ערך גזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחס פתוח פלוס. בחר את YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem. עבור סריג יחס, בחר CFPex - YFPem כמו מחסנית 1, עבור סריג יחס הפוך בדיקות הדמיה שבו סריג פוחתת יעילות על זירחון, בחר YFPex - YFPem כמו ערימה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את עוצמות רקע נמדד בערכים גזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה של מחסנית יחס וכתוצאה מכך ולהחיל u נראים מתאימיםp טבלה (LUT) כדי לחזות שינויים יחס. </li></ol> 5. נציג תוצאות Plk1 הפעילות הגלויה הראשונה בגרעין בשלב ופסגות G2 במהלך מיטוזה. איור 3 מציג ניסוי באמצעות הגדרות phototoxicity מינימלי כמתואר בסעיף 2. שים לב כי זוהי תוצאה ראשונית נציג וכי התנאים חשיפה או הזמן בין דמויות יכולות להיות משונות כדי להגדיל את יחס אות לרעש או רזולוציה טמפורלית. איור 3D מראה כי רוב התאים המבטאים את החללית להתרבות עם זמן מחזור של תא בין 20 ל 25 שעות, המציין את התנאים הדמיה רמות הביטוי של החללית אינם משפיעים על תזמון מחזור התא. למרות שיש רעש רב, את המגמה של הגדלת הפעילות Plk1 G2 ו peaking ב מיטוזה 14 נראה בבירור (איור 3A). עיבוד הנתונים הגולמיים, כאן על ידי מתכוון סינון כפי שהוצגו רשם גלים (איור 3B), או כימות של ra הפוך הממוצע טיו (תאנה 3C) יכול לשפר את הבהירות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. עקרון בדיקה סריג מבוסס לפקח פעילות קינאז ו phosphatase. שני fluorophores, בדרך כלל CFP (כחול) YFP (ירוק), מחוברים על ידי תחום phospho מחייבים (כתום) רצף phosphorylatable (צהוב). (אדום) זירחון מתווכת מחייב תחום phospho מחייב, ובכך גרימת שינוי קונפורמציה החללית. השינוי בתוצאות קונפורמציה הבדל במרחק או נטייה בין שני fluorophores, אשר משפיע על היעילות בין סריג CFP ו YFP. סריג ניתן דמיינו ידי CFP מרגש וניטור YFP פליטה (קווים מקווקווים). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> באיור 2. המתאר סכמטי של הליך ניסיוני. p_upload/3410/3410fig3.jpg "/&gt; באיור 3. Plk1 הפעילות הגלויה הראשונה בגרעין בשלב ופסגות G2 במהלך מיטוזה. תאים U2OS להביע סריג מבוססי ניטור בדיקה Plk1 פעילות 9,14 צולמו במשך 60 שעות באמצעות מערכת דימות Spectris DeltaVision מצויד מטרה 20x 0.7 אוויר NA ומנורת כספית. תנאי ההדמיה נבחרו כדי לגרום phototoxicity מינימלי, כפי שמתואר בסעיף 2, באמצעות binning 4x ומסננים צפיפות ניטרלי כי 99% בלוק של האור הנכנס. צבע, מצג שווא של יחס הפוך סריג, בעקבות תא אחד באמצעות 4 חטיבות. ב ', רשם גלים של התא מוצג לאחר החלת מסנן מתכוון. C, כימות של יחס הפוך סריג של התא מוצג א 'ד', כניסה mitotic מצטברת של 50 סריג, בדיקה תאים להביע, כולל חטיבות של לתאי הבת.

<ol><li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+microscopy+in+2010%3A+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li>
<li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li>
<li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B%2FAkt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li>
<li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li>
<li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li>
<li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li>
<li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li>
<li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li>
<li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 Forthcoming.</li>
<li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorgan%2C+DO+%22The+cell+cycle+%3A+principles+of+control%22">The cell cycle : principles of control</a>. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).</li>
<li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+decision+to+enter+mitosis%3A+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li>
<li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li>
<li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+free%2C+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

ניטור סריג לאורך מחזור התא דורש השיקולים הם קריטיים פחות כאשר מעריכים לטווח קצר תגובות לגירויים חיצוניים. ראשית, התקדמות מחזור התא בקלות מוטרד איתות מתח, המחייב phototoxicity היא למינימום. שנית, כל הכתבים עלולה להשפיע על תהליכים תאיים על ידי titrating החוצה קינאזות, phosphatases או תחומים אינטראקציה. הדרך כנראה פשוטה ביותר על מנת להעריך אם תנאי הניסוי מספיקות היא למדוד את אורך מחזור התא מיטוזה כדי מיטוזה ולהשוות אותה ניסויים עצמאיים של הדמיה ביטוי הקרינה של בדיקה. <p class="jo...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> מספר קטלוגי </td><td> חברה </td></tr><tr><td> ליבוביץ L-15, לא פנול אדום </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0.05% טריפסין EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי ratiometric סריג

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) מבוסס לכתבים 1 לאפשר הערכה של קינאז אנדוגני ופעילויות phosphatase בתאים חיים. בדיקות אלו בדרך כלל מורכבות של וריאנטים של CFP ו YFP, התערב על ידי רצף phosphorylatable ואת תחום phospho מחייב. לאחר זירחון, השינויים בדיקה הקונפורמציה, שתוצאתה שינוי המרחק או נטייה בין CFP ו YFP, מוביל לשינוי סריג יעילות (איור 1). מספר בדיקות פורסמו בעשור האחרון, מעקב אחר יתרת הפעילות של קינאזות ו phosphatases מרובות, כולל כתבים של 2 PKA, PKB 3, 4 PKC, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, אורורה B 9 ו 9 Plk1 . בהתחשב עיצוב מודולרי, בדיקות נוספות צפויות לצאת ב 10 בעתיד הקרוב. התקדמות דרך מחזור התא מושפע מתח signaling 11 מסלולים. יש לציין, מחזור התא מוסדר באופן שונה במהלך שאנן צמיחה לעומת כאשר התאים הם מחלים מתח 12. זמן לשגות הדמיה של התאים דרך מחזור התא ולכן מחייב זהירות מיוחדת. זה הופך לבעיה במיוחד כאשר העסקת הדמיה ratiometric, שכן שתי תמונות עם האות גבוה יחס רעש נדרשים לפרש את התוצאות. Ratiometric סריג הדמיה של מחזור התא משתנה תלוי בפעילות קינאז ו phosphatase יש ברובה הוגבלה סעיפים קטנים של מחזור התא 8,9,13,14. כאן, אנו דנים בשיטה כדי לפקח על סריג מבוססי בדיקות הדמיה באמצעות ratiometric לאורך מחזור התא האנושי. השיטה מסתמכת על הציוד העומד לרשות חוקרים רבים במדעי החיים ואינו דורש ידע מומחה של מיקרוסקופיה או עיבוד תמונה.

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

דיווחים (reporters) המבוססים על העברה של אנרגיית תהודה של פריסטר (FRET) מאפשרים הערכה של פעילויות קינאז ופוספטאז אנדוגניות בתאים חיים. אלו...

בסרטון זה, פעילות של קינאז ופוספטאז מנוטרת לאורך מחזור התא באמצעות העברת אנרגיה בתהודה של פורסטר, או FRET. כאן, גשש לפעילות של Polo-like kinase 1 או PLK1 כולל חלבון פלואורסצנטי כחול CFP בקצה אחד וחלבון פלואורסצנטי צהוב YFP בקצה השני. גשש זה מותמר לתוך תאי U2 OS.כדי לבחון את מצב הפוספורילציה של יעדי LK במהלך המעבר בין G2 ל-M, תאי U2 OS שעברו טרנספקציה מועברים לדימיג' פלואורסצנציה בשיטת time lapse. כאשר CFP ו-YFP נמצאים בקרבה רבה ו-CFP מעורר, אנרגיה מועברת ל-YFP וניתן לזהות פליטה של YFP. עם זאת, כאשר הגשוש הופך למפוספוריל, שינוי קונפורמציוני בחלבון מפריד בין CFP ל-YFP.כעת, כאשר CFP מעורר, מזוהים פליטת CFP חזקה ופליטת YFP חלשה בלבד; כימות של יחס פליטת YFP לאחר עירור של CFP ו-YFP מדגים כי פעילות PLK 1 עולה בשלב G2 ומגיעה לשיאה במהלך המיטוזה. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צילום גיאומטרי סטנדרטי, הוא ההקפדה על כך שסבב התא אינו מופר, הן על ידי תנאי הצילום והן על ידי ביטוי של הגשוש. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום סבב התא, כגון היכן ומתי קינזות או פוספטאזים ספציפיים מופעלים.אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אנזימים המווסתים את מחזור התא, ניתן ליישמה גם במערכות אחרים הדורשות תנאי סנכרון (unres), כגון בדיקות פרוליפרציה של תאים. כדי לנטר את מחזור ה

monitoring-kinase-phosphatase-activities-through-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

סרטון זה מתאר את העברת אנרגיית התהודה של Förster שנפתרה בזמן או בדיקת TR-FRET כדי לקבוע זרחן חלבון אנדוגני בעזרת פלואורופורים של תורם ומקבל המתויגים על נוגדנים ספציפיים לחלבון בדיקה. טכניקה זו נועדה למדוד את הזרחן של חלבוני בדיקה בליזטים תאיים.

העברת אנרגיית תהודה פורסטר שנפתרה בזמן לניטור זרחן חלבונים בתאים

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

ההפעלה של סר/ת'ר קינאז AURKA רב תכליתית מסומנת על ידי ההתפשטות האוטומטית שלה על Thr288. בדיקות פלואורסצנטיות המסתמכות על FRET יכולות להפלות בין המצבים הלא פעילים והפעילים שלה. כאן, אנו מדגימים כמה אסטרטגיות להנדסת בדיקה, יחד עם פרוטוקול FRET מהיר כדי לעקוב אחר הפעלת קינאז לאורך מיטוזה.

ניטור בזמן אמת של אורורה קינאז הפעלה באמצעות Biosensors FRET קונפורמציה בתאים חיים

פרוטוקולי בדיקה מבוססי תאים מבוססי-בסיס של Förster, שנפתרו בזמן, מתוארים עבור הכימות הפשוט, הספציפי, הרגיש והחזק של מתמר אותות זרחן אנדוגני ומפעיל של תמלול (STAT) 1/3/4/5/6 חלבונים בתאים ליסטים בפורמט של 384 בארות.

בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ  במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות הדינמיקה המרחבית-זמנית של הפעלת Akt וזרחון בתאי HepG2 חיים. הדמיית העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא כלי רב עוצמה המספק תובנות חשובות לגבי מסלולי איתות אינסולין וויסות מטבולי בתאי סרטן.

הדמיית העברת אנרגיית תהודה של תאים חיים של דינמיקת הפעלת Akt מווסתת מטבולית בתאי HepG2

למד לנטר פעילות קינאז ופוספטאז במחזור התא באמצעות דיווחי FRET בתאי U2 OS חיים. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר שינויים בפוספורילציה במעבר מ-G2 ל-M.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

גלה סרטונים נוספים