Name: ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: למד לנטר פעילות קינאז ופוספטאז במחזור התא באמצעות דיווחי FRET בתאי U2 OS חיים. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר שינויים בפוספורילציה במעבר מ-G2 ל-M.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים נתמכים על ידי המועצה למחקר השוודי, הבסיס שוודית למחקר אסטרטגי, החברה השוודית סרטן, החברה השוודית סרטן ילדים, האייק Wibergs הקרן Jeanssons הקרן.

1. הצגת בדיקה לתאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Co-transfect תאים עם סריג בדיקה מבוססות לבין פלסמיד המקנה עמידות. בחר שיטת transfection כי הוא יעיל בסוג התא העניין שלך. עבור תאים U2OS, רמת סידן פוספט שיטות transfection לתת תוצאות נאות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תאים אנטיביוטיקה המתאימה לפחות שבעה ימים. זה מעשיר את כמות התאים המבטאים את בדיקה מגביל את כמות התאים עם רמות ביטוי רעיל, או רמות ביטוי חמור להשפיע על מחזור התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) בחר עבור שיבוטים יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתאי קבוע או לחיות, ודא כי הן CFP ו YFP נמצאים בכל התאים ביחס בקירוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה תאים מסוימים מכילים רק CFP או YFP, רקומבינציה אירעה סביר. רקומבינציה יכולה להתרחש גם במהלך התפתחות חיידקים או אחרי transfection של החללית והוא רשאי במקרה האחרון תלוי באיכות פלסמיד. חזור p פלסמידפיצוי ו linearize הפלסמיד לפני transfection אם הבעיה נמשכת. </li></ol> 2. Ratiometric ניטור סריג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים תאים בתחתית צלחות זכוכית, או תלושי כיסוי הרכבה בתא. ודא כי מנות / תלושי לכסות אינם 1.5 (170 מיקרומטר עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תאים בינוני צמיחה ללא פנול אדום על מיקרוסקופ epifluorescence ממונע עם בקרת טמפרטורה מוגדר 37 ° C. ודא תקנה pH של התקשורת, או על ידי ה-CO 2 או באמצעות ה-CO 2 עצמאית מדיה כגון לייבוביץ-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על תאים באמצעות האור המועבר. אל תסתכל על תאים באמצעות אור ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי רכישת תמונה 12 או 16 ביט באמצעות עירור YFP (YFPex) ו YFP פליטה (YFPem) מסננים מראה dichroic מתאים. השתמש binning מקסימלי זמין עדיין מאפשר רזולוציה subcellular הנדרש. שימוש binning גבוהה כדי להקטין זמן חשיפה או אינטנסיביות חיונית כדי למנוע phototoxicity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליasure או להעריך את עוצמת רקע הרעש המשוער על ידי מדידת או הערכת ממוצע גס, מינימום ערכי הפיקסלים המרבית באזור נטול תאים. שינוי זמן החשיפה ומסננים צפיפות ניטרלי, כך האות הממוצע בתא הוא כ עוצמת הרקע פלוס חמש עד עשר פעמים את ההבדל בין מקס בעוצמות דקות רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי התמונות לא קרובים להיות רווי. העוצמה המקסימלית של התמונה צריך להיות פחות ממחצית של טווח דינמי (למשל מקסימום 2000 בתמונת 12 ביט), כדי לאפשר ההבדלים בעוצמה כאשר תאים להיכנס מיטוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4-2.6 באמצעות עירור ופליטה CFP מסננים YFP ומראה dichroic מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באזורים מרובים עם תאים transfected, למעט באזורים המשמשים נקודת 2.4-2.7, ולוודא כי העוצמה המקסימלית היא פחות ממחצית הטווח הדינמי בכל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ניסוי זמן לשגות רכישת שתי תמונות כל 45 דקות באמצעות YFPex - YFPem ו CFPex - YFPem קובע הסינון. </li></ol> 3. אימות וייעול התנאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות רכשה ולנטר את מחזור התא בזמן מן מיטוזה כדי מיטוזה של תאים המבטאים את החללית transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואת מחזור נמדד זמן תא לנתונים שפורסמו עבור סוג תא בשימוש. לחילופין, סרט untransfected תאים באמצעות רכישת תמונה אחת של אור מועבר רק (DIC למשל או שלב בניגוד) בכל שעה כדי לקבל תא התייחסות זמני המחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של זמן עד מיטוזה מיטוזה מתאים התייחסות תזמוני מחזור התא, המשך לשלב 4. לחלופין, לרכוש מחדש תמונות באמצעות חשיפה קשה יותר, יותר זמן או נקודות מרובות Z-רמות וחזור על שלב 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה בזמן מן מיטוזה כדי מיטוזה לא מתאימות התייחסות מחזור תזמוני התא, הסרט transfected תאים באמצעות רכישת תמונה אחת של אור מועבר רק (DIC למשל או שלב בניגוד) כל שעה ואחריו תמונה אחת בסוףהניסוי כדי לזהות תאים transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים transfected עדיין להראות פעמים מחזור התא יותר, חזור על שלב 1 אבל transfect בדיקה פחות או לבחור עבור שיבוטים יציב המכילים כמויות נמוכות מאוד של בדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים transfected להראות נורמלי מחזור התא פעמים בהעדר אור ניאון, חזור על שלב 2 אבל חשיפה נמוכה יותר על ידי שינוי binning, מסננים צפיפות ניטרלי, זמן חשיפה, זמן בין תמונות. </li></ol> 4. ניתוח סריג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניתוח יכול להתבצע על ידי רוב התוכנות המוקדש במיקרוסקופ. כאן אנו מתארים כיצד לבצע את הניתוח באמצעות ImageJ freeware ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> ) ניצול יחס תוסף פלוס ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות ImageJ. בכל מקרה התמונות שלך הן בפורמט של stac ססגוניותk (למשל DeltaVision), להפריד את הערוצים הנפרדים על ידי הראשון הפיכתם hyperstack: Image-hyperstack מחסנית ל hyperstack ולאחר מכן לפצל אותם ערימות ערוץ אחד באמצעות: Image-hyperstack-להפחית ממדיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפלת YFPex - מחסנית YFPem עם 3 באמצעות: Process-Math-הכפל שלב זה הוא אופציונלי, שכן הוא נועד אך ורק כדי להגביר את בהירות הראייה של התמונות על ידי הקפדה יחסי אינם בטווח בין 0 ל -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב YFPex - מחסנית YFPem, צייר באזור של עניין (ROI) באזור כי הוא נטול תאים, אבל זה קרוב לתא כדי להימדד. תאים שונים באותה תמונה עשויה לדרוש באזורים שונים, כמו גם הרקע ועוצמת אות הוא בדרך כלל החזק במרכז התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההחזר על ההשקעה ROI אל מנהל: Analyze-tools-ROI מנהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את העוצמה הממוצעת של ההחזר על ההשקעה הן YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem: Analyze-מדוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על timepoints מרובים לוודא כי בעוצמות רקע קרוב לתא עניין דומים לאורך כל הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט מדידות לכלול בעוצמה מינימלית: Analyze-Set-Min מידות וערך מקס אפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של אינטרס המכסים את רוב התא ולמדוד את עוצמת מינימלי הן YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem. קח את ההבדל בין עוצמת מינימלי נמדד עוצמת הרקע 4.6 ומחלקים אותו על ידי שני. זה מספק הערכה מוצא ערך גזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחס פתוח פלוס. בחר את YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem. עבור סריג יחס, בחר CFPex - YFPem כמו מחסנית 1, עבור סריג יחס הפוך בדיקות הדמיה שבו סריג פוחתת יעילות על זירחון, בחר YFPex - YFPem כמו ערימה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את עוצמות רקע נמדד בערכים גזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה של מחסנית יחס וכתוצאה מכך ולהחיל u נראים מתאימיםp טבלה (LUT) כדי לחזות שינויים יחס. </li></ol> 5. נציג תוצאות Plk1 הפעילות הגלויה הראשונה בגרעין בשלב ופסגות G2 במהלך מיטוזה. איור 3 מציג ניסוי באמצעות הגדרות phototoxicity מינימלי כמתואר בסעיף 2. שים לב כי זוהי תוצאה ראשונית נציג וכי התנאים חשיפה או הזמן בין דמויות יכולות להיות משונות כדי להגדיל את יחס אות לרעש או רזולוציה טמפורלית. איור 3D מראה כי רוב התאים המבטאים את החללית להתרבות עם זמן מחזור של תא בין 20 ל 25 שעות, המציין את התנאים הדמיה רמות הביטוי של החללית אינם משפיעים על תזמון מחזור התא. למרות שיש רעש רב, את המגמה של הגדלת הפעילות Plk1 G2 ו peaking ב מיטוזה 14 נראה בבירור (איור 3A). עיבוד הנתונים הגולמיים, כאן על ידי מתכוון סינון כפי שהוצגו רשם גלים (איור 3B), או כימות של ra הפוך הממוצע טיו (תאנה 3C) יכול לשפר את הבהירות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. עקרון בדיקה סריג מבוסס לפקח פעילות קינאז ו phosphatase. שני fluorophores, בדרך כלל CFP (כחול) YFP (ירוק), מחוברים על ידי תחום phospho מחייבים (כתום) רצף phosphorylatable (צהוב). (אדום) זירחון מתווכת מחייב תחום phospho מחייב, ובכך גרימת שינוי קונפורמציה החללית. השינוי בתוצאות קונפורמציה הבדל במרחק או נטייה בין שני fluorophores, אשר משפיע על היעילות בין סריג CFP ו YFP. סריג ניתן דמיינו ידי CFP מרגש וניטור YFP פליטה (קווים מקווקווים). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> באיור 2. המתאר סכמטי של הליך ניסיוני. p_upload/3410/3410fig3.jpg "/&gt; באיור 3. Plk1 הפעילות הגלויה הראשונה בגרעין בשלב ופסגות G2 במהלך מיטוזה. תאים U2OS להביע סריג מבוססי ניטור בדיקה Plk1 פעילות 9,14 צולמו במשך 60 שעות באמצעות מערכת דימות Spectris DeltaVision מצויד מטרה 20x 0.7 אוויר NA ומנורת כספית. תנאי ההדמיה נבחרו כדי לגרום phototoxicity מינימלי, כפי שמתואר בסעיף 2, באמצעות binning 4x ומסננים צפיפות ניטרלי כי 99% בלוק של האור הנכנס. צבע, מצג שווא של יחס הפוך סריג, בעקבות תא אחד באמצעות 4 חטיבות. ב ', רשם גלים של התא מוצג לאחר החלת מסנן מתכוון. C, כימות של יחס הפוך סריג של התא מוצג א 'ד', כניסה mitotic מצטברת של 50 סריג, בדיקה תאים להביע, כולל חטיבות של לתאי הבת.

<ol><li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+microscopy+in+2010%3A+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li>
<li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li>
<li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B%2FAkt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li>
<li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li>
<li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li>
<li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li>
<li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li>
<li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li>
<li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 Forthcoming.</li>
<li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorgan%2C+DO+%22The+cell+cycle+%3A+principles+of+control%22">The cell cycle : principles of control</a>. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).</li>
<li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+decision+to+enter+mitosis%3A+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li>
<li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li>
<li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+free%2C+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

ניטור סריג לאורך מחזור התא דורש השיקולים הם קריטיים פחות כאשר מעריכים לטווח קצר תגובות לגירויים חיצוניים. ראשית, התקדמות מחזור התא בקלות מוטרד איתות מתח, המחייב phototoxicity היא למינימום. שנית, כל הכתבים עלולה להשפיע על תהליכים תאיים על ידי titrating החוצה קינאזות, phosphatases או תחומים אינטראקציה. הדרך כנראה פשוטה ביותר על מנת להעריך אם תנאי הניסוי מספיקות היא למדוד את אורך מחזור התא מיטוזה כדי מיטוזה ולהשוות אותה ניסויים עצמאיים של הדמיה ביטוי הקרינה של בדיקה. <p class="jo...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> מספר קטלוגי </td><td> חברה </td></tr><tr><td> ליבוביץ L-15, לא פנול אדום </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0.05% טריפסין EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי ratiometric סריג

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) מבוסס לכתבים 1 לאפשר הערכה של קינאז אנדוגני ופעילויות phosphatase בתאים חיים. בדיקות אלו בדרך כלל מורכבות של וריאנטים של CFP ו YFP, התערב על ידי רצף phosphorylatable ואת תחום phospho מחייב. לאחר זירחון, השינויים בדיקה הקונפורמציה, שתוצאתה שינוי המרחק או נטייה בין CFP ו YFP, מוביל לשינוי סריג יעילות (איור 1). מספר בדיקות פורסמו בעשור האחרון, מעקב אחר יתרת הפעילות של קינאזות ו phosphatases מרובות, כולל כתבים של 2 PKA, PKB 3, 4 PKC, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, אורורה B 9 ו 9 Plk1 . בהתחשב עיצוב מודולרי, בדיקות נוספות צפויות לצאת ב 10 בעתיד הקרוב. התקדמות דרך מחזור התא מושפע מתח signaling 11 מסלולים. יש לציין, מחזור התא מוסדר באופן שונה במהלך שאנן צמיחה לעומת כאשר התאים הם מחלים מתח 12. זמן לשגות הדמיה של התאים דרך מחזור התא ולכן מחייב זהירות מיוחדת. זה הופך לבעיה במיוחד כאשר העסקת הדמיה ratiometric, שכן שתי תמונות עם האות גבוה יחס רעש נדרשים לפרש את התוצאות. Ratiometric סריג הדמיה של מחזור התא משתנה תלוי בפעילות קינאז ו phosphatase יש ברובה הוגבלה סעיפים קטנים של מחזור התא 8,9,13,14. כאן, אנו דנים בשיטה כדי לפקח על סריג מבוססי בדיקות הדמיה באמצעות ratiometric לאורך מחזור התא האנושי. השיטה מסתמכת על הציוד העומד לרשות חוקרים רבים במדעי החיים ואינו דורש ידע מומחה של מיקרוסקופיה או עיבוד תמונה.

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

דיווחים (reporters) המבוססים על העברה של אנרגיית תהודה של פריסטר (FRET) מאפשרים הערכה של פעילויות קינאז ופוספטאז אנדוגניות בתאים חיים. אלו...

בסרטון זה, פעילות של קינאז ופוספטאז מנוטרת לאורך מחזור התא באמצעות העברת אנרגיה בתהודה של פורסטר, או FRET. כאן, גשש לפעילות של Polo-like kinase 1 או PLK1 כולל חלבון פלואורסצנטי כחול CFP בקצה אחד וחלבון פלואורסצנטי צהוב YFP בקצה השני. גשש זה מותמר לתוך תאי U2 OS.כדי לבחון את מצב הפוספורילציה של יעדי LK במהלך המעבר בין G2 ל-M, תאי U2 OS שעברו טרנספקציה מועברים לדימיג' פלואורסצנציה בשיטת time lapse. כאשר CFP ו-YFP נמצאים בקרבה רבה ו-CFP מעורר, אנרגיה מועברת ל-YFP וניתן לזהות פליטה של YFP. עם זאת, כאשר הגשוש הופך למפוספוריל, שינוי קונפורמציוני בחלבון מפריד בין CFP ל-YFP.כעת, כאשר CFP מעורר, מזוהים פליטת CFP חזקה ופליטת YFP חלשה בלבד; כימות של יחס פליטת YFP לאחר עירור של CFP ו-YFP מדגים כי פעילות PLK 1 עולה בשלב G2 ומגיעה לשיאה במהלך המיטוזה. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צילום גיאומטרי סטנדרטי, הוא ההקפדה על כך שסבב התא אינו מופר, הן על ידי תנאי הצילום והן על ידי ביטוי של הגשוש. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום סבב התא, כגון היכן ומתי קינזות או פוספטאזים ספציפיים מופעלים.אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אנזימים המווסתים את מחזור התא, ניתן ליישמה גם במערכות אחרים הדורשות תנאי סנכרון (unres), כגון בדיקות פרוליפרציה של תאים. כדי לנטר את מחזור התא האנושי, תאי U2 OS עוברים טרנספקציה עם גשש פעילות של PK1 המבוסס על FRET. באמצעות שיטת טרנספקציה סטנדרטית של סידן-פוספט, התאים נבחרים ב-puromycin למשך שבעה ימים לפחות.שלב זה מעשיר את אוכלוסיית התאים המבטאים את הגשש ומגביל את מספר התאים בעלי רמות ביטוי רעילות או רמות ביטוי המשפיעות קשות על מחזור התא. לאחר מכן נבחרים שיבוטים יציבים באמצעות דילול מוגבל לבדיקת ביטוי של CFP, ולאחר מכן נבחן ביטוי של YFP כדי לוודא שהם נוכחים בכל התאים ביחס דומה בקירוב. אם חלק מהתאים מכילים רק CFP או YFP, סביר להניח שהתרחש רקומבינציה; במקרה זה, יש לחזור על הכנת הפלסמיד תוך שימוש בחיידקים הפחות נוטים לרקומבינציה הומולוגית, כגון תאי sure 2, ולאחר מכן לבצע ליניאריזציה לפלסמיד ולחזור על התעתוק.לאחר שהתאים מביעים את הגשש באופן יציב, זרע אותם בצלחות עם תחתית זכוכית בעובי 1.5 לאחר שהם נצמדו והגיעו ל-30 עד 50% התמזגות (confluency). החלף את המצע למצע שאינו תלוי CO2 ואינו מכיל פנול אדום, והנח את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיגנטי ממוטור מתוך הגדרה של בקרת טמפרטורה ל-37 °C. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד במסנני עירור ופליטה עבור CFP ו-YFP.מראת ROIC המתאימה לניטור CFP ו-YFP ועדשה המתאימה לרזולוציה הנדרשת. במקרה זה, נעשה שימוש בעדשת אוויר 20 x NA 0.75. בעזרת אור תבנית (transmitted light), הגבירו את התאים למיקוד.אין להשתמש בתאורה פלואורסצנטית בשלב זה, כיוון שהיא תגרום לתגובת מאמץ שעלולה להפריע למחזור התא. כדי למנוע פוטו-טוקסיות, הגדירו את הכיפוף למקסימום הזמין המאפשר את הרזולוציה התת-תאית הנדרשת. בניסוי זה, צריכה להיות אפשרות להבחין בין הגרעין לבין הציטופלזמה.הגדירו זמן חשיפה קצר והכניסו מסנן צפיפות ניטרלית גבוהה. לאחר מכן, רכשו תמונת מבחן של 12 או 16 ביט באמצעות עירור ופליטה של YFP; התאימו את זמן החשיפה ואת מסנני הצפיפות הניטרלית כך שהעוצמה הממוצעת בתא תהיה שווה בקירוב לעוצמת הרקע בתוספת פי חמישה מההפרש בין עוצמת הרקע המינימלית למקסימלית. כדי לוודא שהתמונות אינן רוויות, בחנו את עוצמת הפלואורסצנציה עבור תמונת הדגימה.העוצמה המקסימלית בתמונה צריכה להיות פחות ממחצית מהטווח הדינמי כדי לאפשר הבדלי עוצמה כאשר תאים נכנסים למיטוזה. לאחר מכן, חזור על תהליך זה תוך שימוש במסנני עירור CFP ופליטה YFP. בחר מספר אזורים עם תאים שעברו טרנספקציה, למעט האזורים ששימשו למיקוד ולאופטימיזציה של תנאי החשיפה.כיוון שייתכן שהליכים אלה עוררו תגובת סטרס, ודאו שהעוצמה המקסימלית נמוכה ממחצית הטווח הדינמי בכל התאים. הגדירו בתוכנה לרכוש שתי תמונות בכל 45 דקות באמצעות עירור YFP, פליטת YFP ועירור CFP. מסנני פליטת YFP.כמו כן, הגדירו את האורך הכולל של הניסוי כך שיעלה על משך מחזור התא. לאחר שהכל הוגדר, התחילו ברכישת תמונות; לאחר השלמת הרכישה, פתחו את התמונות שנרכשו ועקבו אחר זמן מחזור התא ממיטוזה אחת למיטוזה הבאה. עבור תאים המבטאים כאן את הגשוש (probe) שהועבר בטרנספקציה, זמן מחזור התא היה בערך 20 עד 25 שעות.השוו זאת לנתוני הבקרה עבור סוג התאים שנעשה בו שימוש. אם זמן מחזור התא תואם לתזמון הייחוס, ניתן לנתח את ה-fret. לאחר אימות התזמון, ניתן לנתח את התמונות.ניתן לבצע את הניתוח באמצעות רוב התוכנות המוקדשות למיקרוסקופיה. כאן נעשה שימוש בתוכנה החינמית ImageJ עם התוסף Ratio Plus. התחילו את הניתוח על ידי פתיחת התמונות ב-ImageJ. אם התמונות הן בפורמט של ערימה רב-צבעית (multicolor stack), הפרדו את הערוצים הבודדים על ידי המרתם ל-hyperstack באמצעות בחירת התמונה.לאחר מכן, בצעו Hyperstack ואז Stack to Hyperstack. ייפתח חלון ההמרה ל-Hyperstack עם ההגדרות המוצגות; לחצו על OK. התמונה תוצג כעת עם שני סרגלי הזזה מתחתיה.כדי לפצל את התמונות למערכי ערוץ בודד, לחצו על תמונה ובחרו ב-hyper stack reduce dimensionality. פעולה זו תפתח את חלון ה-reduce; ודאו כי frames ו-keep source בחורים. לאחר מכן לחצו על Okay.תמונה חדשה המכילה ערוץ אחד בלבד תופיע. חזרו על תהליך זה כדי להציג תמונה חדשה עם הערוץ השני. לאחר מכן, כדי להגביר את הבהירות הוויזואלית של התמונות הסופיות, בחרו את ה-YFP excitation YFP emission stack.לחצו על process, ולאחר מכן לחצו על math. לאחר מכן בחרו ב-multiply. כאשר ייפתח חלון ה-multiply, הזינו את המספר שלוש כדי להכפיל את ה-YFP excitation YFP emission stack ב-3. שלב זה הוא רשות ומבטיח שהיחסים לא יהיו בטווח שבין אפס לאחד.בשלב הבא, בסרגל הכלים של ImageJ, בחרו בכלי השרטוט החופשי (freehand tool). לאחר מכן, בערימה של עירור YFP ופליטת YFP, שרטטו אזור עניין (ROI) באזור נטול תאים, אך הקרוב לתא שיימדד. כדי להוסיף את ה-ROI למנהל ה-ROI, לחצו על analyze tools ואז על ROI manager.חלון מנהל ה-ROI יופיע. לחצו על add כדי לשמור את קואורדינאטות ה-ROI לצורך מדידת העוצמה הממוצעת של ה-ROI בערימת YFP excitation YFP emission. לחצו על analyze, ולאחר מכן בחרו ב-measure.חלון התוצאות ייפתח. בחרו את ערימת התמונות של עירור CFP ופליטת YFP. לאחר מכן, לחצו פעמיים על ה-ROI במנהל ה-ROI ובצעו את המדידה שוב.המדידה מתווספת לחלון התוצאות. גללו למיקומים אחרים בערימה כדי לחזור על תהליך זה בנקודות זמן מרובות. ודאו שעוצמות הרקע הסמוכות לתא המבוקש דומות לאורך כל הסרט על ידי השוואת המדידות בחלון התוצאות.כדי להגדיר מדידות הכוללות עוצמה מינימלית, לחצו על analyze, ולאחר מכן לחצו על set measurements וציינו את ערכי האפור המינימליים והמקסימליים. לאחר מכן יופיע חלון המציג חלופות מדידה. לאחר התאמת הבהירות והניגודיות לפי הצורך, שרטטו ROI המכסה את רוב התא ומדדו את העוצמה המינימלית בשתי הערימות (stacks).לאחר מכן, בצעו מדידות כפי שנעשה בעבר, אך הפעם השתמשו בתא במקום ברקע. באמצעות הערכים מסעיפי התוצאות, חשבו את ההפרש בין העוצמה המינימלית שנמדדה לבין עוצמת הרקע וחלקו בשניים. פעולה זו מספקת הערכה ראשונית לערך קיטוע (clipping value) עבור יחס פתיחה בתוספים נבחרים.לאחר מכן, בחרו ב-ratio plus. עבור יחס FRET, בחרו ב-CFP excitation YFP emission S stack one, או עבור ויזואליזציה של יחס FRET הפוך, כאשר יעילות ה-FRET פוחתה בעקבות פוספורילציה, בחרו ב-YFP excitation YFP emission S stack one כדי להזין את עוצמות הרקע הנמדדות וערכי ה-clipping.השתמשו בערכים מחלון התוצאות והדביקו אותם בחלון ה-ratio plus. הגדירו את קנה המידה (scaling) של ערימת היחסים (ratio stack) שהתקבלה והחילו לוח חיפוש (lookup table) מתאים כדי להמחיש ויזואלית את השינויים ביחס. תאי U2 OS המבטאים גשש מבוסס FRET למעקב אחר פעילות PLK1 צולמו למשך 60 שעות כפי שמתואר בסרטון זה.תמונה זו מציגה כניסה מצטברת למטקירה של 50 תאים המבטאים גשש FRET, כולל חלוקות של תאי בת. מרבית התאים המבטאים את הגשש מתרבים עם זמן מחזור תא שבין 20 ל-25 שעות, מה שמעיד כי תנאי הדמיה ורמות הביטוי של הגשש אינם משפיעים על תזמון מחזור התא. ייצוג בצבעים מלאכותיים של יחס FRET הפוך, העוקב אחר תא אחד לאורך ארבע חלוקות, מדגים כי למרות רעש ניכר, נראה מגמה שבה פעילות PK1 עולה ב-G2 ומגיעה לשיאה במהלך המיטוזה.כאשר הנתונים הגולמיים עוברים סינון ממוצע ומוצגים כגרף, קל להעריך את הזמן בין שיאי הפעילות. איור זה מציג כימות של יחס ה-fret ההפוך של התא שהוצג בתמונות הקודמות מתוך הגרף. ניתן להעריך את עיתוי ההפעלה, וכפי שניתן לראות כאן, הפספורילציה של הגשוש הופכת נראית כארבע שעות לפני שהפספורילציה מגיעה לשיאה במитоזה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על התאים במצב שאינו תחת עקה (stress), ולכן יש להמעיט בחשיפה לאור ולמזער שינויים בטמפרטורה או ב-pH. חשוב לזכור ששיטה זו מנטרת את האיזון בין פעילות הקינאז (kinase) לפעילות הפוספטאז (phosphatase) בתא. ניתן לשלב פרוצדורה זו עם הפרעה של RNA (RNA interference) או עם סריקות של מעכבים (inhibitors) כדי לזהות את הרגולטורים שמעלה (upstream regulators) של קינאזים ופוספטאזים אלו.

monitoring-kinase-phosphatase-activities-through-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

סרטון זה מתאר את העברת אנרגיית התהודה של Förster שנפתרה בזמן או בדיקת TR-FRET כדי לקבוע זרחן חלבון אנדוגני בעזרת פלואורופורים של תורם ומקבל המתויגים על נוגדנים ספציפיים לחלבון בדיקה. טכניקה זו נועדה למדוד את הזרחן של חלבוני בדיקה בליזטים תאיים.

העברת אנרגיית תהודה פורסטר שנפתרה בזמן לניטור זרחן חלבונים בתאים

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

ההפעלה של סר/ת'ר קינאז AURKA רב תכליתית מסומנת על ידי ההתפשטות האוטומטית שלה על Thr288. בדיקות פלואורסצנטיות המסתמכות על FRET יכולות להפלות בין המצבים הלא פעילים והפעילים שלה. כאן, אנו מדגימים כמה אסטרטגיות להנדסת בדיקה, יחד עם פרוטוקול FRET מהיר כדי לעקוב אחר הפעלת קינאז לאורך מיטוזה.

ניטור בזמן אמת של אורורה קינאז הפעלה באמצעות Biosensors FRET קונפורמציה בתאים חיים

פרוטוקולי בדיקה מבוססי תאים מבוססי-בסיס של Förster, שנפתרו בזמן, מתוארים עבור הכימות הפשוט, הספציפי, הרגיש והחזק של מתמר אותות זרחן אנדוגני ומפעיל של תמלול (STAT) 1/3/4/5/6 חלבונים בתאים ליסטים בפורמט של 384 בארות.

בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ  במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות הדינמיקה המרחבית-זמנית של הפעלת Akt וזרחון בתאי HepG2 חיים. הדמיית העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא כלי רב עוצמה המספק תובנות חשובות לגבי מסלולי איתות אינסולין וויסות מטבולי בתאי סרטן.

הדמיית העברת אנרגיית תהודה של תאים חיים של דינמיקת הפעלת Akt מווסתת מטבולית בתאי HepG2

למד לנטר פעילות קינאז ופוספטאז במחזור התא באמצעות דיווחי FRET בתאי U2 OS חיים. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר שינויים בפוספורילציה במעבר מ-G2 ל-M.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

גלה סרטונים נוספים