ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

בסרטון זה, פעילויות קינאז ופוספטאז מנוטרות לאורך מחזור התא באמצעות העברת אנרגיה או שריג תהודה של Forrester. כאן בפולו כמו קינאז אחד או LK יש חלבון פלואורסצנטי ציאן CFP הממוקם בקצה אחד וחלבון פלואורסצנטי צהוב YFP ממוקם בקצה השני. בדיקה זו מועברת לתאי U2 OS.

לאחר מכן, כדי לבחון את מצב הזרחן של מטרות LK one במהלך המעבר G two two M, תאי מערכת ההפעלה TRANSFECTED U2 נתונים להדמיה פלואורסצנטית של זמן. כאשר CFP ו-YFP נמצאים בסמיכות ו-CFP נרגש, האנרגיה מועברת ל-YFP וניתן לזהות כניסה ל-YFP. עם זאת, כאשר הגשושית הופכת לזרחנית, שינוי אישור בחלבון מפריד בין CFP ל-YFP.

כעת, כאשר CFP מתרגש, פליטת CFP חזקה ורק פליטת YFP חלשה מזוהות כימות של היחס בין פליטת YFP לאחר עירור CFP ו-YFP מדגים שפעילות PLK אחת עולה ב-G 2 ומגיעה לשיא במהלך המיטוזה. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו צילום גיאומטרי סטנדרטי, הוא שתשומת לב ספציפית מוקדשת לכך שמחזור התא אינו מופרע לא על ידי תנאי צילום ולא על ידי ביטוי של בדיקה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחזור התא, כגון היכן ומתי מופעלים קינאזות או פוספטאזות ספציפיות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אנזימים המווסתים את מחזור התא, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות שבהן נדרשים תנאים לא רלוונטיים, כגון מבחני התפשטות תאים. כדי לנטר את מחזור התא האנושי, תאי U2 OS עוברים טרנספטציה עם בדיקת פעילות PK אחת מבוססת פריט. בשיטת טרנספקציה סטנדרטית של סידן פוספט, התאים נבחרים בפור מיצין למשך שבעה ימים לפחות.

זה מעשיר את אוכלוסיית התאים המבטאים את הגשושית ומגביל את מספר התאים עם רמות ביטוי רעילות או רמות ביטוי המשפיעות קשות על מחזור התא. שיבוטים יציבים נבחרים לאחר מכן על ידי ביטוי דילול מוגבל של CFP ולאחר מכן נבדק YFP כדי לוודא שהם קיימים בכל התאים באותו יחס בערך. אם תאים מסוימים מכילים רק CFP או YFP התרחשה רקומבינציה במקרה זה, חזור על הכנת הפלסמיד באמצעות חיידקים המועדים פחות לרקומבינציה הומולוגית, כגון שני תאים בטוחים ואז ליניאריזציה של הפלסמיד וחזור על הטרנספקציה.

לאחר שהתאים מבטאים ביציבות את הבדיקה, זרעו אותם על צלחות תחתית זכוכית מספר 1.5 לאחר שהן נצמדו והן מתכנסות ב-30 עד 50%. שנה את המדיום למדיום שאינו תלוי ב-CO2 ואינו מכיל פנול אדום הרכיב את התאים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי ממונע עם בקרת טמפרטורה מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד במסנני עירור ופליטה CFP ו-YFP.

מראת ROIC המתאימה לניטור CFP ו-YFP ומטרה המתאימה לרזולוציה הנדרשת. כאן, נעשה שימוש במטרה אווירית של 20 x NA 0.75. באמצעות אור מועבר, הביאו את התאים למיקוד.

אל תשתמש באור פלורסנט בשלב זה מכיוון שהוא יגרום לתגובת לחץ שעלולה להפריע למחזור התא. כדי למנוע פוטוטוקסיות, הגדר את הכיפוף למקסימום הזמין המאפשר את הרזולוציה התת-תאית הנדרשת. לצורך ניסוי זה, אמור להיות אפשרי להבחין בין הגרעין לציטופלזמה.

הגדר זמן חשיפה קצר והכנס מסנן בצפיפות ניטרלית גבוהה. לאחר מכן רכוש תמונת בדיקה של 12 או 16 סיביות באמצעות עירור ופליטה של YFP, התאם את זמן החשיפה ומסנני הצפיפות הנייטרלית כך שהעוצמה הממוצעת בתא תהיה שווה בערך לעוצמת הרקע בתוספת פי חמישה מההבדל בין עוצמות רקע מינימליות למקסימליות. כדי לוודא שהתמונות אינן רוויות, בדוק את עוצמת הקרינה עבור תמונת הדגימה.

העוצמה המקסימלית בתמונה צריכה להיות פחות ממחצית הטווח הדינמי כדי לאפשר הבדלי עוצמה כאשר תאים נכנסים למיטוזה. לאחר מכן, חזור על תהליך זה באמצעות עירור CFP ומסנני פליטת YFP. בחר אזורים מרובים עם תאים שעברו טרנספטציה, למעט האזורים המשמשים למיקוד ולאופטימיזציה של תנאי החשיפה.

מכיוון שייתכן שההליכים הללו עוררו תגובת לחץ, ודא שהעוצמה המקסימלית היא פחות ממחצית הטווח הדינמי בכל התאים. הורה לתוכנה לרכוש שתי תמונות כל 45 דקות באמצעות עירור YFP, פליטת YFP ועירור CFP. מסנני פליטת YFP.

הגדר גם את האורך הכולל של הניסוי כך שיחרוג ממשך מחזור התא. לאחר שהכל מוכן, התחל לרכוש תמונות לאחר השלמת הרכישה, פתח את התמונות שנרכשו ועקוב אחר זמן מחזור התא ממיטוזה למיטוזה. עבור תאים המבטאים את הגשושית שהועברה כאן, זמן מחזור התא היה בערך 20 עד 25 שעות.

השווה זאת לנתוני בקרה עבור סוג התא שבו נעשה שימוש. אם זמן מחזור התא תואם לתזמוני הייחוס ניתן לנתח את העצב. לאחר אימות התזמון, ניתן לנתח את התמונות.

הניתוח יכול להתבצע על ידי רוב התוכנות המוקדשות למיקרוסקופיה. כאן, נעשה שימוש בתוכנה חופשית של תמונה j עם התוסף ratio plus. התחל את הניתוח על-ידי פתיחת התמונות בתמונה J.אם התמונות הן בתבנית אוסף צבעים, הפרד את הערוצים הנפרדים על-ידי המרתם לאוסף על-ידי בחירת תמונה.

לאחר מכן hyper stack ואז stack ל-hyper stack. חלון ההמרה להיפר מחסנית נפתח עם ההגדרות המוצגות, לחץ על אישור. התמונה תוצג כעת עם שני פסי מחוון מתחתיה.

לאחר פיצול התמונות לאוספים חד-ערוציים, לחץ על התמונה ובחר hyper stack reduce dimensionality. פעולה זו תפתח את חלון ההפחתה, תבטיח שנבחרו מסגרות ושמירה על המקור. לאחר מכן לחץ על אישור.

תופיע תמונה חדשה המכילה ערוץ אחד בלבד. חזור על תהליך זה כדי להעלות תמונה חדשה בערוץ השני. לאחר מכן, כדי להגביר את הבהירות החזותית של התמונות הסופיות, בחר את מחסנית פליטת YFP עירור YFP.

לחץ על תהליך ולאחר מכן לחץ על מתמטיקה. לאחר מכן הכפל כאשר חלון ההכפלה נפתח, הזן שלוש כדי להכפיל את ערימת פליטת YFP עירור YFP בשלוש. השלב הוא אופציונלי ומבטיח שהיחסים אינם בטווח שבין אפס לאחד.

לאחר מכן, בסרגל הכלים של התמונה J, בחר את הכלי ביד חופשית. ואז בעירור YFP, ערימת פליטת YFP, צייר אזור עניין או החזר ROI באזור נטול תאים, אך קרוב לתא שיימדד כדי להוסיף את ה-ROI למנהל ה-ROI, לחץ על כלי ניתוח. ואז מנהל החזר ROI.

יופיע חלון מנהל החזר ההשקעה. לחץ על הוסף כדי לשמור את קואורדינטות ה-ROI כדי למדוד את העוצמה הממוצעת של ה-ROI בערימת פליטת YFP עירור YFP. לחץ על ניתוח ולאחר מכן בחר מדידה.

חלון התוצאות ייפתח. בחר את מחסנית פליטת YFP של עירור CFP. לאחר מכן לחץ פעמיים על החזר ה-ROI במנהל ה-ROI וחזור על המדידה.

המדידה נוספת לחלון התוצאות. גלול/י למקומות אחרים בערימה כדי לחזור על תהליך זה בנקודות זמן מרובות. ודא שעוצמות הרקע הקרובות לתא המעניין דומות לאורך כל הסרט על ידי השוואת מדידות בחלון התוצאות.

כדי להגדיר מדידות כך שיכללו עוצמה מינימלית, לחץ על ניתוח, ולאחר מכן לחץ על הגדר מדידות וציין את ערך האפור המינימלי והמקסימלי. לאחר מכן יופיע חלון המציג חלופות מדידה. לאחר התאמת הבהירות והניגודיות לפי הצורך, צייר החזר ROI המכסה את רוב התא ומדוד את העוצמה המינימלית בשתי הערימות.

לאחר מכן בצע מדידות כמו קודם, הפעם באמצעות תא במקום הרקע. בעזרת הערכים מקטעי התוצאות, חשב את ההפרש בין העוצמה המינימלית הנמדדת לעוצמת הרקע וחלקו אותו לשניים. זה מספק הערכה התחלתית לערך גזירה ליחס פתיחה בתוספת תוספים נבחרים.

ואז יחס פלוס. לאחר מכן עבור יחס השריגים, בחר את מחסנית הפליטה של YFP עירור CFP אחת או עבור יחס חריץ הפוך המציג בדיקות הדמיה שבהן יעילות השריג פוחתת עם זרחון. בחר את עירור YFP YFP פליטת S מחסנית אחת כדי להוסיף את עוצמות הרקע הנמדדות וערכי החיתוך.

השתמש בערכים מחלון התוצאות והדבק אותם בחלון יחס פלוס. הגדר את קנה המידה של ערימת היחס המתקבלת והחל טבלת בדיקת מידע מתאימה כדי להמחיש שינויי יחס. תאי U2 OS המבטאים בדיקה מבוססת שריג המנטרת פעילות PLK אחת צולמו במשך 60 שעות כמתואר בסרטון זה.

תמונה זו מציגה כניסה מיטוטית מצטברת של 50 תאים המבטאים בדיקת שריגים, כולל חלוקות של תאי בת. רוב התאים המבטאים את הגשושית מתרבים עם זמן מחזור תא של בין 20 ל-25 שעות, מה שמצביע על כך שתנאי ההדמיה ורמות הביטוי של הגשושית אינם משפיעים על תזמון מחזור התא. ייצוג צבע כוזב של יחס שריג הפוך בעקבות תא אחד דרך ארבע חלוקות מדגים שלמרות שיש רעש ניכר, נראית מגמה שבה פעילות PK אחד עולה ב-G 2 ומגיעה לשיאה במהלך המיטוזה.

כאשר הנתונים הגולמיים מסוננים ומוצגים כגרף, קל להעריך את הזמן בין שיאי הפעילות. איור זה מציג כימות של יחס השריג ההפוך של התא המוצג בתמונות הקודמות מהגרף. ניתן להעריך את תזמון ההפעלה וכפי שניתן לראות כאן, זרחון של הגשושית נראה כארבע שעות לפני שהזרחון מגיע לשיא במיטוזה.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על התאים במצב של חוסר לחץ, ולכן זה נעשה על ידי מזעור החשיפה לאור כמו גם כדי למזער שינויים בטמפרטורה או ב-pH. חשוב גם לזכור ששיטה זו עוקבת אחר האיזון בין פעילות קינאז ופוספטאז בתא. ניתן לשלב הליך זה עם הפרעות RNA או מסכי מעכבים כדי לזהות את הרגולטורים במעלה הזרם של קינאזות ופוספוטאזים אלה.