הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

שיטה ניסיונית זו משמשת לחשיפת התכונות של כניסת סידן המופעלת על ידי מאגרי סידן (SOCE) בתאי סרטן ובתאי שריר שלד באמצעות שיטות המבוססות על פלואורסצנציה. דבר זה מושג על ידי תיעוד הפלואורסצנציה של URA two בתאים חיים, אשר רגישה לריכוז הסידן התוך-תאי. בנוסף, נמדד קצב כיבוי הפלואורסצנציה על ידי הוספת מנגנז באורך גל שאינו רגיש לריכוז הסידן, נתון המשקף באופן ישיר את הפעלת ה-SOCE לצורך חקר ה-SOCE.

בתאי שריר שלד בעלי התמחות מבנית, השרירים מופרדים ומסירים מהם את הקרום (skinned). סיבי השריר מוכנים לעבודה. לאחר מכן, הסיבים מטופלים באינדיקטורים לסידן בעלי זיקה נמוכה, והפלורסצנציה הפנימית שלהם מנוטרת.

שיטות אלו מדגימות כי SOCE קיים הן בתאים שאינם מעוררים והן בשרירים שלד, עם הפעלה מדורגת וצימוד הדוק לתכולת מאגרי הסידן התוך-תאיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו, המבוססת על פלואורסצין, על פני שיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה או patch clamp, הוא הנוחות בשימוש והאפשרות ליישמה במחקרי אוכלוסיות תאים או בסריקה בתושבה גבוהה (high throughput screening). חשוב להשתמש בתמיסות המלחים המתאימות לצורך סביבה ריטואלית ובדיקת mag coning.

לכן, כיול של כל מכשיר בנפרד הוא חיוני מכיוון שכל מכשיר שונה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן תהליך הפיזול המכני של סיבי שריר בודדים קשה ללמידה, מאחר שהוא דורש הכשרה מעשית מיוחדת, הבנה מעמיקה ולמידה של טכניקות מיקרו-דיסקציה, תצפית מדויקת ומינון רב של סבלנות. לפני התחלת העבודה, כייל את מערך המיקרוסקופ למדידה של URA two פלואורסצנציה. למרות שאורכי גל העירור עבור קישור סידן ו-calcium three URA two הם 340 ו-380 nanometer, ייתכן שטווח הדינמיקה היחסי האופטימלי של URA two למדידת סידן יתרחש באורכי גל אחרים במערכת מיקרוסקופ ספציפית.

הסטות אלו באורכי הגל נובעות משינויים במסלול האופטי עקב הוספת רכיבים אופטיים שונים. באופן דומה, גם נקודת ה-ISO spastic עבור כל מערכת משתנה. לפיכך, חשוב לקבוע אורכי גל אלו באמצעות סריקת ספקטרום.

לחלופין, ניתן להקליט סריקת Ming באמצעות פלואורסצנציה בלבד בכל שני אורכי גל, באופן שערך הסופי יהיה בלתי תלוי בריכוז הסידן. התחילו בטרנספקציה של תאי cultured K Ys SE one 50 עם פלסמידים המבטאים RFP ומכילים או HRNA ספציפי נגד I one או רצף scrambled למשך 48 שעות. גדלו את התאים שעברו טרנספקציה על מנות עם תחתית זכוכית.

לאחר מכן, הסירו את המצע ושטפו את התאים בתמיסת מלחים מאוזנת או BSS. לאחר השטיפה, הוסיפו מילליטר אחד של BSS המכיל שני מיקרו-מול RA 2:00 AM והשאירו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך 40 דקות. השאירו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי לאפשר לצורה התוך-תאית של URA 2:00 AM להמיר את עצמה ל-URA two.

לאחר מכן, שטפו את הפלטה פעמיים ב-BSS תחת המיקרוסקופ. במצב ויזואליזציה, בחרו תאים המבטאים RFP. בחרו במצב יחס עירור כאשר אורך גל הפליטה מוגדר ל-510 nanometers ואורכי גל העירור הם 350 ו-390 nanometers.

היחס מוצג בחלון השלישי. לאחר מכן, בצעו הקלטה של הפלואורסצנציה של התאים הנבחרים באורכי הגל שנקבעו מראש, בזמן שהתאים מופעמים בארבעה תמיסות שונות.

באופן דומה, טוענים תאי KYSE one 50 ב-ferra two ומעבירים אותם להקלטה. במצב יחס עירור (excitation ratio mode), בניגוד להליך הקודם, נבחרה נקודת ה-ISO spastic point 360 nanometers כאורך גל העירור. לאחר מכן, מקליטים בו-זמנית את הפלואורסצנציה ב-360 ו-390 nanometers בזמן שהתאים מושקעים בחמישה תמיסוֹת BSS שונות.

עבור פרוטוקול זה, יש לתרבל תאי C2C12, שורת תאים מיוגניים של עכבר, על צלחונות בעלי תחתית מזכוכית עד להגעה למצב של התמסךות (confluence), ולאחר מכן להבדילם לשפופרות שריר (myotubes) במצע בידוד המכיל 2.5% horse serum. יש להטעין את ה-C2C12 myotubes בריכוז סופי של 5 µM RA 2:00 AM בתמיסת BSS ולהדגיר אותם למשך 40 דקות. לאחר מכן, יש להוסיף ריכוז סופי של 20 µM של benzo p toluene smide או BTS כדי לעכב התכווצויות שרירים ואת ארטיפקטי התנועה הנגרמים מהן.

דגרו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ושמרו על תמיסות BTS בכל הפרוטוקול. לאחר מכן, טענו ארבעה תמיסות מלח מאוזנות (Balance salt solutions) למערכת הפרפוזיה.

כפי שתואר בעבר. במהלך כל פרופוזיה (profusion) רשמו את הפלואורסצנציה של תאים נבחרים באורכי גל של 360 ו-390 ננומטר. בסדרה זו, מגנזיום ו-thap argen מופעלים יחד כדי לנטר כיבוי (quenching) של יוני מגנזיום.

בזמן שמאגרי הסידן ברשת האנדופלזמית מתרוקנים. כדי להוציא את שריר ה-extensor digitorum longus או שריר ה-EDL, מקם את רגלו של עכבר לאחר הרדמה ואיוותנזיה באופן צדי והסר את העור מאזור הקרסול ועד הברך. גזור את שכבות השריר השטחיות של הרקמה כדי לחשוף את ה-EDL ונתק את הגידים העליונים והתחתונים כדי לשחרר את שריר ה-EDL השלם.

חשוב לשמור על הגידים ארוכים ככל האפשר. כעת, כדי למנוע התכווצויות, העבירו את ה-EDL לתמיסת T road המכילה 0.1 millimolar EGTA וללא סידן, תחת מיקרוסקופ סטריאו. הפרדו את גידי ההיצמדות בברך לשני חצאים וחלקו את שריר ה-EDL לשני צרורים.

חזור על התהליך עד לקבלת שמונה צרורים. אם גידים אובדו מכל צרור, השליך את הצרור. לאחר מכן, אחוז בשני הגידים של פס צרור EDL ומתוך כך מתוך תנועה זהירה מתח את הפס עד שנותרו שלבים של שלושה או ארבעה סיבי שריר בודדים שלמים עם רקמת גיד משני הצדדים.

הניחו טיפה של תמיסת tyro buffer נטולת סידן בצלחת עם תחתית זכוכית. הנחו את פסי ה-EDL בצורה ישרה על הצלחת והסירו במהירות כמה שיותר מהתמיסה. לאחר מכן, הדביקו היטב את שני הגידדים באמצעות סרט הדבקה (scotch tape) עמיד למים.

שטפו תחילה את הסיב בתמיסה נטולת סידן ולאחר מכן פעמיים בתמיסת סידן בריכוז 2.5 millimolar. אם הסיב עובר התכווצות יתרה ונצפעים נזקים, השליכו את הסיב, שטפו את סיבי השריר הבריאים שנבחרו שלוש פעמים בתמיסת שטיפה מספר אחת, ולאחר מכן השריה אותם בתמיסת skinning משופרת דמוית תוך-תאית למשך חמש דקות. בעזרת מחט טונגסטן המחוברת למחזיק סיכות, בצעו skinning מכני לסיב תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי; הסיבים ייסגרו מחדש וילכדו road five n המשורשר לסידן בתוך הצינורות הרוחביים.

השגת סיבים שריריים בודדים, שלמים ובריאים, או לפחות צרורים של סיבים מסוג זה שעדיין מחוברים אליהם שרירי הגיד, היא לדעתי אחד השלבים המאתגרים ביותר, ואחריו העברה קשה תמיד של סיבים אלו לתא הניסוי הסופי. במהלך תהליך זה, סיבים עלולים לעבור התכווצות יתר או אף להישבר. לפיכך, אם יש ברשותכם סיבים בריאים, השלב המכני של הפישירה (skinning) יהיה קל בהרבה להעמסה על ה-SR. דגרו את הסיבים בתמיסת פישירה עם 20 $\mu$M flow five N am.

לאחר הדגירה, בצעו שטיפות מקיפות עם תמיסת שטיפה מספר שתיים והמתינו 30 דקות נוספות של דגירה כדי לאפשר דה-אסטריפיקציה מלאה של הצבע. לאחר מכן ניתן להדגים את הסיבים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה של 60x באזורי העניין. רשמו בו-זמנית את הפלואורסצנציה של כל צבע בעוד הסיב מושקף עם תמיסות SR loading ו-SR Depletion.

פעילות SOCE בתאי KYS, SE one 50 נבדקה באמצעות מדידת סידן תוך-תאי. התאים עברו טרנספקציה משולבת עם RFP ו-short hairpin RNA נגד הגן OR I one, המקודד לערוץ A-S-O-C-E, בהשוואה לבקרות המיוצגות על ידי העקבה השחורה. השתקת ביטוי OR I one הובילה לירידה בפעילות ה-SOCE. ה-SOCE בתאי KYC one 50 אומת גם באמצעות בדיקת מחיקת פלואורסצנציה במנגנז (manganese quenching assay). לאחר ש-TGירוק את מאגרי הסידן ב-ER באופן מלא, הזרמה של מנגנז גרמה לירידה משמעותית בעוצמת הפלואורסצנציה.

השיפוע התלול יותר של אובדן האות ב-URA two מעיד על SOCE פעיל יותר. לפיכך, הירידה האיטית של הפלואורסצנציה בתאים שטופלו ב-two A PB מעידה על כך שפעילות ה-SOCE נחסמה על ידי תרכובת זו. שיעורי הכיבוי של המנגנז נקבעו מתוך 10 השניות הראשונות שבהן הכיבוי היה עדיין בטווח ליניארי ללא רוויה; בדיקת כיבוי מנגנז דומה בוצעה בתאי שריר מתורגלים.

במקרה זה, מנגנז הוחל יחד עם tg. בעוד ש-TG ריק את מאגרי הסידן ב-SR, שיפוע כיבוי הפלואורסצנציה השתנה בהדרגה עד שהגיע לקצב maximal. העקומה הסיגמואידית העידה על הפעלה מדורגת של SOCE תחת תנאים ניסיוניים אלו.

תחת דימיון קונפוקאלי, לכידה של rhodamine 5N ו-dye במדור ה-TT של סיב מקולף הראתה את תבנית ה-doublet האופיינית ליונקים, כפי שנראה בערוץ האדום. לאחר טעינת ה-SR ב-rhodamine 5N, תבנית ה-SR הנקודתית הטיפוסית הייתה גלויה בערוץ הירוק עם בליעת הסיב המקולף בתמיסת טעינה ל-TTSR; עוצמת הפלואורסצנציה של both rhodamine 5N ו-rhodamine 5N עלתה עם בליעה של תמיסת ריקון SR; רמות הפלואורסצנציה במדור ה-SR ובמדור ה-TT החלו לרדת. הדבר העיד על קיום צימוד בין ריקון מאגרי הסידן ב-SR לבין הפעלת SOCE, בהתאמה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשיג סיבי שריר בריאים, שלמים ובעלי חיות. עליהם להכיל מספיק רקמת גיד בקצותיהם כדי לאפשר תהליך קיבוע יעיל, אשר יאפשר בסופו של דבר לחוקר להשיג תכשיר רלוונטי פיזיולוגית בעל יתרון משמעותי. נא לזכור כי כל הצבעים הפלואורסצנטיים המשמשים במחקר זה הם בדרך כלל רגישים לאור, ויש לנקוט באמצעי זהירות, כגון טעינה בתוך כלי בחושך ושטיפה בחדר חשוך, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

במיומנות גבוהה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות. אנו מציעים להשיג תחילה מספר סיבים שלמים כדי לאפשר אחוז הצלחה גבוה יותר בשלבים המכניים העדינים, וכן במידה ותרצו לגדל סיבים אלו למשך לילה לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום איתות הסידן לבחון את תפקידו של כניסת סידן מופעלת-מאגרים בצמיחה ובמוות של תאי סרטן.

התפקוד הפיזיולוגי והפתולוגי בשריר.