Name: Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: למדו כיצד לבצע הקלטות ERG טרנס-רטינליות מרשתית עכבר שלמה לבידוד תגובות פוטורצפטוריות של מוטות וחרוטים. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של תפקוד הרשתית ועיבוד האות הוויזואלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי פרס קריירה ופיתוח ממחקר למנוע עיוורון, NIH מענקים EY19312 ו EY19543 (VJK), כמו גם על ידי מענק בלתי מוגבל של מחקר למניעת עיוורון EY02687 (מחלקת עיניים ו-Visual למדעים באוניברסיטת וושינגטון).

1. ביצוע אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודות זכוכית. שוקל 120 מ"ג אגר ומערבבים אותו במים מזוקקים 10 מ"ל (ריכוז אגר האחרון 1.2%). ממיסים את הפתרון אגר באמבט מים חמים. מלאו כוס נימים (אנו משתמשים Presision מכשירים וורד TW100-4 נימים עם הממדים הבאים: אורך = 100 מ"מ, OD / ID = 1/0.75 מ"מ, ונפח פנימי = 44 μL) עם פתרון אגר באמצעות מזרק פלסטיק. לחזק אגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לכן, עד ~ 200 נימים יכול להיות מלא (את שאר התערובת אגר ניתן לאחסן ב -4 מעלות צלזיוס, שימוש חוזר כמה פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לחצאים נימים באמצעות סכין יהלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את אלקטרודות זכוכית וכתוצאה מכך לפתרון האלקטרודה העכבר לפחות 24 שעות 4 ° C. אחסן את האלקטרודות על 4 ° C, ולהשתמש בהם על פני תקופה של 3-4 חודשים. </li></ol> 2. הגדרת ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כהה להתאים עכבר לילה. השתמש בסוג בטבע (למשל, C57Bl / 6) עכברים עבור מוט מונחה הקלטות transretinal ו T אלפא - / - עכברים מוט חסר איתות 8 להקלטות חרוט transretinal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 זלוף L פתרון, 100 אלקטרודה פתרון מ"ל ו -20 מ"ל הדגירה פתרון (ראה להלן) ולסנן שוקת פתרון זלוף כמה Millipore 0.45 מיקרומטר או 0.22 מיקרומטר פילטר (לא חובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את מקור האור (505 ננומטר LED או נורת הלוגן ממריץ אופטי) באמצעות פוטומטר ממוקם על המטוס של הרשתית. במקרה של מקור אור LED, השתמש מפזר אופטי כדי להשיג אחידות אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את חדר זלוף לניסוי (קונסטרוקציות קאמרית עשוי להשתנות). הלילה שלנו עשוי פרספקס 3 מ"מ, עם תחתית עשויה מכסה של צלחת פטרי פלסטיק קטנה, ויש לו נפח זלוף פעיל ~ 400 μL (L = 25 מ"מ, W = 8 מ"מ, H ≈ 2 מ"מ). למלא את החלל האלקטרודה התחתון של החדר עם פתרון אלקטרודה המכילה 2 מ"מ L-גלוטמט ו 10 mM BaCl 2. באמצעות צינורות פלסטיק זכוכית נימי, ליצור חיבור בין הפתרון בחלל אלקטרודה נמוכה יותר (עשוי מחבר צינור פלסטיק מחובר אל תחתית תא) ובעל האלקטרודה. ודא שאין בועות האלקטרודה, צינורות חיבור, או בעל אלקטרודה (לטהר את הפתרון באמצעות מזרק פלסטיק במידת הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תא הקלטת על הבמה של מיקרוסקופ (לא חובה: מיקרוסקופ יכול להיות מותקן על השולחן נגד רעידות ו מוגן בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש מכני אלקטרומגנטי). חבר את מחזיק האלקטרודה נמוך לקוטב headstage החיובי של מגבר ההפרש (למשל וורנר מכשירים DP-311 מגבר). מרכז וליישר את האלקטרודה בתא התחתון לפתוח עם כתם האור גירוי. חבר את קו זלוף אל חדר ההקלטה ולהפוך זלוף על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבועה זלוף פתרון עם 95% מ 2/5% CO 2 תוך דוגרים אותו 40 מעלות צלזיוס וואטאה אמבטיה. CO 2 מתאים את ה-pH של התמיסה ל 7.2. פתרון זורם מהבקבוק אל חדר ההקלטה על ידי כוח הכבידה עובר דרך הנגד קרמיקה מחמם שוב את אותה 36-37 ° C. כדי להפחית את אובדן החום, דוד צריך להיות ממוקם קרוב חדר ההקלטה ככל האפשר, באופן אידיאלי על במת המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם וסת זרימה להתאים את קצב הזרימה על 1 מ"ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודה העליונה אל עמוד (שלילי) של 2 headstage באמצעות בעל אלקטרודה 2. לאגד בדיקה תרמי על האלקטרודה העליונה באמצעות טבעת O-. ודא טיפים האלקטרודה תרמי הם קרובים זה לזה, כך הקריאה הטמפרטורה נלקח קרוב למרכז הרשתית ככל האפשר. לטבול את קצה האלקטרודה העליונה בפתרון זלוף ולמקם אותו במרכז החדר. אפשר 10-15 דקות לייצוב הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מתח DC של דוד, כך הטמפרטורה של הפתרון הוא 36 -37 ° C. </li></ol> 3. בידוד רשתית עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת אור אדום עמום, להרדים את העכבר כהה מותאם עם CO 2 ו פריקה צוואר הרחם. אופציונלי: להפוך את סימון ההפניה על גלגל העין בכל העכבר על ידי צריבה נקודת הגב רוב בלובן העין עם עט או סיכה כויה לנתח מחוממת. כל הנהלים הבאים מבוצעים תחת אור אינפרא אדום באמצעות ממירים תמונה אינפרא אדום בכושר מיקרוסקופ כדי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העיניים עם מספריים מעוגלות על ידי הפעלת לחץ עדין ומתיחת העור על הצדדים של כל עין. Hemisect שתי עיניים תחת תאורה אינפרא אדום באמצעות microscissors או סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרנית ואת העדשה. הסר גם של הזגוגית ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל הרשתית 1 משכבת ​​אפיתל הפיגמנט, ואם יש צורך, לנקות ביסודיות עם מלקחיים כדי להסיר את גרגרי הנותרים של אפיתל הפיגמנט. אנחנו בדרך כלל באמצעות הרשתית כולה הן מוט חרוט transretinal הקלטות. עם זאת, אם אתם רוצים להקליט במיוחד מהחלק הגב של הרשתית העכבר כי יש יותר M / L-גביעי 9, לפני קילוף הרשתית להסיר את החלק הגחוני של עיינית בסכין גילוח או microscissors באמצעות סימן כויה כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גלגל העין hemisected 2 בצלחת פטרי קטנה עם פתרון הדגירה דגירה הכנה בתיבה אור חזק רווי חמצן טהור עד לשימוש. בדרך כלל, בתנאים אלה עיינית העכבר 2 יכול להיות מאוחסן במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר ומשמש להקלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כוס או טפטפת פלסטיק להעביר את הרשתית בודד לירידה של פתרון זלוף (μl בקירוב 300) על מכסה של צלחת פטרי. להוסיף 5-6 טיפות קטנות של פתרון האלקטרודה המכילים BaCl 2 עד הרשתית מראש דגירה עם BaCl 2. מניחים חתיכת ריבוע (5x5 מ"מ בקירוב) של הצד האחורי בפינה, משומנת (אנו משתמשים Dow Corning 111 סיכה השסתום איטום) Millipore מסנן נייר (0.45 מיקרומטר HARG סוג) עם חור מוכנות במרכזו (2-2.5 מ"מ קוטר) לירידה פתרון זהה. באמצעות עמדת מלקחיים הרשתית על גבי נייר סינון (בצד photoreceptor למעלה) ולחץ על הקצוות שלה בפריפריה כדי שטוח להעלות אותו. הרשתית יש מרוכז על פתיחת בעיתון הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים להעביר את נייר הפילטר עם הרשתית לתא זלוף ומניחים אותו מעל גירוי במקום מיושר שטח אלקטרודה נמוכה יותר. קצת לחץ את הקצוות המשומנת של נייר פילטר לקשר את זה עם החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה העליונה מעל מרכז הרשתית (מעט לגעת שכבת photoreceptor). מרכוז האלקטרודה העליונה על הרשתית מגביר את משרעת האות (עד ~ 20-40% לעומת מיקומו קרוב יותר לקצה הרשתית). למרות מיקום האלקטרודה כך מעוות מעט אור יעיל גירוי בעוצמה להגיע מגזר קטן של הרשתית (~ 12-15% של השטח הכולל שלה), היא עדיין הדרך האופטימלית של הצבת electrode. הכנה מוכן כעת הקלטות transretinal. </li></ol> 4. Transretinal הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לקו העכבר, להקליט או מוט M / L-חרוט מונחה פלאש התגובות הבדיקה מ עמום עוצמת אור בהירה מכויל 505 ננומטר הניתן מתוך מקור אור LED או ממריץ אופטי. במקרה של מקור אור LED שלנו, עוצמת הפלאש הוא נשלט על ידי שילוב של בקרה ממוחשבת של מתח הזנה LED, נגדים להחלפה, ומערכת של מסנני צפיפות ניטרלי (אנו משתמשים בצבע E-211 # 0.9 הסרט ND מסננים מ רוסקו מעבדות ) ממוקם בין LED לבין הרשתית. משך הבדיקה של ה-LED Flash (20 MS) נשלטת על ידי מחשב. אם באמצעות נורת הלוגן ממריץ אופטי, עוצמת המבחן פלאש הגל יכול להיות נשלט על ידי מערכת של מסנני צפיפות ניטרלי או צרים הפרעה מסננים הלהקה, בהתאמה. משך הבדיקה פלאש יכול להיות נשלט על ידי מחשב מונעי התריסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: לשמירה יעילהדיכוי של הרכיב של גליה photoresponse עם BaCl 2 לאורך כל היום, שנה את הפתרון אלקטרודה נמוכה מדי פעם (למשל, לפני בדיקה של כל הרשתית) על ידי מחיקת אותו באמצעות מזרק פלסטיק מלא פתרון טרי. </li></ol> 5. נציג תוצאות פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשתית העכבר פתרון זלוף: 112.5 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 מ"מ CaCl 2, 10 HEPES מ"מ (pH 7.2), 20 מ"מ NaHCO 3, 3 מ"מ succinate Na Na, 0.5 מ"מ גלוטמט, 0.02 mM EDTA, ו 10 mM גלוקוז. בנוסף, הפתרון הוא השלים עם 2 מ"מ L-גלוטמט ו 10 מיקרומטר DL-AP-4 לחסום רכיבים מסדר גבוה יותר של photoresponse 10,11, עם 0.1% MEM ויטמינים ממ חומצות אמינו פתרונות (Sigma) כדי לשפר את הרשתית הכדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האלקטרודה פתרון עכבר: 140 מ"מ NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 מ"מ CaCl 2, 3 HEPES מ"מ (pH 7.4, NaOH). פתרון ele נמוכהשטח ctrode מכיל גם 2 מ"מ L-גלוטמט לחסום את ההולכה הסינפטית 10, ובנוסף, 10 mM BaCl 2 לדכא את הרכיב של גליה photoresponse 3,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה פתרון הרשתית: להמיס 272 מ"ג L-15 בינוני (Sigma) ו - 20 מ"ג BSA במים 20 מ"ל deionized. סופי L-15 ריכוזי BSA הם 13.6 מ"ג / מ"ל ​​ו - 1 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. התאם את ה-pH 7.4 עם 1 M HCl. </li></ol><img alt="איור 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1."> באיור 1. תרשים סכמטי המציג את הבידוד של הרשתית העכבר על הקלטות transretinal ERG. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2."> איור 2. צילום של החדר ואת זלוף אלקטרודות הקלטה עם מחזיקי שלהם. חיצים אדומים מצביעים על כיוון הזרימה זלוף. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3."> איור 3. תרשים תרשים סכמטי של הניסוי להקלטות transretinal ERG. חיצים אדומים מצביעים על כיוון הזרימה זלוף. <img alt="איור 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4."> . איור 4 תוצאות נציג: רשמה המשפחה של העכבר מוט מונע תגובות transretinal. Photoresponses היו נמוך לעבור סינון ב-Hz 30 (8-מוט Bessel), דיגיטציה של kHz 1 ומאוחסנים במחשב לניתוח נוסף. עקבות המוצגים מייצגים ממוצעים של 5-6 תגובות בעוצמות האור העמום 2-3 ותגובות בעוצמות אור רוויי. <img alt="איור 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 5."> איור 5 תוצאות נציג:. משפחה מוקלט של העכבר חרוט מונע תגובות transretinal. Photoresponses היו נמוך לעבור סינון ב-Hz 30 (8-מוט Bessel), דיגיטציה של kHz 1 ומאוחסנים במחשב לניתוח נוסף. עקבות המוצגים הם בסיס ממוצעes התגובות 5-10 בעוצמות האור העמום 3-5 ותגובות בעוצמות אור רוויי.

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li>
<li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li>
<li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M%2FL-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li>
<li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
</ol>

מחבר אין לי מה לחשוף.

שיטת מוט ו חרוט מונחה הקלטות transretinal ERG המתואר לעיל הופך כלי רב עוצמה על חקירת פונקציה של photoreceptors עכבר בסוג הן פראית בבעלי חיים מהונדסים גנטית. בנוסף לאפיון קל של נכסים photoresponse בסיסיים, טכניקה פשוטה זו מספקת יציבות בתגובה רבה במהלך לטווח ארוך ניסויים שבוצעו על קרוב אל שלמים ההכנות הרשתית. שניהם כהה להתאים אמפליטודה מוט בתגובה רגישות מירבית בעכברים מסוג בר יציבים בתוך לפחות 1h מתחילת הקלטות, ואת משרעת חרוט כהה להתאים רגישות מקסימאלית, ובדרך כלל לא לרדת יותר מ 10%...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם החומר </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> במדעי החיים TOCRIS </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> כל ריאגנטים אחרים </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> זכוכית נימים </td><td></td><td> Precision של מכשירים בעולם </td><td> TW100-4 </td><td> להכנת אלקטרודות </td></tr><tr><td> מסנן נייר </td><td> HARG </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> פוטומטר </td><td></td><td> UDT מכשירים </td><td> S350 </td><td> לצורך כיול האור </td></tr><tr><td> סיליקון רדיומטרי חיישן </td><td></td&gt; <td> UDT מכשירים </td><td> 221 </td><td> לצורך כיול האור </td></tr><tr><td> נגד רעידות השולחן </td><td></td><td> טכני ייצור Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> כדי למזער את הרעש המכני </td></tr><tr><td> מדחס אוויר פנתר P 15TC </td><td></td><td> ורתר הבינלאומי </td><td> P 15TC </td><td> מחובר שולחן נגד רעידות </td></tr><tr><td> סטראו </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> לנתיחה העין העכבר </td></tr><tr><td> תמונה ממירי אינפרא אדום </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> חייב סטראו </td></tr><tr><td> ההפרש מגבר DP-311 </td><td></td><td> וורנר מכשירים </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> האקסון Digidata 1440A digitizer </td><td>; </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> ערוץ כפול 8-מוט מסנן </td><td></td><td> קרון-הייט Corporation </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> קרמיקה נגד </td><td></td><td> TE קישוריות </td><td> הרמטכ&quot;ל SBCHE618RJ </td><td> עבור מחמם שוב את הפתרון זלוף </td></tr><tr><td> תרמי </td><td> T </td><td> Physitemp מכשירים </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> צג הטמפרטורה </td><td></td><td> אומגה </td><td> DPi32 </td><td> מחובר תרמי </td></tr><tr><td> נורית 505 ננומטר </td><td></td><td> TT אלקטרוניקה / Optek טכנולוגיה </td><td> Digi-Key P / N 365-1185-ND </td><td> כדי להחיל מבחן / גלי אור הלבנה </td></tr><tr><td> כויה עט </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> לסימון חלק הגביגלגל העין של העכבר </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 Electrophysiology רכישת נתונים ותוכנה ניתוח </td><td></td><td> התקנים מולקולריים </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg הקלטות של רשתית עכבר: רוד photoresponses חרוט

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

ישנם שני סוגים שונים של התמונה יוצרי photoreceptors ברשתית חוליות: מוטות קונוסים. מוטות מסוגלים לזהות פוטונים בודדים של אור בעוד גביעי לפעול ברציפות תחת המשתנה במהירות בתנאי תאורה בהירים. קליטת האור על ידי מוט ו חרוט ספציפיים פיגמנטים ויזואליים של המגזרים החיצוניים של photoreceptors מפעילה מפל phototransduction שבסופו של דבר מוביל סגירת נוקלאוטיד-מגודרת ערוצי מחזורית על קרום פלזמה hyperpolarization התא. שינוי זה האור הנגרמת בקרום הנוכחי ופוטנציאל יכול להיות רשום כ photoresponse, על ידי 1,2 קלאסית האלקטרודה יניקה הקלטה לטכניקה או הקלטות electroretinogram transretinal (ERG) של הרשתית מבודדים עם חסומים פרמקולוגית רכיבים תגובה postsynaptic 3-5. השיטה השנייה מאפשרת סמים נגישים לטווח ארוך הקלטות של photoreceptors העכבר הוא שימושי במיוחד עבור קבלת photoresponses יציבים frאום את הקונוסים עכבר נדיר ושברירי. במקרה של קונוסים, ניסויים כאלה יכולים להתבצע גם בתנאי חושך, המותאמים תאורה חזקה הבאה זה עלול להלבין למעשה כל פיגמנט ויזואלי, כדי לפקח על תהליך ההתאוששות של רגישות חרוט במהלך עיבוד כהה 6,7. בסרטון הזה, אנו נראה כיצד לבצע מוט ו-M / L-חרוט מונחה הקלטות transretinal של הרשתית כהה מותאם העכבר. הקלטות רוד יבוצע באמצעות הרשתית מסוג (C57Bl / 6) עכברים בטבע. לשם הפשטות, הקלטות חרוט יהיה לקבל מהונדסים גנטית מוט transducin α-למקטע בנוקאאוט (Tα - / -) עכברים אשר חסרים מוט איתות 8.

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

ברשתית של חוליתיים קיימות שתי מחלקות נפרדות של פוטורצפטורים יוצרי תמונה: קולבלים וקונוסים. קולבלים מסוגלים לזהות פוטונים בודדים של אור...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ביצוע הקלטות של אלקטרו-רטינוגרמה (electroretinogram) טראנס-רטינלית מרשתית עכבר שלמה ומבודדת, כדי לקבל תגובות פוטו-חשמליות המונעות על ידי פוטו-רצפטורים מסוג פיתונים (rods) וקונוסים (cones). ראשית, מוכנים קפילרות זכוכית ותא פרפוזיה לצורך ההקלטות. שתי גביעי העין של עכבר שהותאם לחושך עוברים הדיסקציה.תחת תאורה באינפרא-אדום, מוסרים את עדשת הקרנית ואת הגוף הזגוגית. הרשתית מופרדת מהאפיתל הפיגמנטי ומונחת על נייר סינון כאשר צד הפוטו-רצפטורים פונה כלפי מעלה. הרשתית שעל נייר הסינון מועברת לתא הפרפוזיה שעלבמה המיקרוסקופ ומונחת בין שתי אלקטרודות המחוברות ליחידת הראש של מגבר דיפרנציאלי.לבסוף, תגובות פוטו-רספונסיביות המתווכות על ידי קולביים וקונוסים נרשמות מרשתית עכבר המורכבת באופן שטוח. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הקלטות קלאסיות של תא בודד, הוא שהיא מאפשרת הקלטות ארוכות טווח עם גישה לתרופות מקולטנים של קולביים וקונוסים בעכברים מסוג פרא (wild type) ובעכברים שעברו שינוי גנטי. שיטה זו הופכת למועילה במיוחד להשגת תגובה יציבה מהתאים הנדירים והשבירים של העכבר.התחילו בהכנת קפילריות הזכוכית. הכינו 10 milliliters של 1.2% agar באמבט מים חמים. מלאו את קפילריות הזכוכית בתמיסת ה-agar באמצעות מזרק פלסטיק, שבו ה-agar נקרש במהירות.חתוך את הקפילריים לחצאים באמצעות סכין יהלום. השרה את אלקטרודות הזכוכית שהתקבלו בתמיסת אלקטרודות לעכבר למשך 24 שעות לפחות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. כעת הכן את המיקרוסקופ באופן כללי כדי למזער רעשים מכניים ואלקטרומגנטיים.הציבו את המיקרוסקופ על שולחן נגד רעידות והגנו עליו באמצעות כלוב פאראדיי. עם זאת, מאפיינים אלו אינם חיוניים. כיילו את מקור האור באמצעות פוטומטר שהוצב במישור הרשתית.במקרה של מקור אור LED, השתמש במפזר אופטי כדי להשיג אחידות בתאורה באמצעות צינורית פלסטיק וקפילרית זכוכית. צור חיבור בין האלקטרודה התחתונה לבין מחזיק האלקטרודה. לאחר מכן, מלא את חלל האלקטרודה התחתונה של תא הפרפוזיה בתמיסת אלקטרודות.ודאו שאין בועות באלקטרודה, בצינור החיבור או במחזיק האלקטרודה. הסירו בועות על ידי שטיפת התמיסה באמצעות מזרק. לאחר הצבת תא ההקלטה תחת המיקרוסקופ, חברו את מחזיק האלקטרודה התחתון לקוטב החיובי של ראש הבמה (head stage) במגבר הדיפרנציאלי.לאחר מכן, מרכזו ויישרו את פתח האלקטרודה התחתונה של התא עם בועת נקודת אור הגירוי, ואת תמיסת הפרפוזיה המנוטרלת בביקרבונט עם 95% oxygen ו-5% carbon dioxide, תוך דגירה באמבט מים של 40 °C. ה-pH של התמיסה יהיה 7.2. חברו את קו הפרפוזיה לתא ההקלטה והפעילו את הפרפוזיה.התמיסה זורמת מהבקבוק לתא ההקלטה באמצעות כוח הכבידה. היא עוברת דרך נגד קרמי, המחמם אותה מחדש ל-36 או 37 °C. כדי להפחית את איבוד החום, יש למקם את המחמם קרוב ככל האפשר לתא ההקלטה.באופן אידיאלי, התקינו על במת המיקרוסקופ ווסת זרימה במסלול התמיסות וכילו אותה לכ-1 milliliter per minute. כעת, חברו את האלקטרודה העליונה לקוטב השלילי השני של יחידת הראש (head stage) באמצעות מחזיק אלקטרודות עם טבעת O-ring, וקשרו את חיישן הטרמוקופל לאלקטרודה זו כך שקצותיהם יהיו קרובים ככל האפשר, כדי שקריאת הטמפרטורה תתבצע בקרבת מרכז הרשתית. לאחר מכן, טבלו את קצה האלקטרודה העליונה בתמיסת הפרפוזיה והניחו אותה במרכז התא.המתן 10 עד 15 דקות להתייצבות קו הבסיס. לבסוף, כוון את מתח ה-DC עבור המחמם כך שטמפרטורת התמיסה תהיה 36 עד 37 °C. הכן את העכבר באמצעות הסתגלות לחושך למשך לילה.השתמשו בעכברים מסוג wild type כגון C 57 black six להקלטות טרנס-רטינליות המונעות על ידי קולטני rod, או בעכברים עם knockout של alpha המעבירים אותות rod, אשר חסרי איתות rod, להקלטות טרנס-רטינליות המונעות על ידי קולטני cone. לפני העבודה בחושך, הכינו פיסת נייר סינון מרובע על ידי יצירת חור בקוטר 2 עד 2.5 millimeter במרכזו ושימון פינותיו. את כל השלבים הבאים יש לבצע תחת תאורה באינפרא-אדום. מיקרוסקופ הדיסקציה מצויד בממירי תמונה באינפרא-אדום עבור גלובולי העין החצויים.הסירה את שתי הקרניות ואת העדשות. הסר כמה שיותר מהזגוגית במהלך תהליכים אלו. המשך בעבודה עם גביע עין אחד בכל פעם.ניתן לשמור את גביע העין השני למשך מספר שעות בצלחית עם תמיסכת דגירה בתוך קופסה שקופה הרווה בחמצן טהור ובטמפרטורת החדר, לצורך הקלטה מרשתות שלמות. קלפו את הרשתית הראשונה משכבת אפיתל הפיגמנט, ובמידת הצורך, נקו אותה היטב באמצעות פינצטה כדי להסיר גרגירים שנותרו של אפיתל הפיגמנט. כדי להקליט מהאזור הגבי (dorsal) של הרשתית, הסירו את החלק הבטני (ventral) של גביע העין לפני קילוף הרשתית, באמצעות להב תער או מיקרו-מספריים.בעזרת סימני הייחוס של corry, הסר את גביע העין הוונטרלי. השתמש בפפית כדי להעביר את הרשתית המבודדת לתוך טיפה של תמיסת פרפוזיה על מכסה של צלחת פטרי. לאחר מכן, הוסף חמש עד שש טיפות קטנות של תמיסת אלקטרודות המכילה barium chloride.הניחו בעזרת פינצטה את המסנן המוכן עם החור בתוך טיפה של תמיסת פרפוזיה עם הרשתית. מקמו את הרשתית על גבי נייר המסנן כאשר צד הפוטורצפטורים פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, לחצו על שולי הרשתית בהיקף כדי לקבע אותה בצורה שטוחה (flat mount).יש למרכז את הרשתית מעל הפתח בנייר המסנן. כעת העבירו את נייר המסנן עם הרשתית לתא הפרפוזיה והניחו אותו מעל נקודת הגירוי, במקביל למקום האלקטרודה התחתונה. לחצו קלות על קצוות הגריז של נייר המסנן כדי להצמידו לתא.לבסוף, מקמו את האלקטרודה העליונה מעל מרכז הרשתית כך שהאלקטרודה תיגע קלות בשכבת הפוטורצפטורים. כעת המשיכו בניסוי שבו מבצעים הקלטות טרנס-רטינליות. לצורך הניתוח שלנו, אנו משתמשים בתוכנה לרכישת וניתוח נתונים Peak Lamp 10 מבית Molecular Devices בהתאם לפרוטוקול.השתמשנו באור LED באורך גל של 505 nanometers ממקור LED זה במהלך סשני הקלטה ארוכים. כדי לשמור על דיכוי יעיל של הרכיב הגליאלי של התגובה הפוטואופטית, יש להחליף את תמיסת האלקטרודה התחתונה. לפני הבדיקה, כל רשתית צריכה להספיק.עוצמת ההבזק של מקור אור ה-LED נשלטה באמצעות שילוב של בקרה ממוחשבת של נגדים הניתנים למיתוג למתח ה-LED ומערכת של מסנני צפיפות ניטרלית שהוצבו בין ה-LED לרשתית. משך הבזק הבדיקה של ה-LED, שהיה בדרך כלל 20 milliseconds, נשלט על ידי מחשב. הקלטות טרנס-רשתיות המונעות על ידי קולטני גביש בעכברים מסוג C 57 black six, מראות עקומות המייצגות ממוצעים של חמישה עד שישה תגובות בעוצמות אור עמומות, ושתיים עד שלוש תגובות בעוצמות אור רוויות.כל עקבה של נתוני קידוד רטינלי חוצה-קונוסים אלו, שהופקו מעכבר עם נוק-אאוט של alpha במערכת ההעברה של הטרגני (rod), מייצגת ממוצע של חמישה עד 10 תגובות בעצמות אור נמוכות, ושלוש עד חמש תגובות בעצמות אור רוויות. לפיכך, לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לנו הבנה טובה לגבי אופן הביצוע של הקלטות אלקטרוגרמה רטינלית מרשתית עכבר מבודדת, כדי לקבל תגובות פוטו-אלקטריות המונעות על ידי טרגנים וקונוסים.

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנחנו נראה איך להקליט תגובות פלאש מן קונוסים עכבר בודד באמצעות אלקטרודה יניקה.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

סרטון זה מדגים הקלטה של אלקטרורטינוגרמה מצומדת ישירה (DC-ERG) על אפיתל פיגמנט רשתית של עכבר מותאם כהה ומורדם (RPE). לאחר החלת טיפות מרחיבות, החיה ממוקמת במערך הקלטה, והאלקטרודה הנימית המלאה בחיץ מלח ממוקמת על הקרנית. לאחר הקמת קו הבסיס, DC-ERG נרשם.

רישום אלקטרורטינוגרמה בצימוד ישיר של אפיתל פיגמנט הרשתית בעכבר

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות...

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

האלקטרורטינוגרמה (ERG) היא פוטנציאל חשמלי שנוצר על ידי הרשתית בתגובה לאור. מאמר זה מתאר כיצד להשתמש ב-ERG כדי להעריך את תפקוד הרשתית, בחולדות מותאמות לחושך, וכיצד ניתן להשתמש בו כדי להעריך התערבות נוירו-פרוטקטיבית, במקרה הנוכחי התניה איסכמית מרחוק.

שימוש בelectroretinogram כדי להעריך את התפקוד ברשתית מכרסמים וההשפעות המגנות של האיבר המרוחק איסכמי אכשור קד

Ex vivo ERG יכול לשמש לתיעוד פעילות חשמלית של תאי רשתית ישירות מרשתית שלמה מבודדת של בעלי חיים או בני אדם. אנו מדגימים כאן כיצד ניתן להתאים מערכות ERG in vivo להקלטות ERG ex vivo על מנת לנתח את הפעילות החשמלית של תאי הרשתית.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

פרוטוקול זה מתאר מדידה סימולטנית של אלקטרורטינוגרמה ופוטנציאלים מעוררים חזותיים בחולדות מורדמות.

הקלטה בו זמנית של Electroretinography ופוטנציאלים חזותיים מעוררים אצל חולדות הרדימו

אנחנו מראים נהלי השתלת הקלטה כירורגית למדוד אותות חזותיים אלקטרו מן העין (electroretinogram) והמוח (ויזואלי עורר פוטנציאל) בחולדות מודעות, וזה יותר מקביל למצב האנושי שבו הקלטות מתנהלות ללא מקעקעת הרדמה.

השרשה ורישום האלחוטי electroretinogram ופוטנציאל חזותי מעורר אצל חולדות Conscious

כאן, אנו מציגים שיטה להקלטת תגובות חשמליות אור-עורר של אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) בעכברים באמצעות טכניקה המכונה DC-ERGs שתואר לראשונה על ידי מרמורשטיין, Peachey, ועמיתים בתחילת שנות ה-2000.

אלקטרורטינוגרמה ישירה (DC-ERG) להקלטת התגובות החשמליות המעוררות אור של אפיתל פיגמנט רשתית העכבר

למדו כיצד לבצע הקלטות ERG טרנס-רטינליות מרשתית עכבר שלמה לבידוד תגובות פוטורצפטוריות של מוטות וחרוטים. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של תפקוד הרשתית ועיבוד האות הוויזואלי.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

גלה סרטונים נוספים