בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבודד תאים חיוביים ל-lax Z מהשבלול של עכבר רך-גס באמצעות ציטומטריית זרימה. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד מספר רב של שבלולים של עכברים בפרק זמן קצר יחסית כדי לשמור על חיוניות התאים ולהבטיח כמות מספקת של רקמה התחלתית. כשלב שני, התאים החיוביים ל-LAX Z מופרדים ואז מסומנים כדי להכין את הרקמה למיון.

לאחר מכן התאים מופרדים באמצעות ציטומטריה של זרימה. את אוכלוסיות ה-LAX Z high וה-lax low המתקבלות ניתן להשתמש בהן לניסויים נוספים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום חקר האוזן, כגון מהם פרופילי הגנים או אוכלוסיות התאים הספציפיות בתוך האוזן הפנימית.

את הפרוצדורה תדגים Taha Gen, סטודנטית לרפואה מהמעבדה שלנו. ראשית, מלאו צלחות פטרי של 35 מילימטר ב-HBSS והניחו אותן על גוש קרח. לאחר מכן, השתמשו במספרי איריס כדי לבצע עריפת ראש ל-12 עד 15 עכברים postnatal בני 0 עד 3 ימים, מהזן axon, two laxy reporter ומהזן wild type, לאחר שהורדמו.

הניחו את הראשים בתוך צלחת פטרי של 60 מילימטר על גבי בלוק קרח. לאחר מכן, השתמשו בפינצטת Dumont מספר 5 ובמספרי איריס כדי להסיר את הלסת התחתונה ואת הלשון מהראשים, ואז גזרו את בסיס הגולגולת בגובה החיך. כעת הסירו את העור המכסה את הקהה (calvar) וחתכו את בסיס הגולגולת על ידי הכנסת המספריים מהחלק התחתון של ה-foramen magnum ועד למרכז החיך.

בצעו חתך נוסף בעזרת המספריים מקצה החיתוך של החיך אל ההיבט העליון של ה-calver בשני הצדדים, תוך הקפדה שלא לפגוע ב-otic capsule. לאחר מכן, השלימו את בידוד עצם הרקה על ידי ביצוע שני חתכים בזווית של 45 מעלות, החל מההיבט העליון של ה-frame וה-magnum ועד לחתך הקורונלי בחיך הקשיח.

לאחר מכן, הניחו את עצמות הרקה המבודדות בתוך צלחות פטרי של 35 מילימטר המכילות HBSS על גבי בלוק הקרח, והעבירו את בלוק הקרח למנדף נתיחה סטרילי. לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי נוספת של 35 מילימטר, הפעם ב-PBS, והניחו אותה על בלוק הקרח. בעזרת שתי פינצטות מספר 55.

התחילו במיקרו-דיסקציה על ידי הסרה עדינה של הקליפה (cortex), גזע המוח והמוחון מעצם הרקה המכסה את הקפסולה האוטיקה (otic capsule). לאחר מכן, מבלי להסיר את הקפסולה האוטיקה, השתמשו בשבביה כדי להסיר חלקים מקפסולת השבלול, החל מכניסת עצב השמיעה והשיווי משקל (vestibular cochlear nerve) והמשך לתוך הקפסולה האוטיקה. לאחר חשיפת בסיס השבלול, משכו בעדינות החוצה את איבר קורטי (organ of corti) ואת הרקמות שסביבו.

לאחר מכן, החל מהבסיס, הסר את שאריות הגנגליון הספירלי (spiral ganglion) ואת ה-stria vascularis והעבר את הקוכלא למנת Petri מלאה ב-PBS. ראשית, טפטף 50 µL של PBS סטרילי למרכז של אחד עד שני בארות של צלחת תרבית בעלת שש בארות ללא ציפוי. לאחר מכן, העבר לא יותר מ-20 קוכלאות לכל טיפת PBS.

בשלב הבא, חממו מראש מנות של 50 µL של 0.125% trypsin למשך כשתי דקות באמבט מים של 37 °C. לאחר מכן, הוסיפו את ה-trypsin לשבלול, תוך הקפדה לא לנער את הצלחת.

דגרו את השבלול (cochlea) בטמפרטורה של 37 °C למשך שמונה דקות. הפסיקו את הטיפסינציה על ידי הוספה של 50 µL של מעכב טריפסין מסויה (soybean trypsin inhibitor) לכל טיפה, ולאחר מכן הוסיפו 50 µL נוספים של מצע גידול מלא לאחר כיוון פיפטמן P200 ל-125 µL. השתמשו בקצה פיפטה קהה של 300 µL כדי לטלטל בעדינות את התאים 80 פעמים, תוך הקפדה לא ליצור בועות.

לאחר שכל טיפה עברה טריטורציה, הוסיפו לכל אחת 200 µL נוספים של מצע גידול מלא. כעת העבירו את התאים דרך מסנן תאים של 40 micron לבאר חדשה באותה פלטת שש בארות, ולאחר מכן העבירו את התאים מכל באר לשפופרות FACS סטנדרטיות נפרדות.

בשלב הבא, העבירו 100 µL של תאי wild type לכל אחד משלושה מבחנות, ולאחר מכן בצעו דילול עם 300 µL של מצע גידול מלא עבור ה-CUG בלבד. עבור הביקורת, דללו 10 µL של axon, שני תאי LAX Z ב-390 µL של מצע גידול מלא. העבירו את שאר תאי ה-axon two lax Z למבחנות fax ב-400 µL של OTs.

לאחר דגירה של המבחנות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות, הוסיפו 200 µL של CUG מדולל לכל מבחנה מתאימה. לאחר מכן, תוך הגנה של כל המבחנות מפני אור, דגרו את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C למשך 25 דקות. לצורך הצביעה, בזמן דגירת התאים, העבירו 10 mL של HEPES פלוס FBS שהוכנו טריים למבחנה של 15 mL והניחו את המבחנה על קרח.

לאחר מכן, הוסף 1.8 milliliters של תמיסת ה-heap קרה מהקרח לכל אחת מבחולות ה-fax תחת מסיף סטרילי כאשר האורות כבויים כדי למזער את החשיפה לאור. לאחר מכן, סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1200 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את supernatant והשהה מחדש את ה-pellets ב-300 microliters של מדיום מלא.

אגדו את כל המנות עבור דגימת המיון, ולאחר מכן הוסיפו propidium iodide לכל מבחנה מתאימה עד לריכוז סופי של 1 µg/mL. לבסוף, לאחר כיסוי התאים, הניחו אותם שוב על קרח. הגדירו את שערי המיון על ידי איסוף של 1000 אירועים של תאי wild type שלא נצבעו, כדי לקבוע את התפלגות התאים בגרף ה-forward scatter לעומת side scatter.

כוון את פרמטרי ה-forward scatter וה-side scatter לפי הצורך. לאחר מכן, בצע פיצוי (compensation) באמצעות תאי wild type לא צבועים, תאי wild type צבועים ב-PI, ואקסון צבוע ב-CUG. שני תאי LAX Z.

מלאו שני מבחנות fax ב-500 µL של מצע גידול מלא. לאחר מכן, התחילו את הניתוח עם תאי wild type שצבעו ב-PI ותאי axon two שצבעו ב-Lae CUG; הגדירו שער (gate) להסרת שברים (debris) בהתבסס על תרשים ה-forward scatter לעומת side scatter. הסירו דובלטים וצבירים באמצעות תרשים של forward scatter height לעומת forward scatter area.

לאחר מכן, יש להוציא תאים מתים חיוביים ל-PI על בסיס תרשים של שטח הפיזור קדימה (forward scatter area) לעומת שטח ה-PE sci five. עבור כל מיקום שער (gate), הגדירו תרשים של שטח הפיזור קדימה לעומת שטח ה-cascade או ה-Pacific blue. נתחו 10,000 אירועים מתוך מבחנת דגימת המיון המכילה תאים שצבעו ב-axon two laxy, PI ו-CUG, תוך שימוש בכל השערים שהוגדרו עבור תאי הטיפוס הפראי (wild type), וזאת באמצעות תרשימים של תאי הטיפוס הפראי.

צרו שערים (gates) עבור תאים עם רמת Cascade Blue גבוהה המהווים פחות מ-1% מסך האירועים. שערי ה-Cascade Blue High אמורים להכיל כעת כ-15 עד 20% מהתאים בדגימת Axon two laxy. לאחר הגדרת תאי ה-Axon two high באמצעות תרשים ניתוח התאים של Axon two laxy, צרו כעת שער עבור התאים בעלי הפלואורסצנציה הנמוכה ביותר, המהווים 15 עד 20% מהתאים, תוך שימוש באסטרטגיית השערים שהוזכרה לעיל.

מיינו את התאים לתוך מבחנות ה-fax המכילות מצע מלא, תוך שמירת מבחנות האיסוף בתא מקורר לארבע מעלות צלזיוס (4 °C) במהלך המיון. רשמו את מספר התאים שנספרו על ידי הציטומטר הזורם עבור כל אוכלוסייה בשתי דמויות אלו. שטחי הפיזור הצדי (side scatter) לעומת שטחי הפיזור הקדמי (forward scatter) של סוג הבר (wild type) המופרד משמאל ושל axon two LA Z מימין.

מוצגים תאי שבלול. שימו לב לבחירת התחום (gating) של קבוצות האירועים המובחנות, שהן בגודל גדול בהרבה מאותם אירועים הקרובים לציר ה-Y המוגדרים כאוכלוסיית השברים (debris negative population). בדרך כלל, 40% עד 45% של תאים נקיים משברים מופקים הן מהשבלול של סוג הבר (wild type) והן מזה של axin two LAX Z בשני הלוחות הללו.

הגובה של הפיזור קדימה (forward scatter height) לעומת השטח של הפיזור קדימה (forward scatter area) משמש להסרת דובלטים מתוך השאריות (debris) שסוננו בשלב קודם. אירועים של אוכלוסיות שליליות החורגים מהאופי הליניארי הצפוי של התרשים מוצאים מהניתוח. הכנה זו מניבה בדרך כלל 71.1% אירועים בתוך השער שהוגדר כאן.

Propidium iodide, כפי שזוהה על ידי ערוץ ה-PE SCI החמישי, משמש להדרה של תאים מתים כפי שנראה בתרשימי פיזור אלה. כ-95% מהתאים הממוינים היו חיוניים ולא קלטו PI בלוחות אלה. ערוץ ה-Cascade blue שימש לזיהוי התסבסור הפלואורסצנטי CUG, כפי שניתן לראות באיור מימין.

בממוצע, כ-20% העליונים של התאים החיוביים ל-CUG הם תאי lae high, המתאימים לכ-15,000 תאי axon, שני תאי high לכל 10 עד 12 בעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ההכנה והבידוד של תאי laxy high באמצעות ציטומטריית זרימה מרקמות של האוזן הפנימית, הן עבור ניסויי cell Turing והן עבור ניסויים כגון פרופיל גנים.