Name: בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: למד לבודד תאים מבטאי LacZ מרקמות האוזן הפנימית של עכברים ניאונטליים באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת ניתוח פרופילי גנים באוכלוסיות תאים ספציפיות באוזן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים ל-S. Heller, K. Oshima, R. Nusse ו-Y. Zeng על דיונים פוריים, ול-C. Tang, A. Lee, E. Liaw ולצוות של ה-Stanford Shared FACS Facility על סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת הכשרה למחקר רפואי של ה-Howard Hughes Medical Institute, תוכנית ה-Stanford University Medical Scholars (שתיהן עבור T.A.J.), מלגות הדיקן של Stanford University (עבור R.C.), ה-American Otological Society, ה-Triological Society, ה-Percy Memorial Award, קרן ה-Akiko Yamazaki and Jerry Yang Faculty Scholar, וכן NIDCD/NIH K08 DC011043 (כולן עבור A.G.C.).

1. מיקרו-דיסקציה של השבלול
<ol>
	<li>הכן את מיקרוסקופ הדיסקציה תחת מpostgresql-מנשף על ידי ניגוב המשטחים באתנול 70% והצבת קוביות קרח.</li>
	<li>הכינו 10–15 צלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ תחת תנאים סטריליים ומלאו אותן עד מחציתן (~2 מ"ל) בתמיסת HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) סטרילית עם סידן.</li>
	<li>הכינו שתי צלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ תחת תנאים סטריליים ומלאו אותן עד מחציתן (~2 מ"ל) בתמיסת PBS (phosphate buffered solution) סטרילית בריכוז 1x.</li>
	<li>עקרו פינצטות מיקרוסקופיות בתוך מבחנת Falcon קונית של 50 מ"ל עם אתנול 70%.</li>
	<li>בחדר נפרד ממבנה העבודה הסטרילי (sterile hood), השתמש במספרי איריס כדי לבצע עקירה של הראש (decapitation) ל-12-15 עכברי Axin2 בגיל 0-3 ימים לאחר הלידה (P).LacZ/+ עכברי דווח (reporter mice) והנח את הראשים על צלחת פטרי בנפח 60 מ"מ על גבי בלוק קרח.</li>
	<li>באמצעות פינצטה Dumont מס' 5 ומספרי איריס, יש להסיר את הלסת התחתונה ואת הלשון ולחתוך דרך בסיס הגולגולת בגובה החיך.</li>
	<li>הסר את העור המכסה את כיפת הגולגולת (calvaria) וחתוך את בסיס הגולגולת על ידי החדרת המספריים מהחלק התחתון של הפורמן מגנום (foramen magnum) עד למרכז החיך.</li>
	<li>בצעו חתך נוסף באמצעות מספרי איריס מקצה החתך של החיך אל החלק העליון של כיפת הגולגולת (calvaria) משני הצדדים, תוך הקפדה שלא לפגוע בקפסולה האוזנית (otic capsule).</li>
	<li>בידוד מלא של עצם הרקה באמצעות ביצוע שני חתכים בזווית של 45 מעלות, המתחילים מההיבט העליון של הפורמן מגנום (foramen magnum) ונמשכים עד לחתך הקורונלי בחיך הקשיח.</li>
	<li>הנח את עצמות הרקה המבודדות בצלחות פטרי בנפח 35 ממ" שמכילות HBSS על גבי בלוק קרח.</li>
	<li>אספו עצמות רקה מ-12–15 בעלי חיים שעברו הקרבה, לסך הכל 24–30 עצמות רקה.</li>
	<li>העבר את צלחת הפטרי עם עצמות הרקה המבודדות למכסה חיטוי לניתוח שהוכן מראש (1.1).</li>
	<li>העבירו ארבע עצמות רקה לכל צלחת פטרי בנפח 35 מ"מ שהוכנה מראש ומכילה HBSS (1.2), והניחו על בלוק קרח.</li>
	<li>התחילו במיקרו-דיסקציה באמצעות שתי פינצטות מסוג #55 כדי להסיר בעדינות את הקורטקס, גזע המוח והמוחון בעצם הרקה המכסה את הקפסולה האוטיקה (otic capsule).</li>
	<li>ללא הסרת הקפסולה האוטיקה (otic capsule), השב אטו של חלקי קפסולת השבלול (cochlear capsule), החל מנקודת הכניסה של העצב הווסטיבולוקוכלארי (vestibulocochlear nerve) אל הקפסולה האוטיקה.</li>
	<li>לאחר חשיפת בסיס השבלול (cochlea), משוך בעדינות את השבלול והרקמות שסביבו החוצה. הסר את שארית הגנגליון הספירלי (spiral ganglion) ואת ה-stria vascularis, החל מהבסיס.</li>
	<li>העבר את השבלול (cochlea) לפיתרי (Petri dish) של 35 מ"מ המכיל PBS על גבי בלוק קרח.</li>
	<li>על מנת להבטיח חיוניות אופטימלית של הרקמה, משך הזמן הכולל של הניתוח צריך להיות קצר מ-60 דקות.</li>
	<li>חזור על השלבים לעיל עבור 3-5 עכברים מסוג בר (WT) בגילאי P0-P3, כביקורות עבור עכברי Axin2-LacZ.</li>
</ol>
2. פירוק תאים (שונה משיטות שתוארו בעבר)2,10
<ol>
	<li>העבירו 50 μl של PBS סטרילי למרכז של באר בצלחת תרבית עם 6 בארות ללא ציפוי.</li>
	<li>העבירו עד 20 cochleae של Axin2LacZ/+ לתוך כל טיפה של 50 μl של PBS. יש להשתמש בטיפה חדשה של 50 μl PBS עבור יותר מ-20 cochleae.</li>
	<li>חממו מראש מנות (aliquots) של 50 μl של 0.125% trypsin למשך כ-2 דקות באמבט מים של 37°C.</li>
	<li>הוסיפו 50 μl של 0.125% trypsin שחומם מראש ל-PBS המכיל את ה-cochleae.</li>
	<li>הניחו את צלחת 6-הבארות ב-37°C למשך 8 דקות, תוך הקפדה לא לנער את הצלחת.</li>
	<li>כדי להפסיק את ה-trypsinization, הוסיפו 50 μl של מעכב טריפסין מסויה (soybean trypsin inhibitor) לכל טיפה של 100 μl.</li>
	<li>הוסיפו 50 μl נוספים של Full Media (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicillin ב-DMEM/F12)2</li>
	<li>באמצעות טיפ קהה של 300 μl עם pipetteman p200 המכוון ל-125 μl, בצעו טריטורציה (trituration) עדינה של התאים 80 פעמים, תוך הקפדה לא ליצור בועות.</li>
	<li>בעקבות טריטורציה של כל טיפה, הוסיפו 200 μl נוספים של FM לכל באר.</li>
	<li>העבירו את התאים דרך מסנן תאים כחול של Falcon של 40 μm לבאר חדשה.</li>
	<li>העבירו את התאים לשפופרות FACS סטנדרטיות של Falcon (נשארים כ-300 μl לאחר הטריטורציה והסינון).
	<ol class="lalpha">
		<li>פצלו את התאים מ-cochleae של wildtype לשלוש שפופרות, תוך דילול של 100 μl עם 300 μl FM בכל שפופרת. שפופרת אחת תשמש כביקורת blank, אחת תיצבע ב-propidium iodide (PI, 1 μg/ml) בלבד (לא להוסיף בשלב זה), ואילו האחרונה תיצבע ב-3-carboxyumbelliferyl β-D-galactopyranoside (CUG, ראו 2.15) כדי לזהות פלואורסצנציית רקע.</li>
		<li>הניחו 400 μl של תאים מופרדים מ-cochleae של Axin2-LacZ בכל שפופרת FACS. כביקורת CUG בלבד, דללו 10 μl של תאים ב-390 μl FM (ראו שפופרת F בשלב 2.15). השלימו את הנפח של שאר השפופרות ל-400 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>דגרו את התאים באינקובטור לח ב-37°C למשך 10 דקות.</li>
	<li>הכינו תמיסת CUG:
	<ol class="lalpha">
		<li>הכינו 200 μl של CUG עבור כל שפופרת FACS הדורשת צביעה.</li>
		<li>דללו CUG ב-FM ביחס של 1:50 במנדף חשוך עם חשיפה מינימלית לאור.</li>
		<li>חממו מראש את ה-CUG המדולל ב-37°C למשך 3-5 דקות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לאחר מכן, הוסיפו 200 μl של CUG מדולל לכל שפופרת FACS מתאימה. עבור שפופרות שאינן מיועדות ל-CUG, הוסיפו FM בלבד (ראו 2.15).</li>
	<li>בשלב זה, צריכות להיות חמש קטגוריות של שפופרות עם התכנים הבאים (אין להוסיף PI בשלב זה):
	<ol class="ualpha">
		<li>Wildtype - ללא CUG או PI (עבור קומפנסציה, ראו שלבים 3.5-6)</li>
		<li>Wildtype - עם PI בלבד (עבור קומפנסציה)</li>
		<li>Wildtype - עם CUG ו-PI (עבור ביקורת מול תאי Axin2-LacZ)</li>
		<li>Axin2-LacZ - עם CUG בלבד (ע עבור קומפנסציה)</li>
		<li>Axin2-LacZ - עם CUG ו-PI (עבור מיון תאים בפועל)</li>
		<li>Axin2-LacZ - עם CUG ו-PI (עבור ניתוח אירועים)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הגנו על כל השפופרות מאור ודגרו אותן באינקובטור לח ב-37°C למשך 25 דקות.</li>
	<li>הכינו תמיסת HEPES + Fetal Bovine Serum (FBS) טרייה לעצירת התגובה לאחר הדגירה:
	<ol class="lalpha">
		<li>דללו 400 μl של FBS שהופשר acabado ב-10 ml של HEPES סטרילי 10 mM (ב-PBS) בשפופרת Falcon של 15 ml.</li>
		<li>הניחו את השפופרת על קרח עד לסיום שלב 2.16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הוסיפו 1.8 ml של תמיסת HEPES קרה (קרח) לכל שפופרת FACS תחת מנדף סטרילי כאשר האורות כבויים כדי למזער את החשיפה לאור.</li>
	<li>סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות 1200rpm למשך 5 דקות.</li>
	<li>הסירו את העליון (supernatant) והשביו את התאים שוב ב-300 μl FM, איחדו את כל המנות עבור דגימת המיון (Axin2-LacZ הצבועים ב-CUG ו-PI).</li>
	<li>הוסיפו PI לכל שפופרת כדי להגיע לריכוז סופי של 1 μg/ml.</li>
	<li>הניחו את התאים על קרח והגנו עליהם מאור.</li>
</ol>
3. ציטומטריה של זרימה (Flow Cytometry)
<ol>
	<li>אנו משתמשים במכשיר BD Aria II המצויד בלייזרים של 488-nm, 633-nm ו-407-nm. זיהוי של CUG בוצע באמצעות הלייזר הסגול 407-nm וזיהוי של PI בוצע באמצעות הלייזר הכחול 488-nm במתקן ה-FACS המשותף של סטנפורד.</li>
	<li>נדרש מפעיל מיומן של ציטומטר זרימה. יש להמשיך לשלב הבא לאחר חימום הלייזרים, כיול הגלאים של הציטומטר לפי הוראות היצרן וקביעת פרמטרי מיון אופטימליים. מניסיוננו, מצאנו כי שימוש בדיזה של 100 μm מייעל את חיות התאים עבור ניסויים עוקבים.</li>
	<li>הפרמטרים הבאים שימשו את התהליך: סף (threshold) של 5,000 אירועים, קצב זרימה של פחות מ-3,000 אירועים לשנייה, פיזור קדמי (FSC) ב-125 וולט ופיזור צדי (SSC) ב-250 וולט; ערוץ PE-Cy5 שימש עבור PI וערוץ Cascade Blue עבור CUG.</li>
	<li>יש לשטוף את תא הציטומטר עם 70% אתנול ו-PBS, פעמיים כל אחד, בסדר זה.</li>
	<li>יש להתחיל את הניתוח עם תאים מסוג wildtype שאינם צבועים (מבחנה A בשלב 2.15). יש לאסוף 1,000 אירועים כדי לקבוע את התפלגות התאים בגרף של FSC לעומת SSC. אם הפיזור אינו רצוי, יש להתאים את פרמטרי ה-FSC וה-SSC.</li>
	<li>יש לבצע קומפנסציה באמצעות תאי WT שאינם צבועים (מבחנה A), תאי WT צבועים ב-PI (מבחנה B), ותאי Axin2-LacZ צבועים ב-CUG (מבחנה D). הקומפנסציה תאפשר הבחנה מדויקת יותר של אותות בין אורכי הגל השונים של הלייזרים.</li>
	<li>יש להתחיל את הניתוח עם תאי wildtype צבועים ב-PI וב-CUG (מבחנה C) ולהגדיר פרמטרי גייטינג (gating) עבור:
	<ol class="lalpha">
		<li>הדרה של פסולת (debris) על בסיס גרף של FSC לעומת SSC.</li>
		<li>הדרה של דובלטים וצברים באמצעות גרף של FSC-height לעומת FSC-area.</li>
		<li>הדרה של תאים מתים על בסיס גרף של FSC-area לעומת PE-Cy5-area.</li>
		<li>הגדרת גרף של FSC-area לעומת Cascade Blue-area עם מיקום גייט כלשהו.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בשלב הבא, יש לנתח 10,000 אירועים ממבחנת דגימת המיון המכילה תאי Axin2-LacZ צבועים ב-PI וב-CUG (מבחנה F).
	<ol class="lalpha">
		<li>יש להחיל כאן את כל הגייטים שהוגדרו באמצעות תאי wildtype.</li>
		<li>באמצעות הגרפים של תאי ה-wildtype, יש ליצור גייט עבור תאי Cascade Blue-high המהווים פחות מ-1% מסך כל האירועים.</li>
		<li>אותם גייטים של Cascade Blue-high כוללים כעת כ-15-20% מהתאים בדגימת ה-Axin2-LacZ, ובכך מגדירים תאים אלו כתאי Axin2-high.</li>
		<li>באמצעות גרף הניתוח של תאי Axin2-LacZ, יש ליצור גייט עבור 15-20% מהתאים בעלי הפלואורסנציה הנמוכה ביותר, אשר ייקראו להלן תאי Axin2-low.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בהתבסס על אסטרטגיית הגייטינג שהוזכרה לעיל, יש למיין את התאים למבחנות FACS המכילות 500 μl FM, מבחנה אחת עבור תאי Axin2-high והשנייה עבור תאי Axin2-low. יש לוודא שמבחנות האיסוף נמצאות בתא מקורר ל-4°C במהלך המיון.</li>
	<li>יש לרשום את מספר התאים שנספרו על ידי ציטומטר הזרימה עבור כל אוכלוסייה.</li>
</ol>
4. תוצאות מייצגות (ראו איור 2):
בעזרת הפרוטוקול לעיל, אנו מפיקים בדרך כלל 40-45% תאים נקיים משאריות (debris-free) הן משבלולי השמע של סוג הבר (wildtype) והן של Axin2LacZ/+ (איורים 2A ו-B), כאשר כ-70% מהם נקיים מצמדים (doublets) (ראו איורים '2A ו-'B). מרבית התאים הממוינים הם חיוניים ולא קלטו PI (~95%) (איורים ''2A ו-''B). בממוצע, כ-20% העליונים של התאים החיוביים ל-CUG נחשבים לתאים חיוביים ל-Axin2-LacZ (איור '''2B) ומתאימים לכ-15,000 תאי Axin2-LacZ-high לכל 10-12 בעלי חיים.
ניתוח מיון חוזר באמצעות ציטומטריית זרימה של תאי Axin2-high העלה טוהר של מעל 93% בערוץ Cascade Blue. כדי לאשש עוד יותר את זהותם של תאים אלו, ביצענו צביעה אימונוהיסטוכימית לאחר המיון הן לתאי Axin2-high והן לתאי Axin2-low באמצעות נוגדנים נגד β-galactosidase, ומצאנו כי תאי Axin2-high הכילו כ-93.4% תאים חיוביים ל-β-galactosidase (יותר מ-1,500 תאים נותחו) ותאי Axin2-low הכילו כ-4.8% תאים חיוביים ל-β-galactosidase.
איורים וטבלאות:
<img alt="תהליך בידוד של קוכלא וסימון LacZ; דיאגרמה של ניתוח ציטומטריית זרימה." src="/files/ftp_upload/3432/3432fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="איור 1"> 
איור 1. פרדיגמה ניסויית. האיור לעיל מציג את האסטרטגיה הניסויית הכוללת ואת הטכניקות כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול. קוכלאות מעכברים מסוג wildtype ו-Axin2LacZ/+ נאספות ומפורקות לתאים בודדים, אשר טופלו לאחר מכן ב-CUG, מצע פלואורסצנטי ל-β-galactosidase. תאים עם רמות גבוהות ונמוכות של Axin2-LacZ הופרדו לאחר מכן באמצעות ציטומטריית זרימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig1large.jpg">לחצו כאן כדי להציג גרסה בגודל מלא של תמונה זו.</a>
<img alt="תרשימי פיזור של ציטומטריית זרימה, סוג ברי (wildtype) מול Axin2-lacZ, פסולת, דובלטים, חיוניות, ניתוח LacZ." src="/files/ftp_upload/3432/3432fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="איור 2"> 
איור 2. אסטרטגיות Gating. איור זה מדגים את אסטרטגיות ה-gating ששימשו בציטומטריית הזרימה. A) תאים מופרדים מסוג wildtype שעברו את אותו טיפול כמו תאי Axin2-LacZ מנותחים כאן באמצעות סך של 10,000 אירועים. הפאנל הראשון מציג את שטח הפיזור הצדי (SSC-A) לעומת שטח הפיזור הקדמי (FSC-A). כאן, קבוצה מובחנת של אירועים היא בגודל גדול בהרבה מאותם אירועים הקרובים לציר ה-y. אירועים אלו מוגדרים כ-"Debris Negative". השער (gate) הבא, A', מנתח את תאי ה-"Debris Negative" מהפאנל A, המהווים 43.8% מסך האירועים (ראה טבלה להלן). בפאנל זה, גובה הפיזור הקדמי (FSC-H) לעומת ה-FSC-A משמש להדרה של דובלטים. אירועים החורגים מהמהות הליניארית הצפויה של התרשים מודרים. הכנה זו מניבה בדרך כלל כ-70% אירועים בתוך השער שהוגדר, והתאים הנותרים מודרים. בפאנל A'', נעשה שימוש ב-propidium iodide (PI), כפי שזוהה בערוץ PE-Cy5, כדי לסמן תאים מתים (5.3%). בפאנל הבא (A'''), נעשה שימוש בערוץ Cascade blue כדי לזהות את הסובסטרט הפלורסצנטי CUG. כאן, שערי ה-LacZ-high כוללים פחות מ-1% מסך האירועים. B) תאים מופרדים מעכברי Axin2-LacZ שטופלו ב-CUG ו-PI מנותחים כאן באמצעות סך של 10,000 אירועים. שערי gating זהים מאלו שבפאנל A מיושמים כאן. B' מראה כי 29.5% מהתאים מודרים כדובלטים, בעוד ש-B'' מדגים כי 5.4% אינם חיוניים. השערים הראשוניים לתאי LacZ-high ו-LacZ-low נסרטים באמצעות פאנל B''', כאשר LacZ-high נקבע בתחילה על 19.7% ו-LacZ-low על 20.4%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig2large.jpg">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה בגודל מלא של תמונה זו.</a>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>מספר אירוע</td>
			<td>אחוזים</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>ניתוח סוג בר (Wildtype)</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>א'</td>
			<td>שלילה של שרידים</td>
			<td>4,381</td>
			<td>43.80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>א''</td>
			<td>שלילי-דבלט (Doublet Negative)</td>
			<td>3,116</td>
			<td>71.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>א'''</td>
			<td>שלילי ל-PI</td>
			<td>2,951</td>
			<td>94.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-high</td>
			<td>16</td>
			<td>0.54%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-נמוך</td>
			<td>2,790</td>
			<td>94.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>ניתוח Axin2-LacZ</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ב'</td>
			<td>שלילי לשאריות</td>
			<td>4,218</td>
			<td>42.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ב''</td>
			<td>שלילי-דאבלט (Doublet Negative)</td>
			<td>2,973</td>
			<td>70.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ב'''</td>
			<td>שלילי ל-PI</td>
			<td>2,813</td>
			<td>94.6%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-גבוה</td>
			<td>553</td>
			<td>19.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-נמוך</td>
			<td>573</td>
			<td>20.40%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1. ניתוחים כמותיים של אסטרטגיות ה-gating באיור 2.

<ol><li>Li, H., Liu, H., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+from+the+adult+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med.%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear.</a> Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).</li>
<li>Oshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+stem+cells+in+the+auditory+and+vestibular+organs+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 18-31 (2007).</li>
<li>Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Jaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+marks+cycling%2C+yet+long-lived%2C+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat. Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li>
<li>Kalani, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-mediated+self-renewal+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Wnt-mediated self-renewal of neural stem/progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16970-16975 (2008).</li>
<li>Willert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+lipid-modified+and+can+act+as+stem+cell+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors.</a> Nature. 423, 448-452 (2003).</li>
<li>Zeng, Y. A., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+self-renewal+factors+for+mammary+stem+cells+and+promote+their+long-term+expansion+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are self-renewal factors for mammary stem cells and promote their long-term expansion in culture.</a> Cell Stem Cell. 6, 568-577 Forthcoming.</li>
<li>Chai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Expression+of+Lgr5%2C+a+Wnt+Target+Gene%2C+in+the+Developing+and+Mature+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Expression of Lgr5, a Wnt Target Gene, in the Developing and Mature Mouse Cochlea.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. , Forthcoming.</li>
<li>Lustig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+loop+of+Wnt+signaling+through+upregulation+of+conductin%2Faxin2+in+colorectal+and+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative feedback loop of Wnt signaling through upregulation of conductin/axin2 in colorectal and liver tumors.</a> Mol. Cell Biol. 22, 1184-1193 (2002).</li>
<li>Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+derived+from+the+cochlear+sensory+epithelium+give+rise+to+spheres+with+distinct+morphologies+and+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 173-190 (2009).</li>
<li>Savary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+stem%2Fprogenitor+cells+from+a+postnatal+cochlea+respond+to+Jagged1+and+demonstrate+that+notch+signaling+promotes+sphere+formation+and+sensory+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cochlear stem/progenitor cells from a postnatal cochlea respond to Jagged1 and demonstrate that notch signaling promotes sphere formation and sensory potential.</a> Mech. Dev. 125, 674-686 (2008).</li>
<li>White, P. M., Doetzlhofer, A., Lee, Y. S., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cochlear+supporting+cells+can+divide+and+trans-differentiate+into+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian cochlear supporting cells can divide and trans-differentiate into hair cells.</a> Nature. 441, 984-987 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> J. Neurosci. Methods. 164, 271-279 (2007).</li>
</ol>

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

מחקרים עצמאיים אפיינו יכולת התחדשות מוגבלת בתוך השבלול של רכישים2,10,12,13. באמצעות עכברי GFP-reporter וציטומטריית זרימה, וייט ועמיתיו בידלו תאי תמיכה ספציפיים של השבלול ומצאו כי הם בעלי מאפיינים של תאי נקודת מוצא (progenitor cells)12.
הוכח כי נתיב ה-Wnt הקנוני מסמן אוכלוסיות של תאי גזע/פרוגניטור במערכות איברים מרובות, כולל המוח, בלוטת החלב, המערכת ההמטופואטית, העור וקריפטות המעי במערכת העיכול. עבודות מהעת האחרונה מצאו סיגנלינג Wnt פעיל באוכלוסיית תאים שאינה מאופיינת היטב...

<table><tbody><tr><td>צלח פטרי, פוליסטירן, סטרילי Geriner Bio-one 35 x 10 מ"מ &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-540 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon מסנני תאים, סטריליים, BD Biosciences, כחול, 40 &amp;mu;מ׳ &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>21008-949 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>הנקס&amp;rsquo; תמיסת מלחים מאוזנת (HBSS). תמיסה עם סידן ומגנזיום, ללא פנול אדום, סטרילית &lt;פ&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-456 &lt;פ&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה Cellstar, פוליפרופילן, סטריליות, greiner bio-one, 50 מ"ל &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-346 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה Cellstar, פוליפרופילן, סטריליות, greiner bio-one, 15 מ"ל &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-278 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תמצית משלימה נטולת סרום (50x), נוזל &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N-2 (ריכוז 100x), נוזלי &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>bFGF, גורם גדילה של פיברובלסטים בסיסי אנושי &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1, גורם גדילה דמוי אינסולין-1 מעכבר &lt;פ&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8779&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>EGF, גורם גדילה אפידרמלי אנושי &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו&amp;rsquo;Modified Eagle&amp;rsquo;מצע Medium/Ham&amp;rsquo;תערובת F-12 50/50: בריכוז 1X, עם L-Glutamine ו-15 mM HEPES&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-350&lt;פ&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon מבחנות בעלות תחתית עגולה, חד-פעמיות, פוליסטירן, 12x75&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>60819-295&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, 0.25% (1X) עם EDTA 4Na, נוזל&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Eppendorf</td><td>22491245&lt;פ&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין, מפוליה סויה, מטוהר&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003570&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאים BD Falcon 40um&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>21008-949&lt;פ&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>פלטות רב-בארים, פוליסטירן, Greiner Bio-One, פלטות לא מטופלות, 6 בארים&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-846&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לגילוי LacZ beta-Galactosidase עבור Marker Gene FACS Blue&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>טכנולוגיות גנים מסמנים</td><td>M0255&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד lacz-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

בידוד של סוגי תאים ספציפיים מאפשר לנתח אוכלוסיות תאים נדירות, כגון תאי גזע/פרוגניטור. גישה זו לחקר רקמות של האוזן הפנימית מציבה אתגר ייחודי בשל המחסור בתאים רלוונטיים ובמספר המצומצם של מודלים של עכברי דומה (reporter) טראנסגניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשתמש בגששים מצומדים לפלואורסצנציה כדי לסמן באופן סלקטיבי תאים חיוביים ל-LacZ מהשבלול של עכברים ניאונטליים.
הפתולוגיה הבסיסית השכיחה ביותר של אובדן שמיעה חושית-עצבית היא נזק בלתי הפיך ואובדן של תאי שיער תחושתיים בשבלול (cochlea), הדרושים להמרת גלי קול לדחפים עצביים. עדויות מהעת האחרונה מצביעות על כך שאיברים שמיעתיים ווסטבולריים בעכברים מכילים תאי גזע/פרוגניטורים שעשויים להיות בעלי פוטנציאל רגנרטיבי1,2. ממצאים אלו מצדיקים חקירה נוספת, כולל זיהוי סוגי תאים ספציפיים בעלי מאפיינים של תאי גזע/פרוגניטורים. הוכח כי למסלול האיתות Wnt תפקיד קריטי בשמירה על אוכלוסיות של תאי גזע/פרוגניטורים במספר מערכות איברים3-7. לאחרונה זיהינו בשבלול של היילוד תאים המבטאים Axin2 המגיבים ל-Wnt, אך תפקודם אינו ידוע במידה רבה8.
כדי להבין טוב יותר את התנהגותן של תאים אלו המגיבים ל-Wnt in vitro, פיתחנו שיטה לבידוד תאים המבטאים Axin2 משבלולות של עכברי דורג (reporter) מסוג Axin2-LacZ9. באמצעות ציטומטריה זרימתית לבידוד תאים חיוביים ל-Axin2-LacZ משבלולות שלוכיים (neonatal cochleae), יכולנו לבצע סדרה של ניסויים בתאים חיים כדי לבחון את התנהגותם כתאי גזע או תאי פרוגניטור. כאן אנו מתארים בפירוט את השלבים למיקרו-דיסקציה של שבלול שלוכי, דיסוציאציה של רקמות אלו, סימון של התאים החיוביים ל-LacZ באמצעות סובסטרט פלואוריגני ומיון תאים. טכניקות לדיסוציאציה של שבלולות לתאים בודדים ובידוד תאי שבלול באמצעות ציטומטריה זרימתית תוארו בעבר2,10-12. ביצענו התאמות לטכניקות אלו כדי לבסס פרוטוקול חדש לבידוד תאים המבטאים LacZ מהשבלול השלוכי.

ציטומטריית זרימה היא כלי רב עוצמה המאפשר בידוד וחקר של אוכלוסיות תאים ספציפיות. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לבידוד תאים המבטאים LacZ מרקמות שבלול של עכברים טרנסגניים ניאונטליים. תאי שבלול מופרדים סומנו באמצעות סובסטרטים המשורשרים לפלואורופור של β-galactosidase לפני ההפרדה באמצעות ציטומטריית זרימה.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

בידוד של סוגי תאים ספציפיים מאפשר לנתח אוכלוסיות תאים נדירות, כגון תאי גזע או תאי פרוגניטור (תאי מקור). גישה זו למחקר של רקמות האוזן הפנימית...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבודד תאים חיוביים ל-lax Z מהשבלול של עכבר רך-גס באמצעות ציטומטריית זרימה. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד מספר רב של שבלולים של עכברים בפרק זמן קצר יחסית כדי לשמור על חיוניות התאים ולהבטיח כמות מספקת של רקמה התחלתית. כשלב שני, התאים החיוביים ל-LAX Z מופרדים ואז מסומנים כדי להכין את הרקמה למיון.לאחר מכן התאים מופרדים באמצעות ציטומטריה של זרימה. את אוכלוסיות ה-LAX Z high וה-lax low המתקבלות ניתן להשתמש בהן לניסויים נוספים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום חקר האוזן, כגון מהם פרופילי הגנים או אוכלוסיות התאים הספציפיות בתוך האוזן הפנימית.את הפרוצדורה תדגים Taha Gen, סטודנטית לרפואה מהמעבדה שלנו. ראשית, מלאו צלחות פטרי של 35 מילימטר ב-HBSS והניחו אותן על גוש קרח. לאחר מכן, השתמשו במספרי איריס כדי לבצע עריפת ראש ל-12 עד 15 עכברים postnatal בני 0 עד 3 ימים, מהזן axon, two laxy reporter ומהזן wild type, לאחר שהורדמו.הניחו את הראשים בתוך צלחת פטרי של 60 מילימטר על גבי בלוק קרח. לאחר מכן, השתמשו בפינצטת Dumont מספר 5 ובמספרי איריס כדי להסיר את הלסת התחתונה ואת הלשון מהראשים, ואז גזרו את בסיס הגולגולת בגובה החיך. כעת הסירו את העור המכסה את הקהה (calvar) וחתכו את בסיס הגולגולת על ידי הכנסת המספריים מהחלק התחתון של ה-foramen magnum ועד למרכז החיך.בצ

isolating-lacz-expressing-cells-from-mouse-inner-ear-tissues-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

בעקבות זיהום ויראלי, הכליות מטפחות מספר גדול יחסית של תאי CD8+ T ומציעות הזדמנות לחקור תאי TRM שאינם ריר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד לימפוציטים כליות העכבר לניתוח ציטומטריה זרימה.

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&amp;RUN).

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

כדי לחקור את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות, גישה נפוצה אחת היא לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון. כאן, שני פרוטוקולים פשוטים ויעילים ניתנים לבידוד תאי מערכת החיסון מרקמת המוח וממח עצם הגולגולת.

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

למד לבודד תאים מבטאי LacZ מרקמות האוזן הפנימית של עכברים ניאונטליים באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת ניתוח פרופילי גנים באוכלוסיות תאים ספציפיות באוזן.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

גלה סרטונים נוספים