בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבודד תאים חיוביים Z רופפים משבלול העכבר היילוד באמצעות ציטומטריית זרימה. זה מושג על ידי בידוד מספר רב של שבלול עכברים במסגרת זמן קצרה יחסית כדי לשמור על התאים ברי קיימא ולקבל רקמת התחלה מספקת. כשלב שני, התאים החיוביים ל-LAX Z מפורקים ולאחר מכן מסומנים כדי להכין את הרקמה למיון.

לאחר מכן התאים ממוינים לפי ציטומטריית זרימה. לאחר מכן ניתן להשתמש באוכלוסיות הגבוהות והנמוכות של LAX Z המתקבלות לניסויים נוספים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר האוזן, כגון מהם פרופילי הגנים או אוכלוסיות התאים הספציפיות בתוך האוזן הפנימית.

מי שידגים את ההליך יהיה סטודנט לרפואה Taha Gen A מהמעבדה שלנו. ראשית, מלאו צלחות פטרי בגודל 35 מילימטר ב-HBSS והניחו אותן על גוש קרח. לאחר מכן לאחר שימוש במספריים לקשתית כדי לערוף את ראשיהם של 12 עד 15, המתת חסד לאחר הלידה, אקסון בן אפס עד שלושה ימים, שני כתבים רפויים ועכברים מסוג בר.

מניחים את הראשים על צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר על גוש קרח. לאחר מכן, השתמש במלקחיים מספר חמש של דומונט ובמספריים של הקשתית כדי להוציא את הלסת התחתונה והלשון מהראשים, ולאחר מכן לחתוך את בסיס הגולגולת בגובה הפלטה שלו. כעת הסר את העור המכסה של הגולגולת וחצה את בסיס הגולגולת על ידי החדרת המספריים בחלק התחתון של הנקב מגנום לאמצע החיך.

בצע חתך נוסף עם המספריים מהקצה החתוך של החך ועד להיבט העליון של השוק משני הצדדים. נזהר לא לפגוע בקפסולה האוטית. לאחר מכן השלם את בידוד העצם הטמפורלית על ידי ביצוע חתכים בזווית של 2 45 מעלות, החל מההיבט העליון של המסגרת והמגנום המשתרע עד לחתך העטרה בחיך הקשה.

לאחר מכן הניחו את העצמות הטמפורליות המבודדות לתוך צלחות פטרי בגודל 35 מילימטר המכילות HBSS על גוש הקרח והעבירו את גוש הקרח למכסה מנוע סטרילי. לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי נוספת של 35 מילימטר הפעם ב-PBS והניחו אותה על גוש הקרח. שימוש בשני מלקחיים מספר 55.

התחל את המיקרודיסקציה על ידי הסרה עדינה של קליפת המוח, גזע המוח והמוח הקטן מהעצם הטמפורלית המכסה את הקפסולה האוטית. לאחר מכן, מבלי להסיר את הקפסולה האוטית, שבב חלקים מקפסולת השבלול החל בכניסה לעצב השבלול הווסטיבולרי וממשיך לתוך הקפסולה האוטית. לאחר חשיפת בסיס השבלול, משוך בעדינות החוצה את איבר הקורטי והרקמות שמסביב.

לאחר מכן, החל מהבסיס, הסר את כל הגנגליון הספירלי והסטריא שנותרו והעביר את השבלול לצלחת פטרי מלאה בפיפטה הראשונה של PBS. 50 מיקרוליטר PBS סטרילי למרכז באר אחת עד שתיים של צלחת תרבית שש בארות לא מצופה. לאחר מכן העבירו לא יותר מ -20 אקסין, שני שבלול רפוי לכל טיפה של PBS.

לאחר מכן יש לחמם 50 מיקרוליטר של 0.125% טריפסין למשך כשתי דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. ואז מוסיפים את הטריפסין לשבלול. מקפידים לא לנער את המנה.

דגרו על השבלול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שמונה דקות. סיים את הטריפסין על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מעכב טריפסין פולי סויה לכל טיפה, ולאחר מכן הוסף עוד 50 מיקרוליטר של מדיה מלאה לאחר הגדרת איש פיפטה P 200 ל-125 מיקרוליטר. השתמש בקצה פיפטה קהה של 300 מיקרוליטר כדי לכווץ בעדינות את התאים 80 פעמים והיזהר לא ליצור בועות.

לאחר מכן, לאחר ניסיון של כל טיפה, הוסף 200 מיקרוליטר נוספים של מדיה מלאה לכל אחת. ובכן, כעת העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לבאר חדשה. בתוך אותה צלחת שש בארות ולאחר מכן להעביר את התאים מכל באר לצינורות פקס סטנדרטיים בודדים.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תאים מסוג בר לכל אחד משלושת הצינורות, ולאחר מכן דילול עם 300 מיקרוליטר של מדיה מלאה עבור ה-CUG בלבד. בקרה מדללת 10 מיקרוליטר אקסון, שני תאי LAX Z ב-390 מיקרוליטר של מדיה מלאה. העבירו את האקסון הנותר שני תאי Z רפויים לצינורות פקס ב-400 מיקרוליטר OTs.

לאחר מכן לאחר דגירה של הצינורות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, הוסף 200 מיקרוליטר של CUG מדולל לכל צינור פקס מתאים. לאחר מכן, תוך הגנה על כל הצינורות מפני אור, דגרו על התאים באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות. לצורך הצביעה בזמן הדגירה של התאים, הניחו 10 מיליליטר של ערימות טריות שהוכנו בתוספת FBS בצינור של 15 מיליליטר והניחו את הצינור על קרח.

לאחר מכן הוסף 1.8 מיליליטר של תמיסת ערימת הקור כקרח לכל אחד מצינורות הפקס מתחת למכסה המנוע הסטרילי כשהאורות כבויים כדי למזער את החשיפה לאור. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ב-1200 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הכדורים ב -300 מיקרוליטר של מדיה מלאה.

אגד את כל הנקודות עבור דגימת המיון, ולאחר מכן הוסף פרופידיום יודיד לכל שפופרת מתאימה לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. לבסוף, לאחר כיסוי התאים, שוב הניחו אותם על קרח. הגדר את שערי המיון על ידי איסוף תחילה של 1000 אירועים של תאים מסוג פרא לא מוכתמים כדי לקבוע את התפלגות התאים בתרשים הפיזור קדימה לעומת הצד.

התאם את פרמטרי הפיזור קדימה וצדדית לפי הצורך. לאחר מכן מפצים עם סוג פרא לא מוכתם מסוג PI מוכתם ואקסון מוכתם CUG. שני תאי LAX Z.

מלא שני צינורות פקס ב-500 מיקרוליטר של מדיה מלאה. לאחר מכן התחל את הניתוח עם הסוג הפראי מוכתם PI ואקסון שני תאים מוכתמים Lae CUG כדי לא לכלול פסולת המבוססת על עלילת הפיזור קדימה לעומת הצד. אל תכלול כפולות וגושים באמצעות גובה הפיזור קדימה לעומת תרשים אזור פיזור קדימה.

לאחר מכן אל תכלול תאים מתים חיוביים PI על סמך אזור הפיזור הקדמי לעומת תרשים האזור החמישי של PE sci. עבור כל מיקום הליכה, הגדר עלילה של אזור פיזור קדימה לעומת מפל או אזור כחול פסיפי. נתח 10,000 אירועים מצינור דגימת המיון המכיל אקסון, שני תאים מוכתמים PI ו-CUG רפויים באמצעות כל השערים שהוגדרו עם תאים מסוג הבר באמצעות עלילות מתאי הסוג הפראי.

צור שערים עבור תאים גבוהים בצבע כחול מדורג, שהם פחות מ- 1% ממספר האירועים הכולל. מפל השערים הגבוהים הכחולים אמור להכיל כעת כ-15 עד 20% מהתאים בדגימת ה-Axon Two Laxy. הפיכת האקסונים הללו לשני תאים גבוהים באמצעות תרשים ניתוח שני תאים רפויים של אקסון יוצרים כעת שער לשפעת הנמוכה ביותר, 15 עד 20% מהתאים באמצעות אסטרטגיית השער שהוזכרה לעיל.

מיין את התאים לצינורות הפקס המכילים מדיה מלאה, ושמור את צינורות האיסוף בתא מקורר לארבע מעלות צלזיוס במהלך המיון. רשום את מספר התאים שנספרו על ידי ציטומטר הזרימה עבור כל אוכלוסייה בשני האיורים הללו. אזורי הפיזור הצדדיים לעומת אזורי הפיזור הקדמיים של הטיפוס הפראי המנותק משמאל ואקסון שני LA Z מימין.

תאי שבלול מוצגים. שימו לב לשער של קבוצות נפרדות של אירועים בגודל גדול בהרבה מאותם אירועים הקרובים יותר לציר Y המוגדרים כאוכלוסיית הפסולת השלילית. בדרך כלל 40 עד 45% תאים נטולי פסולת מתאוששים הן מסוג בר והן משני שבלול LAX Z בשני הפאנלים הללו.

גובה הפיזור קדימה לעומת אזור הפיזור הקדמי משמש להוצאת כפילות מהפסולת המגודרת בעבר. אירועי אוכלוסייה שליליים החורגים מהאופי הליניארי הצפוי של העלילה אינם נכללים. הכנה זו מניבה בדרך כלל 71.1% אירועים בתוך השער המיועד. הנה.

Propidium iodide כפי שזוהה על ידי ערוץ PE SCI חמש, משמש להוצאת תאים מתים כפי שנצפה בעלילות פיזור אלה. כ-95% מהתאים הממוינים היו ברי קיימא ולא קלטו PI PI בפאנלים אלה. הערוץ הכחול Cascade שימש לזיהוי המצע הפלואורסצנטי CUG כפי שניתן לראות באיור מימין.

בממוצע, התאים החיוביים העליונים של כ-20% CUG הם תאים גבוהים הקשורים לכ-15,000 אקסונים, שני תאים גבוהים לכל 10 עד 12 בעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ולבודד תאים גבוהים רפויים באמצעות ציטומטריית זרימה מרקמות האוזן הפנימית הן עבור ניסויי טיורינג תאים והן עבור ניסויים כגון פרופיל גנים.