הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש במערכי בדיקה בעלי תוכן גבוה (high content assays) במודלים תאיים של מחלות, כדי לכמת מסלולים המושפעים ממחלות ניווניות של מערכת העצבים. כדי להשיג זאת, מודל תאי של הפנוטיפ של המחלה מוחדר למערכת אוטומטית לתרבית תאים, והתאים מדגרים עד להגעה למספר התאים הנדרש. לאחר מכן התאים מפולטים, נספרים ומועברים ללוחיות 96 בארות המכילות לנטי-וירוס המבטא SH RNAs שונים.

לאחר שישה ימים של דיפרנציאציה תאית, מוצאים את התאים מהמערכת לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית ודימיון בעל תוכן גבוה (high content imaging). לבסוף, התמונות מנותחות באמצעות מגוון אלגוריתמי ניתוח כדי לכמת מאפיינים הקשורים לבריאות התא, צמיחה של נבטים עצביים ותפקוד מיטוכונדריאלי.

התוצאות מנותחות גם באמצעות ANOVA דו-כיווני כדי לזהות השפעות אינטראקציה משמעותיות. שיטה זו יכולה להאיץ את המענה לשאלות מפתח בנוגע לתפקוד של גנים הקשורים למחלה ולמסלולים שבהם הם פועלים באופן כללי. הדבר יוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים הפתוגניים המעורבים במחלות נוירודגנרטיביות.

כדי להתחיל בתהליך תרבית התאים, הכין את המערכת האוטומטית לתרבית תאים להכנסת צלחות תרבית תאים. טען למערכת חומרים מתכלים כגון טיפים לפיפט, צלחות תרבית תאים וצלחות בדיקה (assay plates). כמו כן, ודא ידנית כי קיימות במערכת כמויות מספיקות של מצע לתרבית תאים, PBS וטריפסין.

זריעו שתי פלטות omni tray עם 2×10⁶ תאים לכל פלטה של קו תאי הנוירובלסטומה SH SY five Y. תחזקו את התאים במצע אופטימלי עם 10% fetal bovine serum FBS והניחו את הפלטות על מדף הקלט ברובוט לתרבית תאים. באמצעות ממשק המשתמש הגרפי (gui), בחרו בפרוטוקול לתרבית תאים הדבקים (adherent cell culture protocol) והתאימו את קבצי הפרמטרים הספציפיים לקו התאים ההדבקים כך שסף ההצפיפות (confluence threshold) יוגדר על 70%.

זמן האיזון הכולל הוא שתי דקות. הנחה את המערכת להכין לוחיות omni tray חדשות עם מספר תאים של 2×10⁶ תאים ללוחית. הנחה את המערכת להכין ארבע לוחיות בדיקה לכל לוחית omni tray, עם סך של 5,000 תאים לבאר. דגרי את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2.

השלבים הבאים כלולים בפרוטוקול זה לתרבית תאים הדבקים (Adherence cell culture). הפלטות מדגירות ומצולמות עד שהתאים מגיעים לסף התלכדות (confluence) שהוגדר מראש. אם התאים אינם מגיעים לסף התלכדות תוך חמש קריאות, הפלטות מוסרות מהמערכת.

עם הגעה לסף ההיתוך (confluence) שהגדיר המשתמש, התאים נשטפים, עוברים טריפסינציה ונספרים. מספר מוגדר מראש של תאים מוסף ללוחיות omni trait חדשות, ובמידה ויש מספר מספיק של תאים, מספר מוגדר של לוחות בדיקה מועבר לסיפון (deck) ומספר מוגדר של תאים מוקצה לכל באר. לבסוף, ניתן לדגום את לוחות הבדיקה ישירות באמצעות המיקרוסקופ המובנה או להוציאם מהמערכת לעיבוד נוסף כדי להתחיל את ההליך לייצור נגיפים.

יש להחדיר למצע LB המכיל ampicillin מנות מאגר גליצרול של חיידקים המכילים את וקטורי ה-HRNA ולגדל אותם למשך לילה. למחרת, יש לסובב את התאים בצנטריפוגה ולהסיר את הנוזל העליון. את הפלסמידים יש להפיק באמצעות מערכת Wizard Magnus לטיהור פלסמידים מתאים. את ה-E EIT הסופי המכיל DNA פלסמידי אוספים לפלטות של 96 בארות. ה-S-H-R-N-A lentivirus מופק באמצעות RNAi consortium, ייצור לנטי-ויראלי בפלטות של 96 בארות. יש לבצע את כל הניסויים במעבדה ברמת בטיחות ML two או BSL two, ויש לבצע דקונטמינציה לכל הרכיבים והחומרים המתכלים שנעשה בהם שימוש באמצעות 30% chlorine לאחר השימוש.

ההליך לייצור לנטיווירס לא יודגם בסרטון זה, אך הוא נמשך ארבעה ימים וכולל את השלבים הבאים. ראשית, תאי האריזה נזרעים ביום אפס. למחרת, ביום הראשון, תאי האריזה עוברים טרנספקציה עם שלושה פלסמידים של לנטיווירס 18 שעות לאחר הטרנספקציה.

ביום השני, המצע מוחלף במצע טרי עם ריכוז גבוה של BSA או ריכוז גבוה של סרום. 24 שעות לאחר החלפת המצע, ביום השלישי, הנגיף נאסף והמצע מוחלף שוב במצע טרי עם ריכוז גבוה של BSA או ריכוז גבוה של סרום.

לבסוף, 24 שעות לאחר קציר הנגיף הראשון, ביום הרביעי, קוצרים את הנגיף שוב ואת תאי האריזה משליכים כדי לחשב את ריבוי הזיהום או ה-MOI של הלנטי-נגיף. מבצעים טרנסדוקציה לתאי SHSY 5Y באמצעות דילולים סדרתיים של הנגיף ומדגירים את התאים ב-37 °C, למשך 72 שעות לאחר הטרנסדוקציה. בוחנים את ביטוי ה-GFP תחת מיקרוסקופ וקובעים את אחוז התאים החיוביים ל-GFP. זורעים lentivirus SHRNA על פלטות בדיקה ב-MOI של 3. לאחר זריעת ה-lentivirus SHRNA על פלטות הבדיקה, טוענים את הפלטות למערכת תרבית התאים האוטומטית לצורך טרנסדוקציה לנטי-נגיפית.

לאחר 24 שעות, יש להחליף את המצע בלוחיות הבדיקה למצע אופטימלי המכיל 0.5%FBS ו-0.1 micromolar של retinoic acid. כדי להתחיל את תהליך הדיפרנציאציה, יש להמשיך את הדגירה של לוחות הבדיקה במצע הדיפרנציאציה למשך חמישה ימים כדי להבטיח knockdown מקסימלי של ביטוי הגן מטרה ביום החמישי; ביום השישי, יש להוסיף H2O למחצית מלוחיות הבדיקה למשך 24 שעות כדי לעודד את התעתוק של חלבון DJ one למיטוכונדריה. יש להוסיף MIT tracker לתאים בריכוז סופי של 200 nano molar לבאר ולדגור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות.

לאחר מכן, ניתן להעביר את הפלטות למסרק ה-high content או ה-HC לצילום. לחלופין, ניתן להוציא את הפלטות מהמערכת לעיבוד נוסף, כגון צביעה אימונוהיסטוכימית. לצילום high content, יצולמו בסך הכל 30 שדות לכל באר באמצעות עדשה עם הגדלה של 20x, כאשר המיטוכונדריה תדומיין עם סט הפילטרים DJ one, beta three tubulin עם סט הפילטרים trixy, וגרעיני התאים עם סט הפילטרים S five וסט הפילטרים UV.

אלו הן דוגמאות לתמונות מורכבות של תאים שהושגו באמצעות דימות בעל תוכן גבוה (high content imaging). בתמונה 3, תאים שאינם מטופלים מוצגים בפאנל A, ותאים שטופלו ב-H2O two מוצגים בפאנל B. DJ one מסומן בירוק, מיטוכונדריה באדום וגרעינים בכחול. כדי לקבוע את מקדם החפיפה הממוצע בין DJ one למיטוכונדריה, נתחו את התמונות באמצעות אפליקציית colocalization bio.

הגדירו אזורי עניין (ROIs). הגדירו את ה-ROI באופן הבא: ROIA עבור הגרעין, איור 4 A ו-E, ו-ROIB עבור המיטוכונדריה, איור 4 B ו-F; השרירו את ROIA מתוך ROIB. כדי להבטיח ניתוח של הציטופלזמה בלבד, הגדירו את המיטוכונדריה כאזור מטרה 1 ואת DJ1 כאזור מטרה 2, איור 4 C ו-G. נתחו את התמונות באמצעות אפליקציית הביו לניתוח מדורי (compartmental analysis) כדי לקבוע את העוצמה הממוצעת של אות ה-MIT tracker בתוך המיטוכונדריה.

איור ארבע B ו-F לעקיבה אחר האורכים הממוצעים של הנווריטים מהצביעה של beta three tubulin. נתחו את התמונות באמצעות אפליקציית הביו neuronal profiling איור ארבע D ו-H, ולאחר מכן את לוחות התמונות באמצעות ה-opera lx. קורא קונפוקאלי אוטומטי.

בצעו הדמיה של המיטוכונדריה באמצעות לייזר 561 nanometer ושל הגרעינים באמצעות תמונת עירור UV. דגמו סך של 30 שדות לכל באר באמצעות עדשה אובייקטיבית 60x עם טבילה במים. לבסוף, נתחו את התמונות באמצעות אלגוריתם מאפייני הטקסטורה spot edge ridge או SER.

מסנן ה-SER ridge מעביר עוצמה בפיקסלים היוצרים תבניות דמויות רכסים. ככל שהמיטוכונדריה מקטעת יותר, כך ציון ה-SER ridge גבוה יותר. בסרטון זה, נעשה שימוש בבדיקות תוכן גבוה (HC assays) כדי לזהות מודולטורים עבור חלבון DJ-1, שהיעדרותו גורמת למחלת פרקינסון אוטוזומלית רצסיבית.

תוצאה מייצגת ראשונה זו ממחישה אינטראקציה אפיסטטית עם DJ one. תרשים העמודות משמאל מציג יחידות פלואורסצנציה מנורמלות והתמונות מימין מציגות תאי SHSY five Y המסומנים באדום עם mito tracker לצורך כימות חיוניות התאים.

נצפתה ירידה גדולה יותר בחיוניות התאים בעקבות knockdown של DJ one בתאים שנחשפו לרעלן, בהשוואה לתאים שהודאו בlentivirus מסוג scrambled. ל-knockdown של הגן מטרה A הייתה השפעה דומה לזו שנצפתה בתאים עם knockdown של DJ one. עם זאת, knockdown של DJ one ושל הגן מטרה A יחד הוביל לאובדן חיוניות תאים משמעותית גבוה יותר מאשר אובדן של כל אחד מהגנים לבדו, דבר המצביע על אינטראקציה אפיסטטית בין DJ one לבין הגן מטרה A. הדוגמה הבאה היא של גן המווסת את הטרנסלוקציה של DJ one.

תרשים העמודות מציג את מקדם החפיפה המנורמל בין DJ one למיטוכונדריה, המשקף את התעתוק של DJ one מהציטופלזמה למיטוכונדריה. פאנלים A עד D הם תמונות של תאי SHSY five Y המסומנים בירוק עבור DJ one, באדום עבור מיטוכונדריה ובכחול עבור גרעינים. כאשר תאים נחשפים לרעלן, DJ one עובר תעתוק מהציטופלזמה למיטוכונדריה, דבר הנמדד באמצעות מקדם חפיפה גבוה יותר בין DJ one למיטוכונדריה.

בתאים שבהם הגן המטרה B הושHתק באופן חלקי, DJ one עובר למיטוכונדריה כאשר התאים נחשפים לרעלן; דבר זה מרמז כי הגן המטרה B מעורב בהובלת DJ one למיטוכונדריה. דוגמה לגן המעורב בצמיחה עצבית מוצגת כאן. אורכי נוריטים מנורמלים מוצגים בגרף העמודות, והתאים ששימשו לכימות אורכי הנוריטים מוצגים בתמונות, כאשר beta three tubulin מסומן בירוק וגרעינים בכחול.

השבשת הגן המטרה C בתאי SHSY five Y מסוג בר (wild type) גורמת לעלייה משמעותית באורך הנויריטים בהשוואה לתאים שהודבקו בלנטי-וירוס המבטא shRNA scrambled. אפקט זה נעלם בתאים שדגרו עם רעלן. לבסוף, תוצאות אלה מציגות דוגמה לגן המעורב במורפולוגיה של המיטוכונדריה.

בגרף מוצגים ערכי סגמנטציה ממוצעים של רכסי ה-SER המיטוכונדריאליים עבור תאי SHSY five Y שהודבקו ב-scrambled HRNA או ב-A-S-H-R-N-A המכוון לגן D. תמונה A ותמונה C הן תמונות מורכבות של תאי SHSY five Y שהודבקו ב-scrambled HRNA או ב-A-H-R-N-A המכוון לגן D, בהתאמה. המיטוכונדריה צבועות באדום בעוד שהגרעינים צבועים בכחול.

תמונות B ו-D הן ויזואליזציות של כימות רכס ה-SER כפי שנצפה כאן. הדבקה של תאי SHSY five Y מסוג בר (wild type) ב-HRNA המכוון לגן D גורמת לעלייה בערך הסגמנטציה של רכס ה-SER המיטוכונדריאלי בהשוואה לתאים שהודבקו בלנטי-וירוס scrambled. גישה זו יכולה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הניורודגנרציה לחקור ולתעד את המסלולים המעורבים בפתוגנזה של המחלה באופן יעיל ומהיר.

דבר זה יוביל להמשך למטרות טובות יותר לפיתוח טיפולי.