שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד את ההשפעה של השדות החשמליים המופעלים על נדידת תאי אב עצביים בתרבית דו-ממדית ובמודלים תלת-ממדיים ex vivo. זה מושג על ידי בידוד והרחבה של תאי אב עצביים של נוירונים במבחנה. השלב השני הוא הכנת תרחיף תא בודד של תאי אב עצביים.

לאחר מכן, להכנת תרבית דו-ממדית, תאי אב עצביים מצופים בתאי אלקטרו טקטיים מעוצבים בהתאמה אישית. לחלופין, להכנת מודל ex vivo תלת מימדי, תאי אב עצביים מסומנים עם ווים 3, 3, 3, 4, 2, ומוזרקים למודל אורגנוטיפי של פרוסת חוט השדרה. בסופו של דבר, שדה חשמלי מופעל על תאי האלקטרו ורישום זמן-lapse מתבצע כדי להראות שתאי אב נודדים לעבר הקתודה של השדה החשמלי בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות כאחד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה חדשה למעקב חי אחר נדידה המושרה על ידי שדה חשמלי של תאים בודדים לאחר השתלה למודל אורגנוטיפי תלת מימדי, הדומה מאוד לסביבה הטבעית. שיטה זו יכולה לא רק לספק כניסה לטכניקה האלקטרו, נדידה של תאים נוירו-אנטליים המושתלים בפרוסת חוט השדרה, אלא יכולה להיות מיושמת גם על מערכות אחרות שכמו מודלים של פרוסות מוח קטנות. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו רצועות זכוכית בגודל 22 על 11 מילימטר על ידי חלוקת החיטוי 22 על 22 מילימטר.

כיסוי בעובי מספר אחד מחליק לשניים באמצעות עט יהלום. לאחר מכן, צור באר זכוכית עצמאית במידות פנים, 22 על 10 מילימטרים על ידי הדבקה אנכית של ארבעה רצועות עומדות 22 על 11 מילימטר יחד עם שומן סיליקון ואקום גבוה, מאפשרים לבאר להתייבש לחלוטין ולהתקשות בן לילה. למחרת, חבר 2 רצועות זכוכית בגודל 22 על 11 מילימטר במקביל זו לזו, והשאיר פער של 10 מילימטרים לבסיס צלחת תרבות של 100 מילימטר באמצעות שומן סיליקון.

לאחר מכן אטום את האזור בין הרצועות הללו על ידי הצמדת החלקת כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר עם שומן סיליקון. הנח את הזכוכית היטב על החלקות הכיסוי כך שהקירות הפנימיים ייצרו חלל סגור לזריעת התאים. אטום למים את כל המפרקים בשומן סיליקון.

מצפים את האזור המוגבל הזה ברצף בפולי דה ליצין, ואחריו למינין כפי שמתואר בכתב היד הנלווה. בהליך זה, השיגו את המוחות מעכברי E 14 עד E 16 והניחו אותם בתווך בסיסי קר D-M-E-M-F 12. לאחר מכן, הסר את קרומי המוח תחת מיקרוסקופ אנטומי.

לאחר מכן, העבירו את המוח לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר. השתמש במלקחיים העדינים כדי לפרק את המוח לשברי רקמות. לאחר מכן העבירו אותם לצנטריפוגה של צינור 15 מיליליטר.

הדגימות ב-800 סל"ד למשך שלוש דקות להסרת פסולת D. לאחר מכן, A-D-M-E-M-F 12 המכיל BFDF ו-DGF לדגימות. טריטראט אכל אותם עם פיפטה של מיליליטר.

לאחר מכן השג את מתלה התא היחיד בעזרת מסננת תאים. צלחת את התאים לתוך הצלוחיות ב-20,000 עד 50,000 תאים למיליליטר. לאחר מכן בצע שינוי מדיום מלא כל שלושה ימים, הכולל צנטריפוגה של התאים ב-1,300 סל"ד למשך חמש דקות.

השלכת ה-Resus הסופי, השעיית ה-PT במדיום טרי והחזרת התאים לבקבוק התאים כל שישה ימים לאחר חמש ימים לפחות. העבירו את ה-NEUROSPHERES לצנטריפוגה של 15 מיליליטר ב-1,500 סל"ד למשך חמש דקות. השליכו את הספינאט.

השעו מחדש את הגלולה בנסיעות ב-EDTA כדי לייצר תרחיף תא בודד. לפני ביצוע ספירת תאים, הכינו מיליליטר אחד של תרחיף המכיל 10,000 תאים. לאחר מכן, הוציאו היטב את הלמינין מהכוס והניחו לו להתייבש לחלוטין.

החלף אותו במיליליטר אחד של תרחיף תאים. לאחר מכן, הניחו את המנה בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות כדי לאפשר התקשרויות. לאחר שהתאים משתלבים מספיק, הסר את המדיום מהתא.

הסר בזהירות את הזכוכית. ובכן, אז צרו גג מעל התאים על ידי הצמדה בזהירות של כיסוי זכוכית חיטוי בגודל 22 על 22 מילימטר, החלקה בין 2, 22 על 11 רצועות עם שומן סיליקון. זכור לכסות את התאים בכמה טיפות מדיום כדי למנוע התייבשות.

לאחר מכן צרו מאגר בינוני מבודד בכל קצה החדר על ידי יצירת שני מחסומי שומן סיליקון אטומים למים העוברים מקצה אחד של המנה לקצה השני. מלאו את החדר במדיום טרי, והבטיחו זרימה ממאגר בינוני אחד למשנהו. לאחר מכן, החזירו את המנה לחממה למשך 12 שעות כדי לאפשר התאוששות תאים.

בשלב הבא, הכינו מכסה לכיסוי הכלי על ידי קידוח שני חורים, אחד ממוקם מעל כל מאגר של תא הנדידה. לאחר מכן החלף את המדיום בתא במדיום מתורבת המכיל מאגר היפי של 25 מילימטר. לאחר מכן, העבירו את המנה למערכת ההדמיה המבוקרת בטמפרטורה.

הגדר את הפרמטרים הניסיוניים עבור זמן-lapse והקלטה מרובת מיקומים. יישר את החדר כך שהקתודה והאנודה יהיו משמאל וימין בהתאמה כדי להבטיח שווקטור השדה החשמלי יפעל אופקית כפי שנראה במיקרוסקופ ונרשם במערכת ההדמיה. לאחר מכן, מלאו שתי כוסות.

עם הפתרון של שטיינברג. חברו נפרדת לכל מאגר בינוני באמצעות גשרי זכוכית שהוכנו מראש במילוי תמיסת אגר 2% של שטיינברג. לאחר מכן הנח את אלקטרודות הכסף המחוברות לאספקת חשמל DC לתמיסת שטיינברג.

בכל, הגדר את חוגת המתח בספק הכוח לאפס והפעל אותה. מדוד את המתח על פני תא הטקטיקה החשמלית עם מד מתח תוך כדי הגברת חוגת המתח. לאחר מכן התאם את המתח כך שיתאים לדרישות הניסוי.

לאחר מכן, התחל את הקלטת זמן-lapse. בצע שינוי בינוני והתאם מחדש את המתח לפי הצורך. בכל שעה ניתן להוסיף למאגרים תרופות טריות, בינוניות או חומרים כימיים לפי הצורך.

בעזרת חורים נוספים שנקדחו במכסה צלחת התרבות, אחד הממוקם מעל כל מאגר בינוני. בשלב זה, נתחו את חוט השדרה המותני של עכברים בני שבועיים. לאחר מכן פורסים את חוט השדרה למקטעים בעובי 500 מיקרון בעזרת קוצץ רקמות מאצ'ל תחת מיקרוסקופ אנטומי.

הפרד את הפרוסות ובחר את אלה עם מבנה חוט שדרה צירי סגיטלי שלם. לאחר מכן, צלחת את הפרוסות בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר המכילה 30 מיקרוליטר MA ג'ל. מקם אותם קרוב ככל האפשר למרכז.

שמור אותם בחממת פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. כדי שחלבוני ג'ל המאטרי יתאספו בעצמם, כדי לייצר סרט דק המכסה את פני פרוסות חוט השדרה, חשוב מאוד שג'ל המטרי יורכב לחלוטין. דגרו את צלחת הפטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות במידת הצורך, ואז הוסיפו ארבעה עד שישה מיליליטר של מדיום D-M-E-M-F 12 המכיל 25 מילי-מולרי חיץ הייס, וסרום עגל עוברי של 15 עד 20%.

בעדינות רבה כדי למנוע זרימה בינונית ישירות על הפרוסות, וודאו שהפרוסות אינן שקועות לחלוטין במדיום, ומשאירות את פני החצילים חשופים היטב לאוויר. החלף את המדיום פעמיים בשבוע. כעת דגרו את תרחיף תאי האב העצבי במדיום עם חמישה ווים מיקרו-מולאריים.

3, 3, 3, 4, 2 למשך 30 דקות. תחת מיקרוסקופ, השתמש בצינור זכוכית נימי כדי להזריק מיקרוליטר של תרחיף לתוך פרוסת חוט השדרה. וודא לאט שצינור הזכוכית הנימי עובר דרך המטריגל ומגיע לחלק הפנימי של פרוסת חוט השדרה.

שמור את צינור הזכוכית בתוך פרוסת חוט השדרה למשך 30 שניות לפחות כדי למנוע השעיית תאים. רוצים, ואז מניחים את צלחת הפטרי המכילה את פרוסת חוט השדרה לתוך החממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5 סנט פחמן דו חמצני למשך הלילה. למחרת, בנה תא טקטי חשמלי סביב פרוסת חוט השדרה המכיל ווים 3 3 3 4 2 תאי נוירוגנזה מסומנים לפני הפעלת שדה חשמלי בגודל 500 מילי-וולט למילימטר.

כאן תאי האב העצביים מראים הגירה מכוונת מאוד לעבר הקתודה כאשר הם נחשפים לשדות החשמליים, קווים אדומים וחצים כחולים מייצגים את המסלולים וכיוון תנועת התא בהתאמה. והנה התרשים של נתיבי הנדידה המוצגים. להלן תאי האב העצביים המסומנים בקרסים 3, 3, 3, 4, 2.

הם הושתלו בפרוסת חוט השדרה האורגנוטיפית בנקודת ההתחלה של הטיפול בשדה החשמלי. לאחר שתאי האב העצביים נדדו לכיוון הקתודה במשך 2.5 שעות, הקוטביות של השדה החשמלי התהפכה. קוטביות השדה החשמלי המשתנה גרמה להיפוך חד של הציר לכיוון הקתודה החדשה.

הנה תמונה של תאי האב העצביים המושתלים בתוך פרוסת חוט השדרה. בסוף הקלטת זמן-lapse ושחזור תלת מימדי של תאי האב העצביים המושתלים בתוך פרוסת חוט השדרה מוצג כאן. מאסטר המוני.

ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים אם היא מבוצעת כראוי לאחר פיתוחה. טכניקה זו סוללת כעת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את הנדידה של תאים פרוגניים עצביים במערכות תרבית דו-ממדיות ותלת-ממדיות בתגובה וליישם על שדה חשמלי.