Name: כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: למד שיטה לניתוח תאים חיים בפלואורסצנציה כמותית של שמרים ביקוע Schizosaccharomyces pombe. חקור כיצד ארגון תת-גרעיני מושפע מתנאי גידול ומוטציות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לפרופסור Hiraoka לשליחת לנו זנים. אנו מכירים תמיכה מן גוסטפסון גוראן קרן האגודה למלחמה בסרטן שוודית (2008/939).

1. שמרים ביקוע תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אדינבורו מדיה מינימלי (EMM) ו EMM ללא ammoniumchloride (EMM-N) 8. כדי להפחית autofluorescence הפתרון גלוקוז לא צריך להיות autoclaved אלא לסנן מעוקר באמצעות 0.2 מיקרומטר לסנן והוסיף לאחר מכן לכלי התקשורת autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן שמרים תאים ביקוע גדלה טרי עם מדיה עשירה על צלחת אגר, yea 8, ב 3 מ"ל של נוזל התקשורת EMM עם גלוקוז מעוקרים הסינון. השתמש צינורות 13mL עם דחף קלות על מכסה כדי להבטיח אוורור טוב של התאים. בואו התאים לגדול על ידי רועדת להם סל"ד 225 ב 30 ° C. שמור את התאים לגדול בשלב יומן (1 X 06-02 אוקטובר 10 X 7 תאים / מ"ל) עבור 2 ימים על ידי ספירת אותם באמצעות תא שודד גופות' ואחריה דילול מתאים, כל בוקר וכל ערב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי לוודא שיש תאים בשלב מוקדם יומן, 5 X 06-01 אוקטובר 10 X 7 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לא לגווע ברעבהוא התאים חנקן במהלך מתג 20 דקות מהתקשורת EMM כדי EMM-N התקשורת. הדבר נעשה על ידי קצירת 3 מ"ל של תאים צינור 1.5 Eppendorf מ"ל בצנטריפוגה ספסל העליון בבית RCF 1.5 מקסימום כמו צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר עלולה לגרום תגובת הלחץ בשמרים ביקוע 9. השתמש בטכניקה ספינינג כפול, כלומר, ספין הראשון 2 דקות, ולאחר מכן להפעיל את הצינור Eppendorf 180 ° ו - ספין שוב עבור 1.5 RCF 2 דקות 10. זה עוזר לאסוף את כל התאים באחד גלולה בחלק התחתון של הצינור. שטפי פעם עם EMM-N ואז לפזר את גלולה EMM ב-N ו - דגירה על התאים למשך 15 דקות בקצב של 30 ° C רועדת 225 סל"ד ולאחר מכן המשך בשלב 2. לדוגמה הכנה. </li></ol> 2. לדוגמה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר 1.5 מ"ל של תאים צינור 1.5 Eppendorf מ"ל בצנטריפוגה ספסל העליון בבית RCF 1.5 מקסימום כמו צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר עלולה לגרום תגובת הלחץ בשמרים ביקוע 9. השתמש בטכניקה ספינינג כפול, meaning: הראשונה ספין 2 דקות, ולאחר מכן להפעיל את הצינור Eppendorf 180 ° ו - ספין שוב RCF 1.5 דקות 2 10. זה עוזר לאסוף את כל התאים באחד גלולה בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, אבל להשאיר 10-15 μL ו resuspend התאים בתקשורת הנותרים. לחילופין להוסיף 10 μL התקשורת טריים resuspend גלולה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש שקופיות זכוכית שקופה ומכסה זכוכית (לא 1.5). בדרך כלל אתה לא צריך לנקות אותם, אבל לוודא שהם לא מלא אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים מהמקפיא aliquot של פתרון מלאי של לקטינים 1mg/mL כי כבר מעוקרים הסינון. הפתרון לקטינים ניתן refrozen כמה פעמים. לקטינים משמש כדי לתקן את התאים שמרים על הזכוכית המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מקום μL של EMM עם גלוקוז מעוקרים לסנן על הזכוכית אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 5 μL של פתרון לקטינים בפינה של זכוכית המכסה. לאחר מכן מקום 5 μL של תרבית תאים באותה פינה, כלומר ירידה לקטינים. מערבבים ידי pipetting כמה פעמים ולאחר מכן להפיץ את התא תרבות לקטינים לערבב ברחבי זכוכית לכסות באמצעות צד ארוך של קצה פיפטה. בהתאם לצפיפות של תערובת הסלולרי שלך לעזוב הכל או להתחנף נוזל עודף בפינה הנגדית של הזכוכית המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכסה זכוכית, למעלה, עם צד אחד על הזכוכית אובייקטיבי את הצד השני על הספסל. תן זכוכית לכסות יבש קצת לכמה דקות. זה צריך להיות ממש לא יבש לגמרי, אבל זה לא צריך להיות נוזלי יותר מדי על הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכסה זכוכית עם מלאך 70 ° בקירוב מן הכוס אובייקטיבי על ידי ירידה של EMM. עזוב את מכסה הזכוכית, כך שהוא יפול מלמעלה למטה לתוך ירידה של EMM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסגור את הקצוות עם גריז סיליקון להכין מזרק 2 מ"ל. חותכים את סוף רחב של טיפ 200 μl וצרף אותו המזרק. מלאו את המזרק עם כ 1 מ"ל של שמן סיליקון. קו דק של סיליקון מוחל על הקצוות של זכוכית המכסה על ידי מוגלה בעדינותהינג את הבוכנה של המזרק. עכשיו יש לכם חדר קטן צמיחה ש pombe תאים. </li></ol> 3. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Initialise מיקרוסקופ פלואורסצנטי ידי הפעלת מנורת כספית / קסנון, את המיקרוסקופ לבין המחשב. מניחים את השמרים צמיחה קאמרית מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש אובייקטיבי או 63 X 100 X מטרה עם NA = 1.3 ומעלה. אם אובייקטיבית שמן משמש, להוסיף שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשדה בהיר כדי למצוא את התאים לקבל תמונה חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההגדרות עבור מיקרוסקופיה את הקרינה משתנות בהתאם fluorochromes המשמש תווית בתאי שמרים את המיקרוסקופ. אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal Zeiss LSM 700 לייזר מיקרוסקופ סריקה באמצעות תוכנית Apochromat-63x עדשה אובייקטיבי שמן (NA = 1.4) עם הגדרת קו 16 מטוס הממוצע סריקה. חריר צריך להיות מוגדר 1-1.1 יחידות אוורירי, אשר נותן פרוסה אופטי של 0.8 מ"מ. אנו מזהים ב-GFP מסלול 1 באמצעות הגדרת מסנן עבור Alexa 488 עם קרן splitter ב 582 ננומטר, ובכך דetecting באורכי גל שבין 488 ו - 582 ננומטר. במסלול 2 אנו משתמשים להגדיר מסנן אופטימלי mCherry באמצעות קרן splitter ב 578 ננומטר, ולכן גילוי באורכי גל שבין 578 ו - 600 ננומטר. פירוש הדבר כי מסלול 2 הן mRFP (SPB) ו NM (mCherry) יזוהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמו הרבה תמונות צריך להיות מסוגל למדוד ב -60 תאים שונים עבור כל זן. בדרך כלל 15 תמונות של שדות מיקרוסקופיה עצמאי מספיק. מומלץ קאמרית צמיחה חדשים עם תאים טריים הוא עשה, אם הזמן מיקרוסקופיה שלך עולה 60 דקות. </li></ol> 4. מדידה כמותית של המרחקים subcellular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות בתוכנית זן Edition Zeiss אור. באמצעות כלי מדידה למדוד את המרחק בין מיקרומטר fluorochromes שונים כל התאים שבו כל האותות הן במישור מוקד זהה. התאם את עוצמת התאורה ואת הניגודיות לזהות את מרכז האות ניאון. זה פרוטוקול פשוט משתמשת רק שני ג שונהolours ומכאן SPB ו NM הם באותו ערוץ. SPB היא בחרה לצאת ידי המבנה העגול הגדול שלה NM. מעבירים את המרחקים גיליון פנקס. מדוד לפחות 60 תאים. תוכניות אחרות כגון ImageJ יכול לשמש גם למדוד את המרחק, אבל אור Zeiss זן עדיפה בגלל רזולוציה גבוהה יותר של התמונה ואת הקלות כדי להתקרב ולהתרחק באמצעות תוכנית. תמונות בפורמט LSM נפתח ImageJ יהיו שני ערוצים על גבי אחד את השני. כדי ליצור תמונה עם שני הערוצים, קודם לפצל את שני ערוצי ואילך למזג אותם. לאחר מכן הכלי קו ניתן להשתמש כדי למדוד את המרחקים כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המרחקים subcellular אומר או החציוני בין זנים וטיפולים שונים באמצעות תוכנית סטטיסטית, למשל מבחן t או Mann-Whitney Test סכום דרגה, למשל באמצעות תוכנה SigmaStat-3.5. לעיתים קרובות המידע אינו מופץ בדרך כלל מאז תהיה בחירה עבור תאים עם קצרהמרחקים בין אותות ניאון מאז כל האותות צריכים להיות במישור המוקד אותו כדי להימדד. מבחן t ניתן להשתמש רק כאשר הנתונים יש התפלגות נורמלית בעוד Mann-Whitney Test סכום דרגה מאפשרת השוואה של סדרות נתונים חוסר ההתפלגות הנורמלית. במבחן-t ממוצע של שני מערכי נתונים שונים מושווים בעוד מבחן מאן ויטני-Sum דרגה החציוני בהשוואה. </li></ol> 5. נציג תוצאות מסננים PJ1185: (ח + + his7: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 לאצו] sid4-mRFP: kanMX6 cut11-mCherry: natMX6 ura4-D18 leu1-32-DN ade6 / N) היה גדל EMM . המדגם היה מכונס רכוב בתא גידול קטן צולמו התמונות (איור 1 א + N). לאחר מכן בתקשורת הצמיחה הוחלפה ammoniumchloride EMM w / o (EMM-N), ותאי היו grown במשך 15 דקות תוך כדי רעד. התאים חנקן היו מורעבים רכוב אז בתא עם צמיחה EMM-N והתמונות נלקחו (איור 1A-N). כלי המדידה היה להשתמש בהם כדי למדוד את המרחק בין מוקד (GFP) ו SPB (איור 1B ו טבלה 1). בנוסף, המרחק בין מוקד (GFP) ואת NM נמדדה (איור 1B ו טבלה 2). המרחקים subcellular חציון לפני ואחרי דלדול חנקן הושוו באמצעות תוכנה 3.5 SigmaStat (לוח 3). לא היה שינוי משמעותי סטטיסטית לוקליזציה של אשכול גנים מתרחק NM כלפי SBP. נתוני מדידת המרחק בין ה-GFP לבין SBP היתה התפלגות נורמלית ולכן המרחקים אומר (1.777 מיקרומטר + ​​N ו-N 1587 מיקרומטר) ניתן להשוות באמצעות מבחן t (טבלה 1 ו -3). לא היה הבדל משמעותי בין שני הערכים הממוצעים (P = 0.008, t-test). נתוני מדידת המרחק בין ה-GFP ו NM לא היה לי די נורמליstribution ולכן המרחקים החציוני (0 מיקרומטר + N ו - 0.390 מיקרומטר-N) הושוו באמצעות Mann-Whitney סכום דרגה הבדיקה (טבלה 2 ו -3). לא היה הבדל משמעותי בין שני הערכים החציוני (P &lt;0.001, Mann-Whitney סכום מבחן דרגה). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. לוקליזציה של אשכול גנים בשם Chr1, המסומן על ידי ה-GFP, השתנה אחרי הרעבה החנקן. (א) בטור השמאלי, + N, גרעין התא נציג מתא גדל בטור הימני EMM,-N, גרעין התא נציג מתא גדל EMM-N. הירוק הוא אות ה-GFP תיוג אשכול Chr1, אדום הוא mRFP ו mCherry תיוג SPB ו NM, בהתאמה. (ב) לגרעין התא זהה (A), אבל עכשיו עם מרחקים subnuclear נמדד; צהוב: הקוטר של גרעין התא, כחול: המרחק בין SPB ו-GFP האות ורוד: המרחק בין האות ה-GFP ואת קרום הגרעין. <pclass alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg"></pclass> <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="טבלה 1"> <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="טבלה 1"> טבלה 1. המרחקים subnuclear נמדד מיקרומטר של זן PJ1185 גדל EMM. שורה ראשונה, בקוטר של התא (ד), בשורה השנייה, המרחק בין ה-GFP לבין SPB, בשורה השלישית, המרחק בין ה-GFP לבין NM. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="טבלה 2"> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="טבלה 2"> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="טבלה 2"> טבלה 2. המרחקים subnuclear נמדד מיקרומטר של זן PJ1185 גדל EMM-N. שורה ראשונה, בקוטר של התא (ד), בשורה השנייה, המרחק בין ה-GFP לבין SPB, בשורה השלישית, המרחק בין ה-GFP לבין NM. <imgalt src='"/' files></imgalt> לוח 3. סטטיסטיקה תיאורית של מרחקים subnuclear שנצפתה זן PJ1185 לפני (+ N) ואחרי (-N) הרעבה חנקן. שורה ראשונה: מספר התא נמדד, שורה שנייה: פירוש (ד) קוטר, שורה שלישית: הקוטר החציוני (ד), ועוד שורה: כלומר המרחק בין ה-GFP ו SPB, שורה חמישית: המרחקים בין חציון GFP ו NM.

<ol><li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li>
<li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li>
<li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li>
<li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li>
<li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li>
<li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Res%22%5BJournal%5D)">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li>
<li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cut11%28%2B%29%3A+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li>
<li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li>
<li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li>
<li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li>
<li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li>
<li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagan%2C+IM+%22Fluorescence+microscopy+in+yeast%22">Fluorescence microscopy in yeast</a>. Allan, V. J. , University Press. Oxford. (2000).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li>
<li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

בעשור האחרון השימוש הדמיה תא חי כדי לפקח על אירועי הסלולר הפך יותר ויותר פופולרי. זה התחיל עם השימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק של מדוזה Aequorea ויקטוריה ועכשיו fluorochromes שונים זמינים פולטי הקרינה באמצעות ספקטרום רחב של ציאן (475 ננומטר) עד כה אדום (648 ננומטר) 11. אחד היתרונות העיקריים של הדמיה תא חי מעל immunofluorescence היא כי התאים אינם קבועים על ידי פורמלדהיד או אתנול / אצטון טיפול לפני במיקרוסקופ, ומכאן הימנעות חפצים אפשרי מתהליך קיבעון. בנוסף, הדמיה תא חי מציעה את האפשרות לעקוב אחר תאים בודדים לצלם במרווחים תכופים במהלך שעות או ימים של דגירה, כך שניתן לקבל עוד סרטים של אירועים הסלולר 12. בתאי יונקים יש את היתרון של בעל גודל גדול, עם קוטר של כ -100 מיקרומטר, לעומת תא שמרים קטנים בקוטר של 3-4 על &amp;מו: מ &#39; מצד שני, היתרון הוא עם שמרים הגנום מניפולציות בקלות. הומולוגיים רקומבינציה מתרחשת ביעילות רבה בשמרים והוא משמש הפתיל חלבונים עניין fluorochromes שונה 3. יתר על כן, באמצעות שילוב ממוקד של רצפי לאצו וביטוי הבאות של חלבון LacR-GFP מאפשר זיהוי של חלק מסוים של הגנום תוך גרעין התא 2. באמצעות ס תאים pombe במיקרוסקופ יש יתרונות נוספים שכן הם אורגניזמים unicellular טבעי לגדול עם הזמן דור מהיר בעלות נמוכה תנאי תרבית תאים. יתרה מזאת, ס &#39; pombe הוא אורגניזם מודל מצוין אוקריוטים שכן יש מטזואניים גנים הומולוגיים. אחת המגבלות העיקריות של טכניקה זו היא autofluorescence בתא שמרים להפריע לזיהוי של האות נכון. בעיה זו ניתן להתגבר באמצעות התקשורת צמיחה מינימלית עם גלוקוז מעוקרים לסנן במקום autoclaved. בתוךאת השמרים תאים בנוסף צריך להיות מבוגר עבור 2 ימים לפני שלב להיכנס גובר עליהם. הפרוטוקול המובא כאן מציע שיטה פשוטה יחסית, אך עדיין כמותי כדי לקבוע את subcellular לוקליזציה של חלבונים בתוך התא בשמרים. יתר על כן על ידי לצלם בנקודות זמן שונות נוכל לעקוב אירועים הסלולר.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> לקטינים </td><td> סיגמא </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> סיליקון גריז </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ לייזר סורק LSM 700 </td><td> Zeiss </td><td> LSM 700 </td><td> מיקרוסקופ confocal אחרים יכול לשמש. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td> כל תוכנה לניתוח סטטיסטי יכול לשמש. </td></tr></tbody></table>

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

שיטות מיקרוסקופיה קיימות מספר היום כי ניתן לזהות חלבון מסוים בתוך התא. בעשור האחרון הדמיה תא חי באמצעות fluorochromes כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מחוברת ישירות לחלבון של עניין הפך יותר ויותר פופולרי 1. בעזרת ה-GFP ו fluorochromes דומה localisations subcellular ותנועות של חלבונים ניתן להבחין מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יתר על כן, גם לוקליזציה subnuclear באזור מסוים של כרומוזום ניתן ללמוד באמצעות טכניקה זו. ה-GFP הוא התמזגו לחלבון לאק repressor (LacR) והביע ectopically בתא בו חוזר טנדם של רצף לאצו כבר מוכנס לתוך האזור של עניין על כרומוזום 2. LacR-GFP יהיה לאגד את חוזרת לאצו וכי האזור של הגנום יהיה גלוי כנקודה ירוקה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שמרים מתאים במיוחד מאז הומולוגיים עבור סוג זה של מניפולציהרקומבינציה יעילה מאוד, ובכך מאפשרת שילוב ממוקד של חוזר לאצו חלבונים מהונדסים היתוך עם GFP 3. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי של תא חי שמרים ביקוע. פרוטוקולים נוספים עבור ניתוח תא חי של שמרים ביקוע ניתן למצוא, למשל על איך לעשות סרט של 4 התנהגות meiotic כרומוזומליות. בניסוי הספציפי הזה אנחנו מתמקדים בארגון subnuclear וכיצד הוא מושפע במהלך אינדוקציה גן. יש לנו שכותרתו אשכול גנים, בשם Chr1, על ידי כניסתה של אתרי לאצו מחייב בקרבת הגנים. אשכול הגן מועשר עבור גנים המושרה מוקדם במהלך רעב חנקן של שמרים ביקוע 5. בשנת המתח בקרום הגרעין (NM) מסומן על ידי החיבור של mCherry כדי Cut11 NM חלבון והוליד אות ניאון אדום. הפולני ציר הגוף (SPB) הוא תרכובת Sid4 התמזגו חלבון פלואורסצנטי אדום (Sid4-mRFP) 6 </sלמעלה&gt;. בתאי שמרים vegetatively גדל centromeres מחוברים תמיד SPB המוטבע NM 7. SPB מזוהה כמבנה עגול גדול NM. על ידי הדמיה לפני 20 דקות לאחר דלדול של מקור חנקן אנו יכולים לקבוע את המרחק בין באשכול גנים (GFP) ואת NM / SPB. המרחקים אומר או חציון לפני ואחרי דלדול חנקן מושווים ואנחנו יכולים לכמת ולכן אם יש או אין שינוי לוקליזציה subcellular של אשכול הגנים לאחר דלדול חנקן.

שמרים הביקוע,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt;, היא מערכת מודל טובה ללמוד תהליכים תאיים בסיסיים. כאן אנו מתארים שיטה לבצע ניתוח כמותי תא חי של שמרים ביקוע. בניסוי הספציפי הזה אנחנו מתמקדים בארגון של הגנום תוך גרעין התא, אך השיטה יכולה לשמש גם כדי לחקור גורמים cytosolic.

כיום קיימות מספר טכניקות מיקרוסקופיה המסוגלות לזהות חלבון ספציפי בתוך התא. במהלך העשור האחרון, דימות תאים חיים באמצעות...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד באופן כמותי את הארגון התת-גרעיני בתאי שמרים וכיצד הוא מושפע משינויים בתנאי גידול או ממוטציות. זאת מושג על ידי גידול תאי שמרים לשלב הלוגריתמי (log phase) בתנאים שימזערו את הפלואורסצנציה העצמית. לאחר מכן, התאים מוכנסים לתא גידול לצורך צפייה תחת המיקרוסקופ.לאחר מכן מצלמים תמונות כדי למדוד את המרחק בין מבנים שונים המסומנים פלואורסצנטית בתא. התוצאות המתקבלות מראות הבדלים בארגון שאינו גרעיני, התלוי בשינוי התנאים התזונתיים במהלך גידול תרבית השמרים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה לגבי השפע ההדדי בין ארגון תת-גרעיני של הכרומטין לבין ויסות גנים.בניסוי עם דגים ושמרים, התחילו בהכנת מצע מינימלי מסוג אדינבורו (Edinburgh minimal medium) או EMM, וכן EMM עם 암monium chloride להפחתת אוטופלורסצנציה, במקום להשתמש באוטוקלאב. השתמשו במסנן של 0.2 מיקרון כדי לעקר את תמיסת הגלוקוז והוסיפו אותה למצע שעקר באוטוקלאב. זרקו תאי דגים ושמרים לתוך שלושה מיליליטר של EMM בשפופרות של 30 מיליליטר.לאחר גידול טרי על צלחת אגר במצע עשיר, YEA, סגרו קלות את המבחנות והדגירו את התאים בשייקר במהירות של 225 RPM ובטמפרטורה של 30 degrees Celsius. שמרו את התאים בשלב הלוגריתמי (log phase) למשך יומיים על ידי ספירתם באמצעות תא בירקה (birka chamber) בכל בוקר וערב, ודילולם לצפיפות המתאימה. ביום הניסוי.התאים צריכים להיות בשלב לוגי מוקדם של צמיחה במצע חנקתני. יש להפנות לפרוטוקול הכתוב לצורך איסוף התאים לכדי כפתור אחד בתחתית מבחנה לצנטריפוגה; 1.5 milliliters של תאים במבחנת eend orph ב-1.5 RCF מקסימלי, על ידי סיבוב ראשוני של המבחנה למשך שתי דקות, ולאחר מכן סיבוב של 180 מעלות עבור סיבוב נוסף של שתי דקות. יש להסיר את כל הנוזל העליון למעט 10 to 15 µL ולהשעות מחדש את התאים במצע הנותר, עם אליקווט של 1 mg/mL של לקטין שעבר סטריליזציה בסינון.הוסף 5 µL של תמיסת לקטין לפינה של זכוכית הכיסוי והוסף 5 µL של תרבית לטיפת הלקטין. כדי ליצור תא גידול של תאי בסיס של S pom, טפטף 5 µL של EMM על שקופית נקייה והפוך את זכוכית הכיסוי עם התרבית בזווית של 70 מעלות מעל המצע, והנח אותה מלמעלה כלפי מטה על ה-EMM כדי לאטום את השוליים עם גריס סיליקון. גזור את הקצה הרחב של טיפ בנפח 200 µL וחבר את הקצה הצר למזרק בנפח 2 mL.מלאו את המזרק בכמות של כ-1 מיליליטר של גריס סיליקון. מרחו קו דק של סיליקון לשולי זכוכית הכיסוי על ידי לחיצה עדינה על בוכנת המזרק כדי לאטום את תא הגידול. התחילו בשימוש במיקרוסקופיה בשדה בהיר (Brightfield Imaging) כדי לאתר את התאים ולבצע חפירה.השיגו תמונה חדה עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנו משתמשים במיקרוסקופ סריקת לייזר Zeiss LSM 700 עם עדשה אובייקטיבית plan apoch chromat 63 times oil, והגדרה של 16 line average לסריקה מישורית. הגדירו את יחידות השטח ל-1 עד 1.1 כדי לקבל פלח אופטי של 0.8 microns.סרוק את התאים באמצעות לייזרים המגלים Alexa 488 ו-mCherry או GFP. רשמו מספיק תמונות כדי לבצע מדידות ב-60 תאים עבור כל ניקוז. עברו לתא גידול חדש עם תאים טריים.לאחר 60 דקות של דימות, פתחו תמונה בתוכנת Zeen Light Edition כדי למדוד את המרחק בין אותות של פלואורופורים שונים באותו מישור מוקד. פתחו את כלי המדידות וכווןנו את עוצמת התאורה והניגודיות כדי לזהות את מרכזו של כל אות פלואורסצנטי, לדוגמה, גוף קוטב הצמיג (spindle pole body) והמעטפת הגרעינית, ומדדו את המרחק ביניהם. העבירו את הנתונים לגיליון פנקס רשימות.השוו את הממוצע או החציון של המרחקים התת-תאיים בין זנים וטיפולים שונים באמצעות תוכנה סטטיסטית או מבחנים סטטיסטיים כגון T-test או מבחן Mann-Whitney Rank sum. בדוגמה זו, זן PJ 1 18 5 גודל ב-EMM ומדגם הוכנס לתא גידול לצורך דימות. לאחר מכן, נלקחה מנה של PJ 1 18 5.התרבית הועברה ל-EMMN והודגרה למשך 15 דקות לפני שדגימה הוכנסה לתא גידול לצורך דימוג. כלי המדידה שימש למדידת המרחק בין הלוקוס לבין גוף קוטב השpulumi (spindle pole body), וכן בין הלוקוס לבין המעטפת הגרעינית. כפי שמוצג כאן, היה הבדל בעל מובהקות סטטיסטית במרחק של מקבץ הגנים בעת תזוזתו מהמעטפת הגרעינית לעבר גוף קוטב השpulumi בתאים המורעבים בחנקן בהשוואה לתאים שגדלו בנוכחות חנקן.הנתונים המודדים את המרחק בין ה-GFP ל-SBP הראו התפלגות נורמלית, ולכן ניתן היה להשוות את מרחקי הממוצע באמצעות מבחן T. נמצא הבדל מובהק בין שני ערכי הממוצע. הנתונים המודדים את המרחק בין ה-GFP ל-NM לא הראו התפלגות נורמלית, ולכן מרחקי החציונים הושוו באמצעות מבחן Mann-Whitney ranked sum.היה הבדל משמעותי בין שני ערכי החציונים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון real-time PCR, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לאופן שבו רמת ביטוי הגן נמצאת במתאם עם השינויים בארגון התת-גרעיני.

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

אנו מספקים שיטה בסיסית הניתנת לשחזור למיקרוסקופיה ארוכת טווח של מחזור החיים המיני של שמרי ביקוע. עם התאמות קלות שתוארו, הפרוטוקול המוצג מאפשר התמקדות מחקרית בשלבים שונים של תהליך הרבייה.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

כימות מדויק של אירועי סחר בשלפוחית מספק לעתים קרובות תובנות מפתח לגבי תפקידים של חלבונים ספציפיים והשפעות של מוטציות. מאמר זה מציג שיטות לשימוש ב-pHluorin סופר-אקליפטי, וריאנט GFP רגיש ל-pH, ככלי לכימות אירועים אנדוציטיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי וציטומטריית זרימה.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

שמרי הביקוע, שמר החלוקה היא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis, השלב הסופי חלוקת תא. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופ לנתח אירועים cytokinetic שונים בתאי שמרים ביקוע חי.

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת בחיי עיר הכלאה הפרוטוקול ממוטבת כדי לכמת את מספר מולקולות RNA בניצני שמרים במהלך גידול וגטטיבי, מיוזה.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

4D מיקרוסקופ של שמרים

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

למד שיטה לניתוח תאים חיים בפלואורסצנציה כמותית של שמרים ביקוע Schizosaccharomyces pombe. חקור כיצד ארגון תת-גרעיני מושפע מתנאי גידול ומוטציות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

גלה סרטונים נוספים