כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד כמותית את הארגון התת-גרעיני בתאי שמרים וכיצד הוא מושפע משינויים בתנאי הגידול או מוטציות. זה מושג על ידי גידול תאי שמרים כדי לרשום שלב בתנאים שימזערו את האוטו-פלואורסצנטיות. לאחר מכן, התאים ממוקמים בתא גידול לצפייה במיקרוסקופ.

לאחר מכן נלקחות תמונות כדי למדוד את המרחק בין מבנים שונים המסומנים פלואורסצנטית בתא. מתקבלות תוצאות המראות הבדלים בארגון הלא גרעיני, התלוי בשינוי התנאים התזונתיים במהלך גידול תרבית השמרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפי לגבי יחסי הגומלין בין ארגון סובר או כרומטין וויסות גנים.

דגי טול ושמרים מתחילים בהכנת מדיום מינימלי של אדינבורו או EMM ו-EMM עם אמוניום כלוריד כדי להפחית אוטופלואורסצנטיות ולא אוטוקלאב. השתמש במסנן של 0.2 מיקרון כדי לעקר את תמיסת הגלוקוז ולהוסיף אותה למדיית החיטוי. לחסן שלושה מיליליטר EMM בצינורות של 30 מיליליטר עם תאי דגים ושמרים.

גדל טרי על צלחת אגר במדיום העשיר, YEA מכסה קלות את הצינורות ודוגר על התאים בשייקר ב-225 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס. שמור את התאים בשלב היומן למשך יומיים על ידי ספירתם עם תא בירקה כל בוקר וערב ודילול שלהם לצפיפות המתאימה. ביום הניסוי.

התאים צריכים להיות שלב יומן מוקדם לצוות החנקן. התאים מתייחסים להליך המתואר בפרוטוקול הכתוב לאיסוף התאים בכדור אחד בתחתית צנטריפוגת צינור, 1.5 מיליליטר תאים בצינור אורף במקסימום של 1.5 RCF על ידי סיבוב הצינור למשך שתי דקות, ולאחר מכן סיבובו 180 מעלות למשך שתי דקות נוספות. הסר את כל הסופרנטנט מלבד 10 עד 15 מיקרוליטר והשהה מחדש את התאים במדיום הנותר, עם כמות של מיליגרם אחד למיליליטר מסנן לקטין מעוקר

הוסף חמישה מיקרוליטר תמיסת לקטין לפינת זכוכית הכיסוי והוסף חמישה מיקרוליטר תרבית לטיפת הלקטין. כדי ליצור תא גידול של תאי בסיס S pom, פיפטה חמישה מיקרוליטר של EMM על שקופית נקייה והפוך את זכוכית הכיסוי עם התרבית בזווית של 70 מעלות מעל המדיום והפיל אותה מלמעלה כלפי מטה על ה- EMM כדי לאטום את הקצוות בשומן סיליקון. חותכים את הקצה הרחב של קצה של 200 מיקרוליטר ומחברים את הקצה הצר למזרק של שני מיליליטר.

מלאו את המזרק בכמיליליטר אחד של שומן סיליקון. מרחו קו דק של סיליקון על קצוות זכוכית הכיסוי על ידי דחיפה עדינה של בוכנת המזרק כדי לדמות את תא הגידול. התחל בשימוש בהדמיית Brightfield כדי לאתר את התאים ולחפור.

קבל תמונה חדה למיקרוסקופיה קונפוקלית. אנו משתמשים במיקרוסקופ סריקת לייזר Zeiss LSM 700 עם כרומט אפוש תכליתי פי 63 עדשת אובייקט שמן, והגדרת סריקת מישור ממוצעת של 16 שורות. הגדר את יחידות השטח ל-1 עד 1.1 כדי לקבל פרוסה אופטית של 0.8 מיקרון.

סרוק את התאים עם לייזרים המזהים Alexa 4 88 ו-mCherry או GFP. הקלט מספיק תמונות כדי לבצע מדידות ב -60 תאים עבור כל ניקוז. עברו לתא גידול חדש עם תאים טריים.

לאחר 60 דקות של הדמיה, פתח תמונה בתוכנית Zeen Light Edition כדי למדוד את המרחק בין אותות של פלואורופורים שונים באותו מישור מוקד. פתח את כלי המדידה והתאם את עוצמת האור והניגודיות כדי לזהות את המרכז של כל אות פלורסנט, למשל, גוף מוט הציר והממברנה הגרעינית, ולמדוד את המרחק ביניהם. העבר את הנתונים לגיליון פנקס רשימות.

השווה את המרחקים התת-תאיים הממוצעים או החציוניים בין זנים וטיפולים שונים באמצעות תוכנה או בדיקות סטטיסטיות כגון מבחן T או מבחן סכום Man Whitney Rank. בזן לדוגמה זה, PJ 1 18 5 גדל ב-EMM ודגימה הוכנסה לתא גידול להדמיה. לאחר מכן ציטוט של PJ 1 18 5.

התרבית הועברה ל-EMMN והודגרה במשך 15 דקות לפני שהדגימה הוכנסה לתא גידול להדמיה. כלי המדידה שימש למדידת המרחק בין הלוקוס לגוף מוט הציר וכן בין הלוקוס לממברנה הגרעינית. כפי שמוצג כאן, היה הבדל מובהק סטטיסטית במרחק של מקבץ הגנים המתרחק מהממברנה הגרעינית לכיוון גוף קוטב הציר בתאים הרעבים לחנקן בהשוואה לתאים שגדלו בחנקן.

לנתונים שמדדו את המרחק בין ה-GFP ל-SBP הייתה התפלגות נורמלית, ומכאן שניתן היה להשוות את המרחקים הממוצעים באמצעות מבחן T. היה הבדל משמעותי בין שני הערכים הממוצעים. לנתונים שמדדו את המרחק בין GFP ל-NM לא הייתה התפלגות נורמלית, ולכן המרחקים החציוניים הושוו באמצעות מבחן סכום מדורג של גבר וויטני.

היה הבדל משמעותי בין שני הערכים החציוניים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו PCR בזמן אמת, על מנת לענות על שאלות נוספות על האופן שבו רמת ביטוי הגנים קשורה לשינויים בארגון התת-גרעיני.