כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד באופן כמותי את הארגון התת-גרעיני בתאי שמרים וכיצד הוא מושפע משינויים בתנאי גידול או ממוטציות. זאת מושג על ידי גידול תאי שמרים לשלב הלוגריתמי (log phase) בתנאים שימזערו את הפלואורסצנציה העצמית. לאחר מכן, התאים מוכנסים לתא גידול לצורך צפייה תחת המיקרוסקופ.

לאחר מכן מצלמים תמונות כדי למדוד את המרחק בין מבנים שונים המסומנים פלואורסצנטית בתא. התוצאות המתקבלות מראות הבדלים בארגון שאינו גרעיני, התלוי בשינוי התנאים התזונתיים במהלך גידול תרבית השמרים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה לגבי השפע ההדדי בין ארגון תת-גרעיני של הכרומטין לבין ויסות גנים.

בניסוי עם דגים ושמרים, התחילו בהכנת מצע מינימלי מסוג אדינבורו (Edinburgh minimal medium) או EMM, וכן EMM עם 암monium chloride להפחתת אוטופלורסצנציה, במקום להשתמש באוטוקלאב. השתמשו במסנן של 0.2 מיקרון כדי לעקר את תמיסת הגלוקוז והוסיפו אותה למצע שעקר באוטוקלאב. זרקו תאי דגים ושמרים לתוך שלושה מיליליטר של EMM בשפופרות של 30 מיליליטר.

לאחר גידול טרי על צלחת אגר במצע עשיר, YEA, סגרו קלות את המבחנות והדגירו את התאים בשייקר במהירות של 225 RPM ובטמפרטורה של 30 degrees Celsius. שמרו את התאים בשלב הלוגריתמי (log phase) למשך יומיים על ידי ספירתם באמצעות תא בירקה (birka chamber) בכל בוקר וערב, ודילולם לצפיפות המתאימה. ביום הניסוי.

התאים צריכים להיות בשלב לוגי מוקדם של צמיחה במצע חנקתני. יש להפנות לפרוטוקול הכתוב לצורך איסוף התאים לכדי כפתור אחד בתחתית מבחנה לצנטריפוגה; 1.5 milliliters של תאים במבחנת eend orph ב-1.5 RCF מקסימלי, על ידי סיבוב ראשוני של המבחנה למשך שתי דקות, ולאחר מכן סיבוב של 180 מעלות עבור סיבוב נוסף של שתי דקות. יש להסיר את כל הנוזל העליון למעט 10 to 15 µL ולהשעות מחדש את התאים במצע הנותר, עם אליקווט של 1 mg/mL של לקטין שעבר סטריליזציה בסינון.

הוסף 5 µL של תמיסת לקטין לפינה של זכוכית הכיסוי והוסף 5 µL של תרבית לטיפת הלקטין. כדי ליצור תא גידול של תאי בסיס של S pom, טפטף 5 µL של EMM על שקופית נקייה והפוך את זכוכית הכיסוי עם התרבית בזווית של 70 מעלות מעל המצע, והנח אותה מלמעלה כלפי מטה על ה-EMM כדי לאטום את השוליים עם גריס סיליקון. גזור את הקצה הרחב של טיפ בנפח 200 µL וחבר את הקצה הצר למזרק בנפח 2 mL.

מלאו את המזרק בכמות של כ-1 מיליליטר של גריס סיליקון. מרחו קו דק של סיליקון לשולי זכוכית הכיסוי על ידי לחיצה עדינה על בוכנת המזרק כדי לאטום את תא הגידול. התחילו בשימוש במיקרוסקופיה בשדה בהיר (Brightfield Imaging) כדי לאתר את התאים ולבצע חפירה.

השיגו תמונה חדה עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנו משתמשים במיקרוסקופ סריקת לייזר Zeiss LSM 700 עם עדשה אובייקטיבית plan apoch chromat 63 times oil, והגדרה של 16 line average לסריקה מישורית. הגדירו את יחידות השטח ל-1 עד 1.1 כדי לקבל פלח אופטי של 0.8 microns.

סרוק את התאים באמצעות לייזרים המגלים Alexa 488 ו-mCherry או GFP. רשמו מספיק תמונות כדי לבצע מדידות ב-60 תאים עבור כל ניקוז. עברו לתא גידול חדש עם תאים טריים.

לאחר 60 דקות של דימות, פתחו תמונה בתוכנת Zeen Light Edition כדי למדוד את המרחק בין אותות של פלואורופורים שונים באותו מישור מוקד. פתחו את כלי המדידות וכווןנו את עוצמת התאורה והניגודיות כדי לזהות את מרכזו של כל אות פלואורסצנטי, לדוגמה, גוף קוטב הצמיג (spindle pole body) והמעטפת הגרעינית, ומדדו את המרחק ביניהם. העבירו את הנתונים לגיליון פנקס רשימות.

השוו את הממוצע או החציון של המרחקים התת-תאיים בין זנים וטיפולים שונים באמצעות תוכנה סטטיסטית או מבחנים סטטיסטיים כגון T-test או מבחן Mann-Whitney Rank sum. בדוגמה זו, זן PJ 1 18 5 גודל ב-EMM ומדגם הוכנס לתא גידול לצורך דימות. לאחר מכן, נלקחה מנה של PJ 1 18 5.

התרבית הועברה ל-EMMN והודגרה למשך 15 דקות לפני שדגימה הוכנסה לתא גידול לצורך דימוג. כלי המדידה שימש למדידת המרחק בין הלוקוס לבין גוף קוטב השpulumi (spindle pole body), וכן בין הלוקוס לבין המעטפת הגרעינית. כפי שמוצג כאן, היה הבדל בעל מובהקות סטטיסטית במרחק של מקבץ הגנים בעת תזוזתו מהמעטפת הגרעינית לעבר גוף קוטב השpulumi בתאים המורעבים בחנקן בהשוואה לתאים שגדלו בנוכחות חנקן.

הנתונים המודדים את המרחק בין ה-GFP ל-SBP הראו התפלגות נורמלית, ולכן ניתן היה להשוות את מרחקי הממוצע באמצעות מבחן T. נמצא הבדל מובהק בין שני ערכי הממוצע. הנתונים המודדים את המרחק בין ה-GFP ל-NM לא הראו התפלגות נורמלית, ולכן מרחקי החציונים הושוו באמצעות מבחן Mann-Whitney ranked sum.

היה הבדל משמעותי בין שני ערכי החציונים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון real-time PCR, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לאופן שבו רמת ביטוי הגן נמצאת במתאם עם השינויים בארגון התת-גרעיני.