Name: מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: למדו להעריך רעילות חלבוני פוליגלוטמין בשמרים Saccharomyces cerevisiae באמצעות שלוש שיטות מבחני גידול משלימות. הפרוטוקולים מספקים כלים אמינים לחקר רעילות חלבונים מקופלים בצורה לא נכונה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדה Duennwald נתמך על ידי תרומות של הפדרציה האמריקאית לחקר הזדקנות (מרחוק), קרן מחלה תורשתית (HDF) ואת עץ ויליאם קרן.

1. ביטוי PolyQ-הרחבה חלבונים רעילים שמרים ניתוח שיטתי הקימה את רצף חומצות האמינו המדויק של חלבון polyQ-הרחבת שנדרש כדי לייצר רעילות בשמרים 7. זה חלבון רעיל polyQ-הרחבה מכילה אמינו מסוף הדגל תג ואחריו 17 חומצות האמינו הרצף המקורי של חלבון huntingtin, אזור polyQ, ו-Fusion carboxy מסוף חלבון פלואורסצנטי (או GFP או CFP, ראה תרשים 1). ביטוי של חלבונים עם הרחבות polyQ של 46 glutamines או יותר (למשל 72 ו 103 glutamines) מייצרת רעילות בשמרים כאשר הביע בשליטת מושרה ויחסי האמרגן חזקה GAL1 7, 9. כפי שתואר קודם לכן, רעילות polyQ בשמרים ניכר רק בתאים הנושאים את Rnq1p חלבון קונפורמציה הפריון שלה, [RNQ +], למשל זן שמרים W303 9. חלבון רעיל polyQ-הרחבת Recapitulates ההיבטים המרכזיים של הביולוגיה, polyQ בשמרים, כגון רעילות אורך תלוי polyQ (ראה להלן) צבירה (איור 1 ב). יש לציין, רעילים polyQ-הרחבה חלבונים לא להרוג תאים שמרים באופן מיידי, הם ולא לפגוע או לעצור את מחזור התא במטריקס התא, ובכך מאט או מעכב את הצמיחה של מושבות שמרים על צלחות או תרבויות נוזלי (נתונים שלא פורסמו שלנו). 2. בעיות אפשריות עם תאים שמרים הבעת רעילים PolyQ-הרחבה חלבונים בתאי שמרים המבטאים את החלבונים הרעילים אחרת polyQ הרחבה לא יכול להראות כל פגם הצמיחה 9. הטבע הגנטי של אלה מדכאי של polyQ-רעילות לא נראה להתבסס על מוטציות מנדל פשוטים ולכן יכול להתרחש בתדירות גבוהה יחסית (שלא פורסמו התוצאות שלנו). אנו משערים כי אלה מדכאי ספונטניות נגרמות על ידי ריפוי של פריונים בלתי מזוהים אשר פועלות באופן דומה [RNQ +] בקביעת toxicity.Thes polyQמדכאי ספונטניות אלקטרוני של רעילות polyQ יכול לסכן את התוצאה המוצלחת של הניסוי כל שמטרתו לאפיין רעילות polyQ או לזהות ולאפיין מכפילי של רעילות polyQ. כדי למנוע תופעה מתמשכת של אלה מדכאי ספונטניות, בצע באמצעי הזהירות המפורטים להלן, אשר הוכח כיעיל ביותר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתאי שמרים טריים לניסויים רעילות. אין לאחסן השמרים במשך פרקי זמן ארוכים. לעתים קרובות להחזיר מושבות שמרים טריים ממניות קפואים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות לפקח על הביטוי צבירה של polyQ-הרחבה חלבונים רעילים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים שמרים בתקשורת כי לדכא את הביטוי של רעילות polyQ רעילים בכל עת (כלומר בתקשורת סלקטיביים המכילים גלוקוז כמקור פחמן יחיד) לפני תחילת כל המידות רעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לפחות שלוש transformants עצמאיים לניסוי polyQ-רעילות זה. &lt;/ Li&gt; </li></ol> 3. הצמיחה מבחני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תנאי הניסוי, ולחסן 1 כל המושבה משלושה transformants עצמאיים של תאים שמרים מחסה חלבון רעיל polyQ-התרחבות מ"ל 3 של התקשורת שמרים סלקטיבית עם גלוקוז כמקור פחמן יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אלה תרבויות לילה ב 30 ° C. בתנאים אלה, התאים לא מבטאים את החלבון polyQ-הרחבת בגלל הגלוקוז בינוני מדכא הביטוי שלהם. אל תתנו אלה לגדול יותר תרבויות, לשמור על OD 600 (ספיגת אור באורך גל 600 ננומטר) של תרבויות לילה מתחת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים באופן שגרתי שלושה מבחני שונות כדי לעקוב אחר ליקויים הצמיחה של תאים שמרים המבטאים את חלבון רעיל polyQ-הרחבה: </li></ol> 3.1 גידול על צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבויות שמרים לילה (גדל עם הרעידות 220 סל"ד) ל OD 600 של 0.0005 (כלומר דילול של 1:1000 תרבות OD600 = 0.5) ב סלקטיבית ליקוטר 7 המכילה גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתפשט באופן שווה 50 μl (וכתוצאה מכך CA. 700 מושבות בכל צלחת) של כל תרבות בדילול מלא על צלחת 1 (10 ס"מ קוטר) עם בינוני סלקטיבית המכילה גלוקוז כמקור פחמן יחיד ואחד בינוני עם צלחת סלקטיבית המכיל גלקטוז כמקור פחמן יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות במשך שלושה עד ארבעה ימים על 30 ° C. לאחר הדגירה, לצלם כל צלחת ולספור את מספר המושבות על רמת הסוכר ואת מספר מושבות על צלחות גלקטוז. בתנאים אידיאליים, לא אמורה להיות מושבות מעט מאוד או לא רק על הצלחת גלקטוז בעת שימוש בתאי שמרים להביע רעיל מאוד polyQ-הרחבה חלבון (103Q, איור 2 א). </li></ol> 3.2 מבחני הבחינה Assay זה כמותי יותר assay ציפוי המתואר לעיל ולכן יכול לחשוף שאפילו הבדלים דקים רעילות polyQ עם הניסוי אותו על אותה צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את overnתרבויות ight גדל בינוני עם סוכר כדי OD של 600 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של תרבויות אלו המדולל לתוך 96-גם צלחות סטריליות ולהכין חמש דילולים סדרתי פי חמישה בתוך מים סטריליים באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש Frogger, (המכונה גם הצופה, עם 8 x 6 פינים להעברת השעיות סלולריים) להעביר את המתלים סלולריים על צלחות המכילות מדיה סלקטיבית עם גלוקוז כמקור פחמן הבלעדית צלחות המכילות מדיה סלקטיבית עם גלקטוז כמקור פחמן יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הצלחות להתייבש לפני דוגרים אותם 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לצלם כל צלחת (איור 2b). </li></ol> 3.3. מעקב אחר רעילות polyQ בשמרים על ידי צמיחה של תרבויות נוזלי פרוטוקול זה הוא כמותי ביותר (OD600 מספרים) של שלושת מבחני המתוארים כאן והוא יכול גם לזהות הבדלים דקים מאוד רעילות polyQ. הנ"ל OCcurrence של מדכאי ספונטניות, לעומת זאת, עלולה להביא לתוצאות מטעות. לכן אני ממליץ שילוב זה assay עם לפחות אחד משני מבחני ציפוי שתוארו לעיל. אנו מציעים להשתמש במכשיר BioscreenC לניסויים אלה. BioscreenC הוא מכשיר אוטומטי מודד את צפיפות אופטית של תרבויות השמרים 100-גם צלחות תוך מודגרות בטמפרטורות מוגדרים בהתרגשות מוגדר. שיטות אחרות לגידול תאים שמרים ומדידת צפיפות אופטית שלהם עשוי לחול גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים שמרים מהתקשורת מינימלי המכילים גלוקוז כמקור פחמן יחיד שלוש פעמים במים 3 מ"ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבויות לילה שגודלו בינוני עם גלקטוז כדי OD של 600 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כל טוב צלחת 100-גם BioscreenC עם 300 μl של תרבויות שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנית Easy ניסוי Bioscreen. לקבוע את מספר דגימות ברצונך לעקוב אחר (כולל החסר ובינוניים בלבדשולטת), להגדיר את הטמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס, להגדיר את משך הניסויים עד 3 ימים, לקבוע את המרווחים המדידה 15 דקות, קבע את המסנן 600 ננומטר / בראון, להגדיר את מצב רעד של 15 שניות לפני כל מדידה ב בינוני כוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר BioscreenC והתוכנה המצורפת יפיק Excel גיליונות אלקטרוניים של נקודת נתונים כל נלקח במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין עקומות גדילה עם Excel עבור מדגם זה והשווה הצמיחה של מדגמים שונים (איור 2 ג). תיאור מפורט של ניתוח נתונים המיוצרים על ידי ניסויים BioscreenC סופק לפני 10. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. שמרים polyQ המודל. א) ייצוג סכמטי של חלבון רעיל polyQ ב-הרחבה.) מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה בתאי שמרים המבטאים קצר, רעיל polyQתאים חלבון הרחבה (25Q, פאנל משמאל) שמרים ביטוי רב, חלבון רעיל polyQ-הרחבה (לוח 103Q, נכון). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2. תוצאות נציג של מבחני הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. א) ציפוי assay. כ 700 תאים שמרים פוזרו על צלחות מודגרות במשך שלושה ימים ב 30 ° C. הפאנל העליון מציג את צלחת ובה בינוני הגלוקוז, כלומר את הביטוי של החלבון polyQ-הרחבת רעילים (103Q) לא מושרה. הפאנל התחתון מציג את צלחת השמרים המכיל בינוני גלקטוז, כלומר את הביטוי של החלבון polyQ-הרחבת רעילים מושרה. שימו לב בניסוי המוצג כאן, לא מדכא ספונטנית התרחשה. ב) הבחינה assay. חמש סדרתי פי חמישה דילולים של תאים שמרים מחסה או חלבון רעיל polyQ (25Q) או רעילים polyQ-הרחבת protein (103Q) נראו על צלחות גלוקוז כי לדכא את הביטוי של חלבונים (פאנל משמאל) או על צלחות גלקטוז כי להשרות הביטוי שלהם. הצלחות היו מודגרות מכן במשך שלושה ימים ב 30 ° C. ג) ניסוי BioscreenC. צמיחה של תרבויות של תאים המבטאים שמרים או חלבון רעיל polyQ (25Q) או חלבון רעיל polyQ-הרחבה (103Q) נוטרו על ידי BioscreenC המכשיר. תנאי הניסוי וניתוח של ניסויים BioscreenC מתוארים בטקסט הראשי.

<ol><li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li>
<li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+repeats+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li>
<li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li>
<li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li>
<li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+bread+to+brains+and+beyond%3A+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li>
<li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+%28-%29-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

כתב יד זה מתאר שלוש גישות ניסיוניות משלימות כדי למדוד polyQ-רעילות בשמרים אורגניזם מודל המבוסס על צמיחה מופחתת של תאים שמרים המבטאים רעילים polyQ-הרחבה חלבונים. עבודה שמרים הציעה תובנות עמוקות לתוך המנגנונים תאית ומולקולרית הבסיסיים של misfolding חלבון ו רעילות שהתפתח שלה, כולל misfolding ורעילות של polyQ-הרחבה חלבונים 9,11,12. ניסויים המבוססים על הפרוטוקולים שהוצגו כאן כבר עזרו לזהות ולאפיין משפרי גנטיים או מדכאי של רעילות polyQ, מכפילי מולקולה קטנה של רעילות polyQ, וא...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם של מכשיר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Frogger (6x8 פינים) </td><td> V &amp; P מדעי, סן דייגו </td><td> סמנכ&quot;ל 407 AH </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves ארה&quot;ב </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100 היטב צלחות חלת דבש </td><td> Growthcurves ארה&quot;ב </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות polyglutamine על שמרים

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Misfolding חלבון קשורה עם מחלות אנושיות רבות, במיוחד מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון 1. מחלת הנטינגטון (HD) נגרמת על ידי התרחבות חריגה של האזור polyglutamine (polyQ) בתוך huntingtin חלבון. חלבון polyQ-מורחבת huntingtin משיגה קונפורמציה סוטה (כלומר misfolds) וגורם רעילות הסלולר 2. לפחות שמונה מחלות ניווניות נוספות נגרמות על ידי polyQ למוצרי הרחבות, כולל Ataxias Spinocerebellar ומחלת קנדי 3. שמרים אורגניזם מודל יש להקל תובנות משמעותיות על בסיס תאית ומולקולרית של רעילות-polyQ, כולל ההשפעה של הגורמים התוך והבין המולקולרי של polyQ-רעילות, וכן זיהוי של מסלולים תאיים כי לקויי בתאים לבטא polyQ-הרחבה חלבונים 3-8. חשובלי, היבטים רבים של רעילות-polyQ שנמצאו השמרים היו לשכפל מערכות ניסיוניות אחרות ובמידה מסוימת בדגימות מחולים HD, ובכך מפגין את המשמעות של המודל שמרים על גילוי מנגנונים בסיסיים בבסיס polyQ-רעילות. בדרך ישירה ופשוטה יחסית כדי לקבוע polyQ-רעילות בשמרים היא למדוד פגמים הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. כתב יד זה מתאר שלוש גישות משלימות הניסוי כדי לקבוע polyQ-רעילות בשמרים על ידי מדידת הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. הראשון שתי גישות ניסיוניות לעקוב אחר הצמיחה השמרים על צלחות, הגישה 3 מנטרת את הצמיחה של תרבויות שמרים נוזליים באמצעות מכשיר BioscreenC. יתר על כן, כתב היד הזה מתאר קשיים ניסויים שיכולים להתרחש בעת טיפול polyQ מודלים שמרים מתאר אסטרטגיות שיעזרו למנוע אולמזער את הקשיים הללו. פרוטוקולים המתוארים כאן יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין מסלולים גנטיים ומולקולות קטנות לווסת polyQ-רעילות. יתר על כן, מבחני המתוארים יכולים לשמש תבניות עבור ניתוחים מדויקים של רעילות הנגרמת על ידי מחלה הקשורים חלבונים אחרים misfolded במודלים של שמרים.

כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים בשמרים<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. פרוטוקולים אלה יכולים בקלות להיות שונה כדי לפקח על רעילות של חלבונים misfolded אחרים שמרים.

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

קיפול שגוי של חלבונים קשור למחלות אנושיות רבות, ובמיוחד למחלות ניווניות של מערכת העצבים, כגון מחלת אלצהיימר, פרקינסון...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשתמש בשמרים כפלטפורמה ניסוית להערכה ולניתוח של הרעילות הקשורה לחלבונים עם הרחבת פולי-גלוטמין. לאחר גידול השמרים בתנאים המדכאים את ביטוי הפולי-גלוטמין, מבוצעים שלושה מבחני גידול משלימים של תאי שמרים המבטאים חלבון רעיל עם הרחבת פולי-גלוטמין, כדי להעריך באופן מהימן את הרעילות כפי שהודגמה במבחן הגידול הראשון.כאן, רעילות של פולי-גלוטמין מנוטרת באמצעות בדיקת פריסה (plating assay). כבדיקת גדילה משלימה שנייה, נעשה שימוש בבדיקת נקודות (spotting assay) כדי לזהות אפילו הבדלים קטנים בצמיחת התאים. הגישה הכמותית ביותר מוצגת בבדיקה השלישית, שבה תאי שמרים גדלים בתרביות נוזליות והרעילות מנוטרת באמצעות תצפית על צפיפות אופטית ב-600 nanometers, ובסופה ניתן להגיע לתוצאות הדירות וכמותיות.מסמך זה מדגים רעילות של poly glutamine בתאי שמרים באמצעות בחינה קפדנית של צמיחתם על מצעים מוצקים ובתרביות נוזליות. שיטה זו יכולה לספק מענה לשאלות מפתח בנושא הפרעות של קיפול חלבונים שגוי, כגון פענוח הבסיסים הגנטיים והתאיים של הרעילות הקשורה לחלבונים מקופלים באופן שגוי, כולל חלבוני poly glutamine. ניתוח שיטתי קבע את רצף חומצות האמינו המדויק של חלבון poly Q עם הרחבה (expansion), הנדרש כדי להוביל לרעילות בשמרים.חלבון הרחבת ה-poly Q רעיל זה מכיל תג flag בקצה האמינו, ולאחריו 17 חומצות אמינו מהרצף המקורי של חלבון ה-Huntington, אזור poly Q, וחיבור בקצה הקרבוקסי לחלבון פלואורסצנטי. תאי שמרים המבטאים את חלבוני הרחבת ה-poly Q הרעילים עלולים שלא להראות פגם בצמיחה בשל מדכאים ספונטניים של רעילות poly Q, דבר שעלול לסכן את התוצאה המוצלחת של כל ניסוי השואף לאפיין את רעילות ה-poly Q או את המודיפיקטורים שלה. כדי למנוע את ההופעה השכיחה של מדכאים ספונטניים אלו, הקפידו לנקוט באמצעי זהירות, כולל שימוש בתאי שמרים טריים לניסויי רעילות. הימנעו מאחסון שמרים לפרקי זמן ממושכים והוציאו לעיתים קרובות מושבות שמרים טריות ממלאים קפואים.בצע ניטור שוטף של הביטוי והאגרגציה של חלבוני התפשטות poly Q רעילים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שמור את תאי השמרים במצע המדכא את הביטוי של החלבונים הרעילים בכל עת, וזאת לפני תחילת כל מדידת רעילות.כאמצעי מניעה סופי, השתמשו במספר טרנספורמנטים בלתי תלויים לכל ניסוי. לתחילת העבודה, בדיקות הצמיחה המוצגות בפרוטוקול זה משיגות תאי שמרים המקודדים לביטוי של חלבוני הרחבת poly Q, תוך שימוש ב-3 mL של מצע שמרים סלקטיבי עם גלוקוז כמקור הפחמן היחיד. זרעו שלושה תרביות משלושה טרנספורמנטים בלתי תלויים והדגירו את התרביות למשך לילה ב-30 °C.בתנאים אלו, התאים אינם מבטאים את חלבון הרחבת ה-poly Q עקב דיכוי על ידי גלוקוז. יש להימנע מצמיחת יתר של תרביות הלילה על ידי שמירת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מתחת לאחד, כדי לאפשר ניטור של פגמים באמצעות גידול על צלחות. ראשית, בצעו דילול של 1 ל-1000 של תרבית שמרים מהלילה עם OD 600 של 0.5 בתווך סלקטיבי המכיל גלוקוז; פזרו באופן אחיד 50 µL מכל תרבית מדוללת על צלחת אחת עם תווך סלקטיבי המכיל גלוקוז כמקור הפחמן היחיד, כך שיתקבלו כ-700 מושבות לצלחת עבור כל תרבית מדוללת.בצע זריעה גם על מצע סלקטיבי המכיל גალაქטוז כמקור הפחמן היחיד. לאחר הדגירה, הדגר את הצלחות למשך שלושה עד ארבעה ימים ב-30 degrees Celsius. צלם כל צלחת וספור את מספר המושבות בצלחות הגלוקוז והגალაქטוז.בתנאים אידיאליים, לא אמורות להיות מושבות, או שיהיו מעט מאוד מושבות, בצלחת הגלקטוז בעת שימוש בתאי שמרים המבטאים חלבון poly Q expansion רעיל ביותר. בדיקת ה-spotting היא כמותית יותר מבדיקת ה-plating ולכן יכולה לחשוף אפילו הבדלים קטנים ברעילות ה-poly Q. במסגרת אותו ניסוי על אותה צלחת, כדי להתחיל בדיקות spotting במצע עם גלוקוז, יש לדלל את תרביות הלילה שגדלו עד ל-OD 600 של 0.1, להעביר 200 µL מכל תרבית מדוללת לתוך פלטות 96 בארות סטריליות ולהכין חמש דלולות סדרתיות של פי חמישה במים סטריליים באמצעות פ pipette רב-ערוצית תוך שימוש ב-frogger transfer.יש להעביר את תרחיפי התאים לצלחות המכילות מצע סלקטיבי עם גלוקוז כמקור הפחמן היחיד. בנוסף, יש להעביר את התאים לצלחות המכילות מצע סלקטיבי עם גלקטוז כמקור הפחמן היחיד; לאחר ייבוש הצלחות, יש לדגרהן בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה עד ארבעה ימים לפני צילום כל צלחת. בדיקת הצמיחה בנוזל היא הכמותית ביותר מבין שלוש הבדיקות המתוארות כאן לניטור רעילות poly Q בשמרים.מכשיר ה-bio screen C הוא מכשיר המודד באופן אוטומטי את הצפיפות האופטית של תרביות שמרים בלוחות של 100 בארות, בזמן דגירה בטמפרטורות מוגדרות ותחת ערבול מוגדר. ניתן להשתמש בשיטות אחרות לגידול תאי שמרים ומדידת הצפיפות האופטית שלהם כדי להתחיל בתהליך של סבב צנטריפוגה (spin down) לתאי השמרים שגודלו במהלך הלילה במצע מינימלי המכיל גלוקוז כמקור הפחמן היחיד. לאחר הצנטריפוגה, שטפו את התאים בשלושה מיליליטר של מים סטריליים.חזור על השטיפה פעמיים, תוך סבב של התאים (spinning down) בין שטיפה לשטיפה באמצעות מצע עם גלקטוז. דלל את התאים השטופים עד ל-OD 600 של 0.1. לאחר מכן, מלא כל באער בלוח bio screen C בעל 100 באערים ב-300 microliters של תרביות השמרים המדוללות והכנס את הלוח למכשיר.פתחו את תוכנית הניסוי של easy bio screen. קבעו את מספר הדגימות למעקב. הגדירו את הטמפרטורה ל-30 °C.הגדירו את משך הניסויים לשלושה ימים ואת מרווחי המדידה ל-15 דקות. כמו כן, הגדירו את המסנן ל-600 nanometers brown ואת מצב הנענוע ל-15 שניות לפני כל מדידה בעוצמה בינונית. לאחר הגדרת הפרמטרים, התחילו בניסוי.ה-bio screen, ראו מכשיר, והתוכנה הנלווית יפיקו גיליונות אלקטרוניים ב-Excel עבור כל נקודת נתון שנמדדה במהלך הניסוי. באמצעות Excel ניתן להכין עקומות גדילה עבור כל דגימה ולהשוות את הגדילה בין דגימות שונות. מוצגים כאן תוצאות מבדיקת ה-plating assay.כ-700 תאי שמרים נפרסו על צלחות ודגרו במשך שלושה ימים ב-30 °C על הצלחת המכילה מצע גלוקוז. במצב זה, ביטויו של חלבון הרחבת ה-poly Q הרעיל אינו מושרה. לעומת זאת, כאשר תאי השמרים נזרעו על מצע גלקטוז, ביטויו של חלבון הרחבת ה-poly Q הרעיל מושרה.שימו לב שבניסוי המוצג כאן, לא התרחשה דיכוי ספונטנית. באופן דומה, בבדיקת ה-spotting, ביטוי של חלבון הרחבת Poly Q רעיל נצפה על גלקטוז ולא על גלוקוז. מדיום חמישי, דילול סדרתי של פי חמישה של תאי שמר המכילים חלבון poly Q לא רעיל או חלבון הרחבת poly Q רעיל, שהונחתו על צלחות גלוקוז המדכאות את ביטוי החלבונים או על צלחות גלקטוז המגבירות את ביטוים בניסוי bio screen C.הצמיחה של תרביות תאי שמרים המבטאים חלבון poly Q שאינו רעיל או חלבון הרחבה של poly Q רעיל נוטרה באמצעות מכשיר bio screen C כפי שמתואר בסרטון זה; השפעת הביטוי של חלבון הרחבת poly Q הרעיל על צמיחת התאים ניכרת כאן. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לנטר את הרעילות של חלבוני poly glutamine בשמרים. בדיקת הצמיחה בנוזל היא הכמותית ביותר מבין שלוש הבדיקות, שכן היא יכולה לזהות אפילו הבדלים דקים ברעילות של poly glutamine.אך אנא זכרו לשלב זאת עם לפחות אחת משתי בדיקות הפריסה (plating assays), כדי למנוע בעיות של דיכויים ספונטניים של רעילות פולי-גלוטמין.

growth-assays-to-assess-polyglutamine-toxicity-in-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד...

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה להערכת ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של תרכובת בדיקה, אסטרגלנית, על הישרדות עצבית ב- Caenorhabditis elegans מרעילות עצבית בתיווך polyQ. הבדיקה משתמשת ב- Caenorhabditis elegans המבטאים את החזרות polyQ המורחבות באופן חריג המאוחות ל- GFP בנוירוני ה- ASH שלהם כדי למדוד הישרדות עצבית לאחר טיפול בתרכובת בדיקה.

בדיקה לחקר ההשפעה של תרכובת בדיקה נגד רעילות עצבית בתיווך PolyQ בתולעים

מודלים של חלבוני שמרים הם כלים רבי ערך להערכת הרעילות והצבירה של חלבונים המעורבים במחלה. כאן, אנו מציגים שיטות לסינון ספריות וריאנטים של Hsp104 עבור מדכאי רעילות. ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לסנן כל ספריית חלבונים לאיתור מדכאי רעילות של כל חלבון רעיל בשמרים.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

מאמר זה מתאר פרוטוקולים כדי להעריך את ההשפעה של חלבונים פלורסנט על צבירה ורעילות של התרחבות misfolded polyglutamine על הערכה מהירה של חלבון פלואורסצנטי uncharacterized לאחרונה בהקשר של עיתונאים פלורסנט.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

פתוגנים חיידקיים מפרישות חלבונים לתוך המחשב המארח המטרה תהליכים ביולוגיים קריטיים. זיהוי מסלולים המארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור הוא המפתח לטיפול פתוגנזה מולקולרית. כאן, שיטה באמצעות מדכא שמרים שונה ומסך רעילות כדי להבהיר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור רעיל מתואר.

זיהוי של מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור באמצעות רעילות שמרים מסכי מדכא

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת הפעילויות הנוירו-הגנתיות של תרכובות בדיקה ב - Caenorhabditis elegans, כולל צבירה של פוליגלוטמין, מוות עצבי והתנהגות כימואבואידית, כמו גם שילוב מופתי של פנוטיפים מרובים.

Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

למדו להעריך רעילות חלבוני פוליגלוטמין בשמרים Saccharomyces cerevisiae באמצעות שלוש שיטות מבחני גידול משלימות. הפרוטוקולים מספקים כלים אמינים לחקר רעילות חלבונים מקופלים בצורה לא נכונה.

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

גלה סרטונים נוספים