Name: הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למדו לבודד מבשרי גליה מוגבלים מחוט השדרה העוברי בעכברי E13 באמצעות תרבית סלקטיבית ואימונופנינג. שיטה זו מאפשרת שימוש בתאים לטיפולי השתלה ולחקר התפתחות אוליגודנדרוציטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות לד&quot;ר גארי דווין עבור התובנה שלו משוב על שימוש בתאי GRP.

<ol><li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord%3A+isolation%2C+characterization%2C+and+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ernst+Schering+Research+Foundation+workshop%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li>
<li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li>
<li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li>
<li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+glial-restricted+progenitors+survive%2C+proliferate%2C+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li>
<li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li>
<li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li>
<li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li>
<li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li>
<li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li>
<li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+glia+biology%22%5BJournal%5D)">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li>
<li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li>
<li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+cerebral+palsy%3A+which+ones+are+best%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+child+neurology%22%5BJournal%5D)">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variability%2C+injury+distribution%2C+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+neurology%22%5BJournal%5D)">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li>
<li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+A2B5%2B+glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li>
<li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li>
<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+in+premature+infants%3A+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li>
<li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li>
<li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li>
<li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-permeable+AMPA%2Fkainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li>
<li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li>
<li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+white+matter%3A+clinical+and+pathophysiological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Mental+retardation+and+developmental+disabilities+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li>
<li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tripotential+glial-restricted+precursor+%28GRP%29+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord%3A+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li>
<li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li>
<li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li>
<li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li>
<li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li>
<li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li>
</ol>

מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), ו R01NS028208 (MVJ)] וקרן לנוירולוגיה ילדים. התכנים של הדו&quot;ח זה הם באחריות הבלעדית של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות, DHHS. החוקרים אין ניגודי עניינים רלוונטיים למחקר זה.

<p class="jove_content"&gt; הפרעות של החומר הלבן במערכת העצבים המרכזית כוללים מספר רב של כבעלות אטיולוגיה, כולל סיבות גנטיות דלקתיות, איסכמי ורעילים<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. אמנם טרשת נפוצה vasculopathies הן הגורם המוביל של מחלת החומר הלבן במבוגרים, leukomalacia periventricular קשור פגות היא הסיבה השכיחה ביותר של פגיעה בחומר הלבן של האוכלוסייה הילדות. על מנת להמשיך לשרטט מנגנוני המחלה מחקר נוסף של שושלת תאים ofoligodendrocytic, אשר השפיעה מאוד על ידי עלבון הלידה, נדרשת. GRPS נותקו מן חוט השדרה העובר מכרסם העולם להיות tripotential בטבע, והוליד oligodendrocytes ושתי אוכלוסיות astrocyte ברורים, אבל לא להתמיין לנוירונים<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. כמו כן, תאים מבשר oligodendrocyte (OPC) נגזר העצב עכברים אופטיים והמוח מאוחר עובריים או בתחילת חולדה לאחר הלידה הוכחו להתבגר לתוך oligodendrocytes לתפקד בתנאים המתאימים מדיה<sup&gt; 27,28</sup&gt;. בנוסף, העובר או מבוגר OPC האדם נגזר כבר מניפולציה נוספת לתוך פנוטיפים oligodendrocyte בוגרים יותר<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; תאים GRP היה מבודד חוט השדרה הן של E13.5 חולדות ו-E12 13.5 בעכברים. על ההבדלים חולדה דווחו בין תאים GRP הגב, ואת הגחון הנגזרות בתגובתם לתנאים המקדמים דור של oligodendrocytes או האסטרוציטים עם הגחון הנגזרות GRPS מפגין נטייה גדולה יותר להתמיין את פנוטיפים בוגרים יותר<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. זה יכול להיות בגלל הגחון הגירה הגב של תאים GRP המתהווה, אשר יכול להיות פתוחים פחות את הרמזים בידול. Immunopanning מאפשר subpopulation המבטא A2B5 להיות מבודדת ואסף לצורך תחזוקה בתרבות.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; עכבר GRP שלנו תרבויות נגזרות רקמות הכולל חוט השדרה כי התשואות אוכלוסיה הטרוגנית, ונקווה של תאים שמהם תאים GRP נבחרים על ידי כימיקלים (בינוני) וטכניקות המבוססים על נוגדנים. בעוד המחקרים שלנו מנוצל חוט השדרה שמקורם בתאי עכבר GRP, יש לו יותר לאחרונה דווח גזירת הנגזרות מוח עכבר oligodendrocyte תאים ובתאים הם גם מסוגלים להתפתח oligodendrocytes בוגרים<sup&gt; 31</sup&gt;. כאן התאים שמקורם מתורבתים בתחילה oligospheres כי באמצעות המדיום המתאים התרבות הם מניפולציה לתוך PDGFαR מועשר +, האוכלוסייה OPC<sup&gt; 31</sup&gt;. המחקרים שלנו התמקדו ההשפעה של המודל שלנו של עלבון hypoxic-איסכמי על תאים בספקטרום שושלת oligodendrocyte מ A2B5 +, PDGFαR-GRP מבשרי כדי חלבון המיאלין הבסיסי לבטא MBP (+) oligodendrocytes בוגרים. ואכן שלנו<em&gt; במבחנה</emאפיון&gt; הראה את התאים האלה GRP בשלה ובוגרת לתאי MBP המבטאים גם ב monocultures או עמיתים תרבויות עם הנוירונים בקליפת המוח. תאים אלה ניתן להשפיע על התרבות אל המסלולים בידול ספציפיים לחקר המנגנונים המעורבים הלידה פגיעה בחומר הלבן. ישנם כמה מודלים העכבר של מחלות החומר הלבן מעורבים תאים של שושלת oligodendrocyte ואת הזמינות של אוכלוסייה זו מאפשרת בדיקה יסודית לתוך המנגנונים שגורמים לפגיעה, כמו גם לבחון את התועלת של אפשרויות הטיפול האפשריות סלולריים.</p

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> RH-FGF-בסיסי </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> טריפסין (0.05%) EDTA </td><td> איכות ביולוגית, Inc </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poly-L-ליזין HBr </td><td> סיגמא </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> סיגמא </td><td> L2020, במינון של 1 </td></tr><tr><td> Dnase 1 </td><td> סיגמא </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ e13 עכברים

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

זהו פרוטוקול הגזירה של גליה מוגבלים (GRP) תאים מבשר של חוט השדרה של E13 עוברים עכבר. תאים אלה הם סימנים מקדימים המוקדמות בתוך השושלת תא oligodendrocytic. לאחרונה, תאים אלה נחקרו כמקור פוטנציאלי עבור טיפולים משקמות מחלות החומר הלבן. Leukomalacia periventricular (PVL) הוא הגורם המוביל של המחלה לא גנטית החומר הלבן בילדות ומשפיע עד 50% של פגים ביותר. הנתונים מראים רגישות מוגברת של המוח המתפתח כדי איסכמיה היפוקסיה, סטרס חמצוני excitotoxicity כי סלקטיבי מכוון בחומר הלבן המתהווה. מבשרי מוגבלים גליה (GRP), ובתאים oligodendrocyte (OPC) ו oligodendrocytes לא מפותחים (preOL) נראה כי שחקני מפתח בהתפתחות PVL והם הנושא של לימודי המשך. יתר על כן, מחקרים קודמים זיהו קבוצת משנה של רקמת מערכת העצבים המרכזית אשר עלתה הרגישות גלוטמט excitotoxicity כמוגם תבנית התפתחותית לרגישות זו. המעבדה שלנו חוקרים כעת את התפקיד של אבות oligodendrocyte בתאים PVL ושימוש בשלב GRP של התפתחות. אנו מנצלים את התאים האלה GRP הנגזרות פרדיגמות הניסוי לבדוק כמה תגובתם בחר מדגיש בקנה אחד עם PVL. תאים GRP ניתן להשפיע במבחנה אל OPCs ו preOL לניסויים השתלת עם מודלים העכבר PVL ו במודלים חוץ גופית של PVL כמו עלבונות, כולל איסכמיה היפוקסיה. באמצעות תאים בתרבית ו במבחנה מחקרים יש תקטן השונות בין ניסויים המאפשר פרשנות של הנתונים. תאים בתרבית מאפשרת גם העשרה של האוכלוסייה GRP תוך מזעור ההשפעה של זיהום תאים של הפנוטיפ לא GRP.

פרוטוקול זה מתאר את הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ מיתרי השדרה העובר ומתוחזק במבחנה או להשתלה או למחקר של שושלת oligodendrocytic.

הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים

זהו פרוטוקול להפקת תאי אב מוגבלי גלייאל (GRP) מחוט השדרה של עוברי עכבר ביום 13 להריון (E13). תאים אלו הם תאי אב מוקדמים...

המטרה הכוללת של נוהל זה היא להפיק תאי קדמון מוגבלים לגליות או תאי GRP מחוטי שדרה עובריים. זאת על ידי הוצאת חוטו השדרה מעובריים ביום E 13 והעברתם לפלטות תרבית עם מדיה סלקטיבית ל-GRP. לאחר מכן, נעשה שימוש בשיטת immuno panning להעשרת אוכלוסיית ה-GRP ולסילוק השושלות שאינן GRP.ניתן להקפיא את תאי ה-GRP המזוהים ולהעבירם לאחסון לטווח ארוך. ניתן להפשיר את תאי ה-GRP המזוהים ולהשתמש בהם לניסויים עתידיים, כגון הדגמת נדידה של תאי GRP מושתלים דרך מעבר ברוחב תא בודד. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את השלבים הכירורגיים עשוי להיות קשה ללמוד, במיוחד עבור מי שאינו מנוסה.המדגימים היום הם Roche De Silva ו-Joel Marx, סטודנטים במעבדה שלנו. השגו נקבות עכברים הרות ביום העוברי E 12 או E 13 של ההתפתחות העוברית, ממקור מסחרי או מהכנה פנימית. יום E 1 מוגדר על ידי נוכחותו של פקק רירית בנרתיק.יום לאחר שנקבה פורה שוכנה עם זכר, לאחר חיטוי של כל המכשירים ותא תרביות הרקמה. הכינו צלחת פטרי נקייה עם 20 milliliters של מדיום נתיחה קר. לאחר מכן, הכינו את העכבר באמצעות זריקת הרדמה של chloral hydrate.ברגע שהעכבר אינו מראה רפלקס כאב, למשל בעקבות צביטה בבהו, יש להקריבו באמצעות דיסלוקציה צווארית או עריפת ראש. אנו מעדיפים שלא להשתמש ב-CO2 להרדמת בעל החיים בשל ההשפעה האפשרית על חיוניות העוברים ובסופו של דבר על התאים המופקים מהם. לאחר חיטוי אזור הבטן, פתחו את הבטן באמצעות מספריים גדולים ופינצטה כדי להוציא את הרחם. בהתאם לזן, הרחם יכיל בין שמונה ל-14 עוברים.הניחו את הרחם בתוך תמיסת ניתוח קרה וטרייה בצלחת פטרי נקייה כדי לבודד את העוברים. ראשית, שטפו דם ורקמות עודפות. לאחר מכן, הוציאו כל עובר מהקרן הרחמית והפרידו אותם משק העוברי ומהשילייה.באמצעות מספריים קטנים, העבירו את העוברים לצלחית עם תמיסת נתיחה טרי וקר. התמיסה הקרה תפחית את הפעילות המטבולית ותשמור על חיוניות התאים המופקים. תחת מיקרוסקופ נתיחה, השתמשו בפינצטה ובמספריים קפיציים כדי לחתוך את העור לאורך חוט השדרה, קלפו אותו וחשפו את חוט השדרה.בצעו חיתוך רוחבי (Transect) של חוט השדרה באזור C1 ובתחילת הזנב. לאחר מכן, הסירו בזהירות את חוט השדרה יחד עם כל העצם והסNSMutableסחור המלווים אותו, והעבירו ואספו כל חוט שדרה שהוכן לכלי איסוף נפרד. באמצעות מדיום דיסקציה טרי, אנו קוצרים את חוט השדרה כולו, למרות שריכוז גבוה יותר של תאי GRP ממוקם באזורים ספציפיים.עם הזמן, עם זאת, מצע ה-GRP מבצע סלקציה עבור הפנוטיפ של GRP, ואוכלוסייה זו ממוקסמת עוד יותר על ידי immuno H two B five למניעת צמיחת יתר של רקמת קרומי המוח. בתרביות תאים עוקבות, הסר כמה שיותר מקרומי המוח מהחוט השדרה בשל העצבים ההיקפיים הבולטים שמתפתחים. פעולה זו קשה יותר מאשר הסרת רקמת קרומי מוח מרקמה מוחית שהוצאה.לאחר שהסרה של כמה שיותר מהקרומים (meninges) הושלמה, העבירו את חטבלי השדרה לצלוחית פטרי בקוטר 20 מילימטר והמשיכו בתהליך הדיסוציאציה של התאים. חממו מראש מנה של trypsin למשך חצי שעה לפחות באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C.יש לבצע את השלבים הבאים במהירות כדי לשפר את חיוניות רקמת חוט השדרה המופקת. העבירו את חוט השדרה למבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר המכילה trypsin ו-DNAs. לאחר מכן, בצעו טריטורציה קצרה של התערובת באמצעות פיפטור.דגרו את התערובת למשך 10 דקות ב-37 °C. ערבבו אותה שוב ולאחר מכן המשיכו בדגירה למשך 10 דקות נוספות. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע GRP וסבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות.במהירות של 1000 RPM, שאבו את הנוזל העליון ובצעו השהיה. השהו את המשקע ב-10 milliliters של מצע GRP עם DNAs one. כעת הדגרו למשך 10 דקות נוספות ושקעו את התאים במהירות של 1000 RPM למשך חמש דקות.שאבו את הנוזל העליון (supernatant) וסספנדו מחדש את המשקע במצע GRP טרי. העבירו את התאים דרך מסנן תאים של 40 עד 70 מיקרון והעבירו אותם לבקבוקי T 25 מצופים ב-PLL laminin.דגרו את התאים והחליפו 100% מהתווך למחרת, ולאחר מכן בכל יום שני או בתדירות גבוהה יותר אם חומרי ההזנה מדולתלים. בנקודה זו, ה-GRPs כבר נצמדו והחלו להוציא זקיפים, וניתן לייעל אותם באמצעות immuno panning. המשיכו בגידול התאים עד להגעה להתקבצות (confluence) של 85% עד 90% או עד לחלוף שבוע.לאחר מכן, קצרו את התאים באמצעות מגרד גומי (rubber policeman) או טריפסין. השעיקו מחדש את התאים במצע טרי והרחיבו אותם בשלושה בקבוקוני T 25, תוך החלפת המצע לפחות בכל 48 שעות. כאשר הבקבוקונים הגיעו למצב של התמלאות מלאה (confluency), קצרו אותם כפי שנעשה קודם לכן לתוך חמישה מיליליטר של מצע GRP. טריטורו את תרחיף התאים כדי לפרק גושים והעבירו אותם לבקבוקון בקטריולוגי מצופה של 25 מ"ל.מדגשני פטרי מדגריים את התאים על פלטות A שתיים B למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ללא ניעור. לאחר מכן, שאבו את המצע ושטפו את הפלטות ארבע עד שמונה פעמים עם PBS כדי לשמור על רמת מחמירות גבוהה למניעת קישור לא ספציפי של תאים לפלטה. השתמשו בRubber policeman.אספו את התאים השטופים לשני מיליליטר של מצע GRP, ולאחר מכן העבירו את התליה לצלחות או לבקבוקים מצופים ב-PLL lamina עם מצע GRP. ברגע שהתאים הגיעו ל-85% עד 90% התמזגות (confluence), קצרו אותם באמצעות trypsin, לאחר מכן דללו והשביתו את ה-trypsin עם שמונה מיליליטר של מצע GRP stock, ואספו את התאים כמשקע (pellet). השביו מחדש את נפח התאים מבקבוק T 25 במיליליטר אחד של מצע הקפאה GRP, או תאים מבקבוק T 75 בשני מיליליטר של מצע הקפאה GRP.כווננו את ריכוז תרחיף התאים במידת הצורך, והעבירו את התאים למבחנות קריוגניות. הקפיאו את התאים באיטיות למשך לילה במיכל קריוגני המכיל איזופרופנול בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. למחרת, העבירו את התאים לאחסון לטווח ארוך. התאים יהיו בעלי חיוניות של 60% עד 80% לאחר הפשרה ששת חודשים עד שנה לאחר מכן.החיוניות תלויה במידה רבה באיכות ציפוי ה-PLL laminin. לאחר יומיים בתרבית, נצפה העשרה מרבית של תאי חוט שדרה בעלי מורפולוגיות שונות שנזרעו. תאי אוכלוסיית ה-GRP הם immuno pan כדי לבחור את אוכלוסיית ה-A two B five.אם קיימת בעיה של זיהום בתאי אפיתל עצבי (neuro epithelial cells), ניתן להשתמש במיון אימונולוגי כפול (double immuno panning) כדי לסלק תחילה את האוכלוסייה החיובית ל-NCA, ולאחריו ביצוע ברירה של A two B five. תוסף A T three free B 27 נוסף כדי להפחית את הזיהום של אוליגודנדרוציטים בוגרים. תאי GRP מטוהרים היו ניתנים לזיהוי על פי הגוף התאי (soma) הקטן שלהם ושני או שלושה שלוחות קצרים.לעתים הייתה קיימת גם אוכלוסייה קטנה ועקבית של תאים שליליים ל-A two B five, שהיו נוירו-אפיתליים ומסוגלים להפוך ל-GRP או ל-N rp. למרבה המזל, ככל שהתאים הוחזקו זמן רב יותר במצע GRP, כך גדל הסיכוי שיאמצו את הפנוטיפ של GRP. ניתן להשתמש בטכניקות הבסיסיות של הליך זה כדי להפיק סוגי תאים אחרים, מה שיכול לענות על שאלות נוספות, כגון איזה תא מתאים יותר לטיפול בהחלפת תאים, או האם נוירונים המופקים מהקורטקס יכולים לשמש כמודלים טובים למיאליניזציה in vitro.

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מתאר את שיטת לבידוד של neuroprecursors מהקורטקס המתפתח של עכברים עובריים. ההליך להסרת עוברים מן הרחם, לנתח את רקמת קליפת המוח, ולעכל את קליפת המוח מבודד מוצג.

תרבות עצבית עכבר מקדימים לתאי גזע

הסרטון הדגים את השיטה של בידוד וטיפוח תאים ממוחו של עכבר בילוד. היא כללה דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של המוח, ואחריה תרבית במצע גדילה חסר גורם גדילה עצבי כדי להשיג אוכלוסיית גלייה מעורבת.

השגת תרבית תאי גליה מעורבת ממוח עכבר יילוד

ההשתלה של תאי גזע עצביים / אב (NPCs) מחזיקה בהבטחות גדולות בתחום הנוירולוגיה רגנרטיבית. המשלוח המערכתי של NPCs הפך לפרוטוקול יעיל, נמוך פולשנית וטיפולית יעיל מאוד כדי לספק תאי גזע במוח ובחוט השדרה של מכרסמים וקופים לא אנושיים מושפעים מניזק דלקתי כרוני ניסיוני של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקה מערכתית של תאי גזע / אב עצביים בעכברים עם EAE כרוני

הליך זה מראה כיצד למקד אינטרנוירונים במוח הקדמי של העכבר המתפתח באמצעות אלקטרופורציה ברחם. טכניקה זו הייתה יעילה במיוחד להשגת ביטוי גנים סלקטיבי בתת-סוגים בין-נוירונים המיועדים לשכבות השטחיות של קליפת המוח.

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

כאן, אנו מתארים את ניתוקה של המעית-גלייה מ המעי-submucosa באמצעות incubations EDTA רציפים כדי chelate קטיונים דו ערכיים ולאחר מכן הדגירה ב פתרון שחזור תאים שאינם אנזימטיות. ציפוי התליה תא תוצאות על פולי-D-ליזין ו- laminin תוצאות בתרבות מועשר של תאי גליה submucosal לניתוח פונקציונלי.

בידוד תאי גליה המעית מן Submucosa פרופריה. מוסקולריס של העכבר למבוגרים

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למדו לבודד מבשרי גליה מוגבלים מחוט השדרה העוברי בעכברי E13 באמצעות תרבית סלקטיבית ואימונופנינג. שיטה זו מאפשרת שימוש בתאים לטיפולי השתלה ולחקר התפתחות אוליגודנדרוציטים.

הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים

גלה סרטונים נוספים