דופמין Dynamics Presynaptic בתוך פרוסות המוח striatal עם Voltammetry סריקה מהירה מחזורי
12 בינואר 2012
שימוש מהיר סריקה מחזורית voltammetry למדוד עורר חשמלית הדינמיקה דופמין presynaptic ב striatal פרוסות המוח.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים פרוטוקול כללי עבור סריקה מהירה של פרוסות ב-cyclic V Telemetry. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת רקמת המוח לחיתוך קורונלי, ולאחר מכן הצבת אלקטרודות באזור המוח הספציפי הנחקר.
השלב הבא הוא הפעלת מתח בצורת גל משולש דרך האלקטרודה כדי לזהות דופמין. לבסוף, מחילים על פרוסת המוח חומר פרמקולוגי רצוי ובוחנים את השפעתו על הדינמיקה של דופמין פרה-סינפטי. בסופו של דבר, פרוטוקול זה מראה שינויים בדינמיקה של דופמין פרה-סינפטי, כגון שחרור דופמין מושרה וקצבי ספיגת דופמין, באמצעות וולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (fast scan cyclic voltammetry).
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי דינמיקה של דופמין פרה-סינפטית, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות, כולל בעלי חיים ומוליכים עצביים אחרים, כגון חולדות וזבובים, וסרוטונין ונוראפינפרין בהתאמה. את הפרוצדורה ידגימו פרנסיס מנה, MEA חאלד וארין או, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה, בהתאם לכתב היד המצורף, הכינו שלושה סוגי תמיסות של נוזל חוט ששרירי מלאכותי (artificial cerebral spinal fluid): תמיסת sucrose A-CSF, תמיסת A-CSF להקלטות וולטמטריות ותמיסת A-CSF שונה לכיול אלקטרודות. לאחר מכן, העבירו 10 milliliters של sucrose A-CSF לכלי כימי קטן והניחו אותו בדלי קרח. לאחר מכן, הניחו את דבק ה-Loctite המיידי בדלי קרח.
לאחר מכן, הכין סכין גילוח ואת כלי הנתיצה הנדרשים, כגון פינצטה, שפכטל ומספריים, על ידי ניגובם עם פד אלכוהול. לאחר מכן, בצע השבתה של העכבר באמצעות עקירה (decapitation) והוצא את מוחו במהירות. הנח את המוח בתוך כלי עם סוכרוז קר מאוד, A CSF, למשך כ-10 דקות.
בינתיים, הכינו את ה-VIBRAM לחיתוך. הניחו מעט קרח גרוס באמבט הדגימות. לאחר מכן, הניחו את תא הדגימה ב-Vibram וקבעו אותו בחוזקה.
הוסיפו קרח נוסף מסביב לתא הדגימה כדי למלא את הרווחים, וודאו ששום קרח לא חודר אל תוך התא. לאחר מכן, הכניסו להב תער cleaned razor blade מנוקה למחזיק הלהבים. לאחר מכן, מלאו את תא הדגימה ב-sucrose A CSF קר מאוד.
בשלב הבא, מזגו מעט sucrose A CSF קר על פיסת נייר סופג בתוך צלחת פטרי הפוכה. העבירו את מוח העכבר שנותח זה עתה אל הנייר באמצעות פינצטה. לאחר מכן, הסירו את המוחון על ידי חיתוך לאורך הציר המדיאלי-לטרלי באמצעות להב תער.
פעולה זו יוצרת בסיס שטוח שניתן להצמיד לבמה הרוטטת (vibram stage). לאחר מכן, הוסיפו טיפה של דבק Loctite על במת הדגימה. הצמידו מיד את הקצה השטוח של המוח שהוכן לבמה, ושמרו עליו במצב זקוף ככל האפשר.
לאחר מכן, מקמו את הבמה בתא הדגימה והדקו את הבורג. ודאו שהמוח טבול לחלוטין ב-sucrose A CSF בתוך התא. לאחר מכן, כוון את הבמה באמצעות בקר השליטה כך שלהב התערה יהיה מיושר עם החלק העליון של המוח.
פרמטרים אופטימליים עבור הרעידה מושגים על ידי הגדרת התדר והמהירות לנמוכים. לאחר מכן, הגדירו את עובי הפרוסה ל-400 micrometers. הפרוסות הראשונות בדרך כלל אינן מכילות את הסטריאטום.
חזור על הפרוסות עד לקבלת הפרוסות המכילות את הסטריאטום. ברגע שהגעת לאזור ה-stri AAL, השתמש במכחול כדי להרים את הפרוסה ולהניח אותה בכלי כימי עם CSF בטמפרטורת החדר מחומצן.
בדרך כלל, ניתן להשיג שלושה עד ארבעה פרוסות המכילות את המכלול התת-קורטקלי שבו נכללים ה-caudate putamen וה-nucleus accumbens. יש לאפשר לפרוסות להסתגל ב-A CSF עם בובלינג של 95%O2 5%CO2 בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות לפני המשך בניסוי. כדי להתחיל בהליך זה, חברו את הצינורית לתא ההקלטה השקוע.
לאחר מכן, הזרים את ה-A CSF בחום החדר המוחדר בחמצן בקצב של 1 ml לדקה. כוון את בקר הטמפרטורה ל-32 °C לאחר שה-A CSF מילא את מחזיק הפרוסות המותאם אישית. הסר בועות אוויר שנמצאות מתחת לרשת באמצעות מזרק עם מחט.
צרו לחץ שלילי בצינור היציאה באמצעות מזרק כדי להתחיל את הזרימה לשליטה על גלישת התמיכה (buffer). הניחו נייר סופג (Kim wipe) על קצה מחזיק הפרוסה שישמש כפתיל. לאחר מכן, העבירו פרוסה למחזיק הפרוסות בתא ההקלטה, המוזן ברצף ב-A CSF מחומצן בטמפרטורת החדר.
טבול את אלקטרודת הייחוס מסוג כסף/כסוף כלוריד במחזיק הפרוסות וחבר אותה למגבר הראש באמצעות תפס תנימים. חבר את מיקרו-אלקטרודת סיבי הפחמן למיקרו-מניפולטור וחבר אותה למגבר הראש באמצעות תפס תנימים. לאחר מכן, הורד את אלקטרודת הגירוי העשויה טונגסטן ואת מיקרו-אלקטרודת סיבי הפחמן אל פני השטח של פרוסת מוח החולדה.
האלקטרודה המעוררת תשמש להעברת פולס בודד או פולסים מרובים של גירויים חשמליים לפרוסה כדי לעורר שחרור של מוליכים עצביים, לצורך מדידת דופמין שהושרה חשמלית באמצעות טלמטריית וולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (FSCV), על ידי הפעלת מתח בצורת גל משולש על האלקטרודה. יש להחזיק את הפוטנציאל של מיקרו-אלקטרודת סיב הפחמן על 0.4- וולט. לאחר מכן, יש להעלות אותו במדרגה עד לגבול חיובי של 1.2 וולט.
לאחר מכן, החזירו את המתח ל-0.4- וולט בקצב סריקה של 400 וולט לשנייה. גרו את הפרוסה מדי חמש דקות ובצעו מדידה וולומטרית של ה-dopamine FLX הנובע למשך 15 שניות בכל פעם, לאחר קבלת לפחות שלוש הקלטות יציבות של שחרור דופמין בעקבות גרייה חשמלית, המוגדרות כהפרש של פחות מ-10% בין גבהי השיאים.
עברו לביצוע פרפוזיה של הפרוסה עם CSF המכיל את הסוכן הפרמקולוגי הרצוי בקצב זרימה של 1 mL לדקה למשך 30 דקות, כדי להשיג אפקט מקסימלי הדומה להקלטת הבסיס. בקרו את שחרור הדופמין המעורר חשמלית בכל חמש דקות במהלך הפרפוזיה הפרמקולוגית. איור A הוא דוגמה למדידת שחרור דופמין המעורר חשמלית באמצעות FSCV, בעקבות גירוי פולס בודד ב-caudate putamen.
איור B מציג תרשים בצבעי פסאודו בתלת-ממדי המשלב את המידע הן מעקומות הזרם מול הזמן והן מהוולטמטריה המחזורית. באופן דומה, איורים A ו-C מציגים את שחרור הדופמין שהשרה פולס בודד של גרייה חשמלית בליבה (core) ובמעטפת (shell) של הגרעין האקומבנס, בהתאמה, ותרשימי הפסאודו-צבע התלת-ממדיים עבור ליבת ומעטפת הגרעין האקומבנס מצוינים באיורים B ו-D, בהתאמה. מוצגים כאן עקומות מייצגות לאחר שהפרוסה טופלה בסוכן פרמקולוגי במשך 30 דקות, ולאחריהם גרייות של פולס בודד כדי להשרות שחרור דופמין ב-caudate putamen.
החומרים שנעשה בהם שימוש בניסויים הם quinol, methamphetamine ו-brain derived neurotrophic factor. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הכנת פרוסות מוחיות קורונליות של עכברים לצורך השגה ומדידה של דינמיקה של דופמין פרה-סינפטי באמצעות fast and likely will telemetry.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את השימוש בוולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה למדידת דינמיקה של דופמין טרום-סינפטי בחתכים של המוח מהסטריאטום. התהליך כולל הכנה של רקמת מוח, הצבת אלקטרודות ומתן חומרים פרמקולוגיים כדי לצפות בשחרור וספיגה של דופמין.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- נוירופרמקולוגיה
רקע
- וולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (Fast-scan cyclic voltammetry) היא טכניקה המשמשת למדידת דינמיקה של מוליכים עצביים.
- L-dopa ממלא תפקיד קריטי בתהליכים נוירולוגיים שונים.
- הבנת הדינמיקה הפרה-סינפטית יכולה לספק תובנות לגבי השפעות נוירו-פארמקולוגיות.
- שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על שחרור וספיגה של דופמין.
מטרת המחקר
- להדגמת פרוטוקול למדידת דינמיקה של דופמין בחתכי מוח.
- להערכת השפעות של סוכנים פרמקולוגיים על שחרור דופמין.
- לשיפור ההבנה של מנגנוני דופמין פרה-סינפטיים.
שיטות בשימוש
- הכנת פרוסות מוח קורונליות מרקמת הסטריאטום.
- מיקום אלקטרודות באזור העניין.
- החלת גל מתח משולש לזיהוי דופמין.
- תצפית על שינויים בדינמיקה של דופמין בעקבות טיפול פרמקולוגי.
תוצאות עיקריות
- הוכח שחרור דופמין מושרה כמענה לגירוי חשמלי.
- נקבעו שיעורי ספיגת דופמין באמצעות וולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (fast-scan cyclic voltammetry).
- הודגם השפעם של חומרים פרמקולוגיים על דינמיקה פרה-סינפטית.
- סופקה שיטה מהימנה לחקר תמסורת עצבית של דופמין.
מסקנות
- הפרוטוקול מודד ביעילות את הדינמיקה של דופמין פרה-סינפטי.
- וולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה היא כלי בעל ערך במחקר במדעי העצבים.
- הממצאים תורמים להבנת תפקידו של הדופמין בנוירופרמקולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
וולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (FSCV) מאפשרת מדידה בזמן אמת של דינמיקת דופמין פרה-סינפטית בחתכים של גרעין הסטריאטום במוח, ומספקת רזולוציה רבנית ומרחבית גבוהה לצורך תיקוף יעדים נוירו-פרמקולוגיים. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות קצבי השחרור והספיגה של דופמין בתגובה לסוכנים פרמקולוגיים, דבר המנחה החלטות של go/no-go בשלבים מוקדמים של הגילוי. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במחקרי מעורבות יעד (target engagement) עבור הפרעות במערכת העצבים המרכזית (CNS) המערבות מסלולים דופמינרגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידה של שחרור וספיגה של דופמין המושרים חשמלית באזורים מובחנים של הסטריאטום.
- ערך תפעולי: מספק קריאות כמותיות בזמן אמת של דינמיקת דופמין פרה-סינפטית להפחתת סיכונים במנגנוני מטרה.
- ערך אסטרטגי: תומך בתיקוף מטרות על ידי קישור בין מודולציה פרמקולוגית לשינויים תפקודיים במוליכים עצביים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מאפשר הכנה של בדיקות פרוסות סטריאטום (striatal slice) עובדות עם רזולוציה זמנית של פחות משנייה לזיהוי מוליכים עצביים.
- ערך תפעולי: מספק מדידות הדירות של שטף דופמין באמצעות מיקרו-אלקטרודות סיב פחמן תחת פרפוזיה מבוקרת.
- ערך אסטרטגי: מקיים פלטפורמה ניתנת להרחבה לסריקת השפעות של תרכובות על סיגנלינג דופמינרגי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רלוונטיות למחלה באמצעות בדיקת דינמיקת דופמין בגרעין המצבי (nucleus accumbens) ובגוף הזנב-פוטמן (caudate-putamen), אזורים המעורבים בהתמכרויות ובהפרעות פסיכיאטריות.
- ערך תפעולי: מבטיח רצף תרגומי ממדידות המבוססות על פרוסות רקמה למודלים נוירופרמקולוגיים in vivo.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי כימות שינויים בקינטיקת הדופמין המושרים על ידי חומרים פעילים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
FSCV משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה דרך זיהוי מועמדים (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת מדדים מכניסטיים של תפקוד דופמינרגי.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת השערות באמצעות מדידה בזמן אמת של שחרור וספיגת דופמין מוּספים בנתחים של המוח.
- סריקה: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של הנתחים כיול אלקטרודות לזיהוי עקבי של דופמין.
- אנליטיקה: מייצר משתנים תלויים כמותיים, כולל ריכוז שיא של דופמין, אמפליטודת שחרור וקבועי קצב ספיגה.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול השפעות פרמקולוגיות על דופמין פרה-סינפטי בתתי-אזורים של הסטריאטום.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת הניתנת לשימוש חוזר על פני מחלקות של מטרות ב-CNS הדורשות הערכת שטף דופמינרגי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באותות דופמין.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה והדירות באמצעות פרוטוקולי גירוי מוגדרים ופרופוזיה פרמקולוגית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך/עצירה (go/no-go) על ידי קישור חשיפה לתרכובות לשינויים מדידים בדינמיקת הדופמין.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעוד ותיעדו מותאם סיכונים של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) המבוסס על תיקוף פונקציונלי של מוליכים עצביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנורו-פיזיולוגיה, אלקטרוכימיה והכנת רקמות מוח.
- תלוי בציוד הכולל ויברטום (vibratome), פוטנציוסטט, מיקרו-אלקטרודות מסיב פחמן ומערכות פרפוזיה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של איכות הפרוסות, מיקום האלקטרודות ופרמטרי העירור.
- כולל שיקולי התאמה עבור תת-אזורים שונים של הסטריאטום ומודלים של פרוסות מוח הספציפיים למין.
- כולל מגבלות מעשיות כגון זיהום אלקטרודות (fouling), מגבלות חיוניות הרקמה ואתגרי יחס אות לרעש ברקמה צפופה.
