זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ישירות היפוקסיה של רקמות מיקרו אזוריות בקליפת העכבר in vivo. זה מושג על ידי הכנת חלון גולגולת פתוח בעכבר מורדם. לאחר מכן, צבע פלואורסצנטי מוזרק תוך ורידי כדי לסמן את כלי הדם במוח.

לבסוף, במקביל להדמיית פוטון של הקרינה הפנימית של NADH ומיקרו-כלי הדם בקליפת המוח המסומנת פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות היפוקסיה תפקודית באזורי מיקרו של פרנכימה מוחית באמצעות הדמיה של נוכחות הצורה המופחתת של ניקוטינאמיד, אדנין דינוקלאוטיד. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלקטרודות בסגנון קלארק הוא שהיא נותנת רזולוציה מיוחדת גבוהה על פני שדה הראייה הגדול, והיא גם פחות פולשנית.

ניתן לבצע שיטה זו על מערכת צילום סטנדרטית עם שני תעלות פלורסנט. היי, אני סטיב הרסט, פרופסור וראש המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת רוצ'סטר, שמדגים את ההליך היום הוא בנה של אניטה ממעבדת קישקה, כמו גם אוקסנה פולקה, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי, ד"ר קישקה, חלוצת טכניקת ההדמיה של NADH, לא יכולים להיות כאן היום מכיוון שהוא עבר לאחרונה לגרמניה. לאחר הכנת אתר הניתוח עם המכשירים הדרושים שעברו חיטוי או חיטוי עם 70% אתנול והעכבר הורדם עם 5% איזוף פלואור, הניחו אותו על כרית חימום ומרחו מסכת פנים כדי לספק 1.3 עד 1.5% איזוף פלואור באוויר.

בדוק את רמת ההרדמה על ידי ביצוע צביטת זנב. לאחר מכן, הכנס בדיקה רקטלית ומדוד ברציפות את טמפרטורת הגוף של החיה לאורך כל ההליך. מרחו ג'ל דמעות מלאכותי על עיני העכבר כדי למנוע מהן להתייבש.

לאחר מכן הסר את השיער מהראש ושתי הירכיים מרחו מסיר שיער על הירך למשך שתי דקות כדי להסיר את השיער שנותר, הירך תשמש לחמצון. לבסוף, יש לחטא את הקרקפת באמצעות תמיסת יוד של 10% פובידון ואתנול 70%. כדי ליצור חלון גולגולת החל מחמישה מילימטרים מפונקים לגולגולת במספריים.

בצע חתך בקרקפת והתקדם סנטימטר אחד. הזיזו את העור לצדדים כדי לחשוף את הגולגולת כדי להסיר את הקרומים על גבי הגולגולת. מרחו תמיסת כלוריד ברזל 10%.

נגב את התמיסה העודפת וגרד את הממברנות בזווית של 45 מעלות. מספר חמש, פינצטה בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה, זהה את אזור העניין. מרחו שכבה דקה של דבק מהיר סביב שולי חלון לוחית הראש.

מקם את לוחית הראש בצורה כזו שאזור העניין ייחשף בחלון והפעל לחץ קל על לוחית הראש. מרחו כמות קטנה של מלט דנטלי כדי לפלמר את הדבק במהירות. החזק למשך 10 שניות בזמן שהדבק מתפלמר.

מרחו כמות קטנה של דבק מהיר על שולי החלון כדי לאטום את לוחית הראש והגולגולת. לאחר מכן הברג את לוחית הראש למחזיק החיה מתחת לטווח החיתוך. באמצעות המיקרו מומנט שני מקדחים מוגדרים ב-6, 000 סל"ד ומקדח IRF 0 0 5.

הסר את כל הדבק הנוסף מהגולגולת ומצלחת הראש. לאחר מכן הגדר את המקדחה באלף סל"ד והתחל לקדוח את הגולגולת על ידי יצירת עיגול בתוך חלון לוחית הראש בקוטר של כחמישה מילימטרים. השתמש בתנועות סוחפות קלות כאילו אתה מצייר בעיפרון רך מאוד.

הפסק את הקידוח כל 20 עד 30 שניות והשתמש באוויר דחוס כדי להסיר אבק עצם. ככל שהקידוח מתקדם, נוצרת מחילה סביב הגולגולת השלמה במרכז. הקפד לא לחטט דרך הגולגולת הדקה, אלא לוודא שהמחילה הזו בעובי אחיד.

בנוסף, היזהר במיוחד סביב כלי דם גדולים. אין להתפשר עליהם, ואם אפשר, אפילו לא לגעת בהם עם חוד אחד של פינצטה, הרם את העצם במרכז החלון והחל טיפה של נוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי על החלון. בעזרת פינת מגבון קים, נגב בעדינות את נוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי בזווית של 45 מעלות.

מספר חמש, פינצטה. אתר אזור של דורה פגומה לאורך קצה החלון והרם אותו כדי להסיר אותו. אם מתרחש דימום, יש למרוח טיפה של CSF מלאכותי ולהמתין שתיים עד שלוש דקות עד שהדימום הקל ייפסק.

לאחר מכן, הכינו 10 מיליליטר של 0.07% אוויר נמס נמוך המומס בנוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי. הביאו את האירוס המומס לטמפרטורת הגוף. נגב את עודפי נוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי מפני השטח של המוח.

שפכו את האירוס לחלון וכסו אותו במגלשת זכוכית. לאחר מכן לחץ בעדינות על הזכוכית כדי ליצור מגע בין הזכוכית ללוחית הראש והמתן 10 עד 20 שניות עד שה-aero מוצק. בעזרת פינצטה ונייר טישו רך, הסר עודפי אוויר ממכסה הזכוכית.

שים כמות קטנה של דבק מהיר סביב הזכוכית כדי להדביק אותה לצלחת הראש. לאחר מכן מרחו כמות קטנה של מלט דנטלי כדי למצק את הדבק להזרקה לווריד הירך. הפוך את החיה חלקית כדי לחשוף את החלק הפנימי של הירך השמאלית.

השתמש בסרט כדי לאבטח את החיה. במצב זה יש למרוח קרצוף חיטוי, ולאחר מכן מאה אחוז אתנול על העור. לאחר מכן, בצע חתך לאורך הירך המדיאלית מהברך ועד לסינתזה של הערווה.

במידת הצורך, הפרד את הרקמות הרכות על ידי דיסקציה קהה. מלאו מזרק של מיליליטר אחד ב-130 מיקרוליטר אדום טקסס. חבר מחט חדשה בגודל 30 וכופף אותה בזהירות בזווית של 30 מעלות, תוך שמירה על השיפוע למעלה.

מלאו את המחט בתמיסה אדומה של טקסס תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הכניסו את המחט לווריד הירך והזריקו מאה מיקרוליטר אדום טקסס. הסר את המחט ולחץ קלות על הווריד עם גזה כדי לעצור את הדימום. סגור את העור באמצעות ארבעה תפרים לניטור רציף של ריווי החמצן בדם.

הנח את בדיקת האוקסימטר על הירך הימנית שממנה הוסר שיער בעבר. כדי להתחיל בהדמיה, העבירו את העכבר שהוכן בניתוח לשלב המיקרוסקופ. צלם תמונה ראשונית של אתר חלון הגולגולת באמצעות תאורת שדה בהיר בהגדלה של פי ארבעה כדי להשתמש כמפת ייחוס לרישום עם הגדלה גבוהה יותר לפוטונים.

התקרב לאזור העניין באמצעות הגדלה של פי 10. בחרו אזור עניין בשכבות קליפת המוח. אחד או שניים מתחילים לתעד את סדרות הזמן.

אנו ממליצים להשתמש בממוצע של שלוש עד חמש פריימים כדי לשפר את איכות התמונה. לאחר מכן, לגרום להיפוקסמיה על ידי הוספת 50% חנקן לאוויר שהחיה נושמת. זה יביא את רמת החמצן ל-10%אמת היפוקסמיה על ידי ניטור נתוני האוקסימטר.

המשך לתעד את סדרת הזמן באמצעות היפוקסמיה למשך כ-30 שניות ולאחר שרמת החמצן הרגילה משוחזרת. אסוף נתונים לחישוב התפלגות החמצן על ידי זיהוי, מדידה וכימות של אזור ההיפוקסיה וגלילי הרקמה המחומצנת סביב כלי הדם. כדי לקבוע את רדיוס גליל רקמת הקרואק R, מדוד את המרחק בין מרכז כלי הדם לגבול שבו מזוהה פלואורסצנטיות NADH גבוהה.

עיין בפרוטוקול הכתוב לשיטות עיבוד נתונים. איור זה מציג במקביל NADH תמונות גיאוגרפיות מסרטון שצולם במהלך היפוקסמיה חולפת, ריכוז החמצן בהשראה ירד מ-21% ל-10% למשך שלוש דקות. רמה זו של היפוקסמיה הנגרמת בניסוי מספיקה כדי לגרום להיפוקסיה חמורה בקליפת המוח.

היפוקסיה הובילה לעלייה בפלואורסצנטיות NADH המוצגת בירוק בתחילה באזורים הרחוקים ביותר מאספקת הדם העורקית. שימו לב, גבולות רקמת ה-NADH החדים, המייצגים את גבולות הרקמה הניתנים לצפייה של דיפוזיה של חמצן מהמיקרו-סירקולציה בקליפת המוח המוצגים באדום. הנה תמונה מקבילה של המיקרו-כלים המסומנים פלואורסצנטית של קליפת המוח באדום, והפלואורסצנציה הפנימית של NADH מהחומר האפור של קליפת המוח בירוק, התפלגות עוצמת הקרינה של NADH היא בינארית.

ישנם אזורים עם פלואורסצנטיות NADH נמוכה באופן אחיד ואזורים עם פלואורסצנטיות NADH גבוהה באופן אחיד. הקווים הצהובים מייצגים את גבולות הרקמה בין האזורים עם פלואורסצנטיות NADH נמוכה וגבוהה. גבולות רקמות אלה מציגים קשר מרחבי לכלי המיקרו הסמוכים.

קשר זה נקבע על ידי דיפוזיה של חמצן מכלי המיקרו לרקמה. במקרים מסוימים, ניתן לזהות ישירות את האופי הגלילי או את גליל רקמת ה-CRO של גבולות הרקמות הללו כפי שמצוין על ידי הקווים הכחולים. כאן, גבול הרקמה הוא בעל צורה מעגלית עם כלי דם מרכזי קונצנטרי לאחר שליטה.

טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 1.5 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להדביק את זכוכית הכיסוי ללוחית המתכת כדי למנוע תנועה אנכית של פני השטח בקליפת המוח עקב בצקת. לאחר הליך זה, ניתן לבצע ניתוחים נוספים כגון מדידות של היפרמיה תפקודית במטרה לענות על שאלות נוספות כגון הקשר בין היפוקסיה של רקמות לצימוד כלי דם מוחיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין היפוקסיה של רקמות מיקרו אזוריות בקליפת העכבר.