Name: הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: למד הדמיה אינטרה-ויטלית של קורנית עכבר באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לעקוב אחר התנהגות תימוסיטים ופיתוח תאי T בזמן אמת בחיות חיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר דוד Olivieri לבחינה ביקורתית של כתב היד הזה, ד&quot;ר נונו מורנו על העזרה לוגיסטית לבנות בעל חיים שלנו כריות חימום ד&quot;ר ויג&#39;אי ק Kuchroo על התרומה סוג של Foxp3 KI-GFP / GFP עכברים. עבודה זו נתמכת על ידי &quot;Fundação פסקה Ciência דואר Tecnologia&quot; (FCT, פורטוגל), מענק # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. בעלי חיים הכנה הערות חשובות: המתלים תא רות השתלות הרתי בוצעו בתנאים aseptic. המתלים BM היו מוכנים בתוך מכסי המנוע של החדר שלנו התא התרבות, ואילו השתלת הרתי בוצע בחדר ניתוח הממוקם בתוך מתקן חיה שלנו. על מנת לשמור ולהבטיח תנאים אלו מזוהם, אסור היה להקליט וידאו שלנו במקומות האלה. עם זאת, כל החומרים כירורגית היו autoclaved ואת ספסל כירורגית נוקה בעבר עם Virkon (Pharmacal מעבדות מחקר בע"מ) ו 70% אתנול. כל הנהלים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) והם היו הסכם עם הפדרציה האירופאית של המעבדה אגודות בעלי חיים מדע (FELASA) הנחיות. מספר מזהה האישור AO10/2010. כל הניסויים היו נהלים תמונה מסוף החיות היו מורדמים מיד לאחר תום תמונההרכישה. הנוהל המפורט הוא כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרינים (עם irradiator-γ) 8 שבוע הישן עכברים עירום עם 900 rads להרוס את מבשרי hematopoietic אנדוגני בתוך העצם קישואים (BM). לאחר ההקרנה, להחזיר את החיות בכלובים שלהם עד להכנת תאים מתורם BM להזרקה תוך ורידית והרכבתה מחדש BM נוספת. העברה זו בוצעה BM 1 שעות לאחר ההקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את בעלי החיים תורם BM. Tibias ואת עצמות הירך של הגפיים האחוריות של החיה אחד הם בדרך כלל מספיק כדי לשחזר עד 3 חיות הנמען. לאחר המתת חסד עם CO 2, להסיר את הגפיים האחוריות ולאחר מכן להסיר את העור ואת השרירים מהעצמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצה הסגור של כל עצם ולשטוף אותו עם PBS (או RPMI) או לרסק את כולם במכתש, באמצעות העלי, עם 2 מ"ל של PBS (או RPMI) כדי להסיר את BM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את המבנה BM ההשעיה לתוך תא בודד על ידי חזרות של שאיפה נמרצת USIng פיפטה P1000. לחלופין, ניתן גם להעביר את BM ברחבי מחט מזרק 21G מספר פעמים. צנטריפוגה (400 גרם, 5 דקות, RT), מחדש תאים להשעות PBS, וכן להזריק לווריד אל הנמענים עירום מוקרן שלך. בניסויים שלנו השתמשנו BM מ Foxp3 KI-GFP / עכברים GFP שבו כל התאים T רגולטוריים (Tregs) תביע GFP 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבלה של BM התורם מתרחשת בימים הראשונים לאחר ההעברה, שכן אי - BM-מחדש חיות לא יכול לשרוד יותר מ 14 ימים. עם זאת, יש לחכות 4 עד 6 שבועות על מנת לאפשר התאוששות מלאה של כל התאים BM. Bactrim (Roche) נוספה המים (2 מ"ג / מ"ל) במהלך השבוע הראשון לאחר קרינה כדי להקטין את הסיכון לזיהומים חיידקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התימוס עובריים להשתלה תוארה כבר 2. בקיצור, להתחיל הרבייה זוגות של עכברים isogenic ולבדוק חיבור (עדות משגל) בכל יום. הפרד פקוק נקבות CO 2-להרדים אותם ביום 15 של pregnancy (תצפית של התקע יום 1 של ההריון). הסר את העוברים ואת thymuses. מניחים את thymuses עובריים בקור PBS עד ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע את השתלת thymuses, להרדים BM-הנמען עכברים עירום עם ketamin (120 מיקרוגרם / גרם של משקל העכבר) / xylazine (16 מיקרוגרם / גרם של משקל העכבר) ולשמור אותם על גבי כרית חימום על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מקבלים מודע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניתוח חושפים את הכליות לבצע את השתלת thymuses. ראשית לשפשף את העור עם ChloraPrep (Carefusion Inc) ואתנול 70%. ואז, לעשות 1 ס"מ לחתוך על העור החלק האחורי לרוחב הגוף של החיה, 2 מ"מ לשאוג הצלעות החזה שעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את חלל הצפק ולשלוף את הכליה של חלל זה. ביצוע חתך שטחי קטן הקפסולה כליות עם להב אזמל. בעזרת מלקחיים עם קצה דק מאוד לעשות כיס מתחת הקפסולה כליות של העכבר הנמען להוסיף עד 4 האונות הרתי לתוך כיס זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את b כליה ACK למקומה, תפר את חלל הצפק עם אחד או שני תפרים, ולאחר מכן לסגור את העור עכבר בשיטת תפר אותו. לחלופין, התפרים ניתן לעשות זאת באמצעות דבק כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק משכך כאבים (Butorphanol על 5 מ"ג / ק"ג) תת עורי מיד לאחר שסיים את הניתוח כדי למנוע כאבים בעלי חיים לשמור על בעלי החיים כרית חימום עד שהם מתחילים להתאושש מן ההרדמה. עכברים הם בכלוב בנפרד במשך 3 הימים הראשונים לאחר ההשתלה, כדי למנוע חבריהם לכלוב להסיר את התפרים. הסרת תפרים אחרי שבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים עירום אין ותאי T. לכן, אתה יכול להעריך את קבלת שוחד התימוס ידי ניטור אחוז CD4 + או CD8 + T תאים בדם. פעם בשבוע, 2 שבועות לאחר השתלת התימוס, לדמם את החיות ואת כתם הדם עם אנטי CD4 ו - CD8 אנטי נוגדנים חד שבטיים (מבז). כאשר CD4: CD8 היחס הוא בערך 2:01, התימוס המושתל היא מתפקדת במלואה (איור 1). </li></ol>"&gt; 2. תמונה Intravital רכישה הכינו את כל החומרים תצטרך מראש ולשים אותם בצד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חיות עם ketamin / xylazine (במינונים אותו תיאר פריט 1.5) ומניחים אותם על גבי כרית חימום על 37 ° C. להזריק 100 μl של Rhodamine isothiocyanate B-dextran (20 מ"ג / מ"ל ​​PBS) לווריד כדי לאפשר ראיה עתידית של זרימת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הכליה שמכיל את התימוס המושתל לפי הפרוטוקול שתואר לעיל ב 1.6 פריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע את הכליה לשוב למקומו המקורי, סגור את הצדדים לרוחב החתך בעור עם תפרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פיסת צמר גפן ספוג PBS על החלק העליון של האיבר כדי לשמור אותו לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את כרית החימום על גבי הבמה החיה מחזיק (איור 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את חיה על גבי כרית חימום בעל חיים, עד איבר (תרשים 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורט האיבר בבית הצדדים עם מלחציים מ 'ade של רדיד אלומיניום דק (איור 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את מחזיק בעלי חיים במקום בדיקה החימום העליון קרוב ככל האפשר לרקמות שלכם (איור 2 ד). זו בדיקה מחמם כל הזמן מודד את הטמפרטורה איבר ושולח את המידע הזה מחמם כדי להתאים את הזרם החשמלי, שמירה על אותה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS כותנה ספוג ולהוסיף נמוכה ההיתוך agarose (2% ב PBS) בשעה 30 ° C על גבי הכנה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את כל ההכנה עם דוד העליון (2E איור). בשנת הצמצם על תנור זה יש לבודד את coverglass agarose מן המטרה (תרשים 2F). צג ההרדמה העכבר להזריק דחיפה חצי מנה כל 40 דקות. לאחר רכישת התמונה, להרדימו עם CO 2. </li></ol> הערה: התמונות של קליפ רדיד האלומיניום ואת החימום העליון מוצגים באיור 3. 3. שני פוטונים הדמיה רכישה השתמשנו זקופה "Prairie Ultima XY" שני הפוטונים מיקרוסקופ. המערכת שלנו מצוידת טי: ספיר לייזר, ארבעה PMTs העליון עד 4 רכישות סימולטני ערוץ 20x טבילה במים אובייקטיבי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את טי: ספיר לייזר ומערכת מיקרוסקופ כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מראות dichroic וקובע לסנן על פי אורכי הגל הרצוי. במקרה שלנו השתמשנו בעל Olympus-BX2 Chroma המכיל מראה 565 ננומטר dichroic, אחד ננומטר 525/50 המסנן (עבור אות Foxp3-GFP), ואחד ננומטר לסנן 595/50 (עבור אות dextran-Rhodamine-B בתוך כלי הדם ). טווח אורכי גל הלייזר היה בשימוש בין 880-900 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את בעל החי המיקרוסקופ, לחבר ולהדליק את כל התנורים, להוסיף מים על הצמצם החימום העליון, התחתון את היעד בקפידה לתוך המים, ולהתמקד כלי או GFP-Tregs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם X מיקרוסקופ, y, z בקרה חיצונית, סקר במהירות את הרקמה לאתר האזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הרווח על PMTs כדי לייעל את הפרדת צבעים ולהקטין את כמות לייזר הנדרש כדי להשיג אות מספיק על הרקע. נסה להשתמש בכמות מינימלית של לייזר כדי למנוע צילום של הנזק לרקמות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר באזור האינטרסים ממוקם, להתחיל זמן לשגות הדמיה. במקרה שלנו, 5D טיפוסי (x, y, z, t, וצבע) פרוטוקול הרכישה מורכבת של רכישת תמונות רציפים של נפח מיקרומטר עומק 50 רקמות, מחולק 4.0 מיקרומטר Z-צעדים, x ו-y באורך של 140 מיקרומטר כל אחד מהם. כל כרך לוקח בערך 30 שניות להירכש. לכן, 60 רכישות יבצע סביב 30 דקות הרכישה של התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הנתונים אל השרת מוסדיים להשתמש ImageJ, Imaris, או תוכנה Volocity לבצע רב מימדי עיבוד ומעקב אחר תא. </li></ol> 4. נציג תוצאות g1.jpg "/&gt; באיור 1. . עובריים קבלה התימוס ותפקוד לאחר BM להתאושש, thymuses עובריים הושתלו לחיות מחדש BM, שבועיים לאחר השתלת התימוס, עכברים אלה היו דימם פעם בשבוע כדי לפקח על אחוזי תת תא T על ידי מכתים עם אנטי CD4 או אנטי CD8 מבז. שקלנו התימוס התקבלה בהצלחה בחיות עם CD4: CD8 יחס סביב 1.5-2.0:1 (A). כדי לאשר את הפונקציונליות שלו, הקרבנו כמה התימוס-המושתלים בחיות לעומת אחוז subpopulations thymocyte שונים עם עכברים WT (B). אחוזי פעמיים שלילי (DN; CD4 - CD8 - thymocytes) subpopulations (על ידי מכתים עם אנטי CD25 אנטי CD44 מבז), פעמיים חיובי (DP; CD4 + CD8 + thymocytes) ו יחיד חיובי (SP) CD4 + או CD8 + thymocytes היו דומים בין בעלי החיים האלה. ig2.jpg "/&gt; באיור 2. בעל הרכבה בעלי חיים. בהרדמה לאחר עמוק, החיה הוא הניח על גבי כרית חימום, רכוב קודם על גבי הבמה בעל חיים (א). כליות המכיל את בלוטת התימוס המושתל הוא פונה כלפי מעלה (B). מהדק נייר אלומיניום צובט בעדינות את הכליה כולה (ג) כדי לשמור אותו במקום. איור. 1C להכניס מראה בפירוט את מהדק. החלק העליון של בעל חיים היא לשים במקום (ד '). כותנה PBS ספוג מוסר מהחלק העליון של האיבר, הוחלף על ידי חם נמוך ההיתוך agarose, ואת החימום העליון מתווסף (E). לבסוף, הרכבה כולו מועבר המיקרוסקופ, כאן מיוצג על ידי המטרה (F). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> באיור 3. פרטי בעל חלקים. אלה תמונות להראות את רדיד אלומיניום מהדק (א) מחזיק את הכליה (B). שים לב גם את האזור שבו ממוקם התימוס המושתל. זה בערך מציין את האזורלחתוך את קפסולת התימוס ולעשות את כיס לשים את התימוס עובריים. Coverglass דוד העליון (C) היה קבוע עם דבק סיליקון בחלקו התחתון (ד '). סרט 1. הדמיה Intravital של Foxp3-GFP + thymocytes בתוך התימוס שבו רמות פיזיולוגיות של חמצון וטמפרטורה (37 ° C) הוחזקו במשך כל התהליך. שים את זרימת הדם ואת תנועת Tregs. מהירויות אלו ניתן למדוד בהשוואה לנתונים שפורסמו. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">לחץ כאן כדי להציג את הסרט.</a> סרט 2. Intravital הדמיה של Tregs בתוך התימוס שם את התמונות נרכשו על 30 ° C. הערה היעדר התנועה ואת הצורה העגולה של התאים למרות לשמירה על זרימת הדם. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">לחץ כאן כדי להציג את הסרט.</a>

<ol><li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li>
<li>Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamsdell%2C+F+%22Current+protocols+in+immunology%22">Current protocols in immunology</a>. Coligan, J. E. , (2006).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4%2B+T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li>
<li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li>
<li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li>
<li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

במאמר זה הראינו את ההליכים עבור הדמיה של שני הפוטונים thymocytes בתוך החי. אנחנו גם תיאר כמה פרמטרים שצריך לשלוט היטב, כגון המשך זרימת הדם ושמירה על טמפרטורה איבר במהלך ההליכים הדמיה. עם זאת, למרות מאמצי זהיר כדי לשמור על איבר יציב, ההצעה artifacts כגון &quot;האיבר נסחף&quot; יכול להתרחש. תיקון תמונה Posterior יכול להתבצע על ידי פיתוח אלגוריתמים שתוכננו במיוחד למטרה זו. ניתוח התמונה בהמשך יכול להיות גם מקור פיתוח פרוטוקולים חדשים המבקשת למזער טעויות. התימוס הוא האיבר שבו כל ותאי T מיוצרים, ולכן הוא האיבר שבו אימונולוגים מעוניינים להבין את הדור של γδ, CD4 או CD8 ותאי T ימקדו את תשומת הלב שלהם. רוב המחקרים הנוגעים בתאי T מבוססים על הבדלים במספרים ו / או יציבות של אלה גאמות אחרי שונים במבחנה / ב המניפולציות vivo. עם זאת, רק לאחר להדמיה vivo ב יכולנו לראות את האינטראקציה בין תאים של המערכת החיסונית מעורב בשמירה על הומאוסטזיס 3-7. לכן, בהתבוננות vivo של thymocytes הוא כנראה אחד המידע החסר החשוב ביותר כדי להבין טוב יותר בביולוגיה של התא טי. Intravital TPM מספק תמונה מפורטת של התנועות והאינטראקציות תא T ואנחנו להדגים כאן כיצד ניתן להשתמש בו ללימודים thymocyte מפורט. עם זאת, כל טכניקה יש מגבלות. בעוד intravital הרכישה היא מערכת הדמיה מדויקת ביותר המשקף התנהגות תאים בתוך הגוף, זה גם נכון, כי רכישת תמונה explanted האיברים הוא מייגע פחות נעשה שימוש כדי לאסוף מידע חשוב על המערכת החיסונית 8,9. יתר על כן, אחד לא יכול להכחיש שיטות הדמיה intravital דורשים ניתוח לחשוף רקמות וכלי דם אצל בעלי חיים מרדים,אשר כשלעצמה יכולה לגרום שינוי באיבר כולו הפיזיולוגיה 10. עם זאת, ישנם הלא פולשני שיטות לבטל את החפצים הנגרמת על ידי ההליך הכירורגי 11 ושיטות חדשות מפותחים כי עדיף להכין מראש את בעלי החיים כדי לשמש 12. לפיכך, פעולות כירורגיות חדשים אגרה יהיה למזער או לעקוף מגבלות בפועל של רכישת הדמיה intravital ולהיות יותר ויותר נגיש הקהילה המדעית. אנחנו הוכיחו כי השיטה שתיארנו אינו ריאלי והוא מדווח כל המניפולציות מערכתית vivo, והתרופות כאלה, השתמשנו. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש בשיטה זו, יחד עם טכניקות vivo לשעבר כבר זמין על מנת להשלים ולחזק מחקרים נוספים בדבר התפתחות thymocytes.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><thead><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rhodamine ishothiocyanate B-dextran </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> להכין מלאי ב 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> שני הפוטונים מיקרוסקופ </td><td> בערבה טכנולוגיות בע&quot;מ </td><td> בערבה Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> טי: ספיר לייזר </td><td> קוהרנטית, Inc </td><td> Chameleon משפחה Ultra </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 NA אובייקטיבי טבילה </td><td> אולימפוס בע&quot;מ </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> מחזיק (פילטרים / dichroic) </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> 91018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 מסנן </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 מסנן </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 ננומטר dichroic </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris תוכנה </td><td> Bitplane AG בע&quot;מ </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer בע&quot;מ </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, ארה&quot;ב </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

שני הפוטונים מיקרוסקופית (TPM) מספק רכישת התמונה באזורים עמוק בתוך רקמות ואיברים. בשילוב עם פיתוח כלים חדשים stereotactic ניתוחים, TPM הופך טכניקה רבת עוצמה כדי לזהות &quot;נישות&quot; בתוך איברים במסמך הסלולר &quot;התנהגויות&quot; של בעלי חיים. בעוד הדמיה intravital מספק מידע דומה בצורה הטובה ביותר את התנהגות הסלולר אמיתי בתוך איבר, זה גם מייגע יותר תובענית מבחינה טכנית מבחינת ציוד / ההליכים הנדרשים מאשר אלטרנטיבה לרכישת לשעבר הדמיה vivo. לפיכך, אנו מתארים הליך כירורגי הרומן איבר &quot;stereotactic&quot; בעל המאפשרת לנו לעקוב אחר תנועות Foxp3 + תאים בתוך התימוס. Foxp3 הוא רגולטור עבור הדור של תאים T רגולטוריים (Tregs). יתר על כן, תאים אלה יכולים להיות מסווגים על פי מוצאם: כלומר. התימוס, הבדיל Tregs נקראים &quot;טבעיים המתחוללים Tregs&quot; (nTregs), כמו opposed אל שולי המרה Tregs (pTregs). למרות כמות משמעותית של מחקר דווחה בספרות לגבי הפנוטיפ ופיזיולוגיה של תאים אלה T, מעט מאוד ידוע על יחסי הגומלין שלהם vivo עם תאים אחרים. מחסור זה עשוי להיות בשל העדר של טכניקות שיאפשרו תצפיות כאלה. פרוטוקול המתואר במאמר זה מספק תרופה למצב זה. פרוטוקול שלנו מורכב באמצעות עכברים בעירום כי חוסר התימוס אנדוגני מכיוון שיש להם מוטציה דייקן ברצף ה-DNA כי הפשרות הבידול של חלק מתאי האפיתל, כולל בתאי אפיתל הרתי. עכברים עירום היו גמא מוקרן ו מחדש עם קישואים העצם (BM) מעכברים Foxp3 KI-GFP / GFP. לאחר התאוששות בע&quot;מ (6 שבועות), כל חיה קיבלה עובריים התימוס השתלת כליה בתוך הקפסולה. לאחר קבלת התימוס (6 שבועות), החיות היו מורדמים, כליות המכיל אתהתימוס המושתל נחשף, קבוע בעל איבר שלנו, וכל הזמן תחת תנאים פיסיולוגיים עבור הדמיה in vivo על ידי TPM. אנחנו משתמשים בגישה זו כדי לחקור את ההשפעה של תרופות הדור של תאים T רגולטוריים.

פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של &quot;נישות&quot; בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

מיקרוסקופיה דו-פוטונית (TPM) מאפשרת רכישת תמונות מאזורים עמוקים בתוך רקמות ואיברים. בשילוב עם הפיתוח של מערכות סטריאוטקטיות חדשות...

מיקרוסקופיית שני פוטונים מאפשרת רכישת תמונות באזורים עמוקים בתוך האיברים. העירור של חלבונים פלואורסצנטיים במיקרוסקופיית שני פוטונים מושג כאשר שני פוטונים בעלי אנרגיה שווה בקירוב מגיבים עם המולקולה, ובכך יוצרים עירור השקול לספיגה של פוטון בודד בעל אנרגיה כפולה. לכן, במיקרוסקופ שני פוטונים נעשה שימוש בלייזרים באינפרא-אדום, המאפשרים רכישת תמונות ברקמות עבות תוך מזעור של פוטו-بلیצ'ינג (הלבנה פוטונית) ונזק פוטוני.בנוסף, מכיוון שהעירור מוגבל למישור המוקד, אין פלואורסצנציה מחוץ למיקוד. בשילוב עם כלים סטריאוטקטיים והליכים כירורגיים חדשים, זוהי טכניקה רבת עוצמה לתיעוד התנהגויות תאיות בבעלי חיים חיים. במאמר זה, נעשה שימוש במיקרוסקופיה דו-פוטונית כדי לרכוש תמונות intra vital של התימוס.באיבר זה מתרחש הבשלת תאי T, ולכן טכניקה זו עשויה להיות מועילה במחקרים העוסקים בהתפתחות תאים אלו. כעת נתחיל בפרוטוקולים. ראשית, כדי להכין את בעלי החיים, הקרינו בעלי חיים נקיים (nude animals) בני שמונה שבועות ב-900 rads. לאחר ההקרנה, החזירו את בעלי החיים לכלוב עד להעברת מחית העצם.להכנת תרחיף מח העצם, לאחר הדומיה של עכברי התורמה באמצעות פחמן דו-חמצני והסרת הגפיים האחוריות, מסירים את העור והשרירים מהעצמות ושומרים אותם ב-PBS. מעבירים את העצמות לפיתריה חדשה המכילה PBS. חותכים את קצות העצמות.מלאו מזרק ב-PBS ושטפו את העצמות באמצעות מחט בכיול 25 gauge. לחלופין, העבירו את העצמות למכתש ורסקו אותן בעזרת פסטל, והומוגניזרו את מחלק העצם באמצעות פיפוט נמרץ וצנטריפוגה של התוך למשך חמש דקות ב-400 G. Resus.השעו את התאים ב-PBS והזריקו אותם לווריד של העכבר שהוקרן. מחלה של מחלקת גרעין הרך מתרחשת במהלך הימים הראשונים לאחר ההעברה. מאחר שהם אינם משוערים על ידי 10 pl, העכברים מתחילים למות 10 ימים לאחר ההקרנה.עם זאת, אנו ממתינים שש עד שמונה שבועות כדי להחשיב את בעלי החיים כבעלי רקוסטיטוציה מלאה. להמשך הכנת בעלי החיים, ארבעה עד שישה שבועות לאחר העברת מחלק ה골שחור (bone marrow), תבוצע השתלה של תימוס עוברי כדי לאפשר תצפית על תימוציטים in vivo.ראשית, לאחר המתילת נקבות ההרה ביום 15 באמצעות פחמן דו-חמצני ואיסוף העוברים, יש להוציא את התימוס של כל עובר ולהניחם בצלחת עם PBS קר עד לשימוש. הרדימו את בעלי החיים המקבלים באמצעות קטמין וקסילזין, והשאירו אותם על משטח חימום. כאשר בעל החיים מורדם עמוק, שטפו את האזור באתנול. חתכו את העור, חתכו את קרומי הפריטונאום, ואתרו וחשפו את הכליה.לאחר חשיפת הכליה, בצעו חתך קטן בקפסולת הכליה וצרו כיס תחתיה. הוסיפו את התימוס העוברי לתוך כיס זה. לבסוף, החזירו את הכליה למקומה המקורי וסגרו את חלל הפריטונאום ואת העור.במקרה של תפרים, על בעל החיים לקבל משככי כאבים ולהונח על משטח חימום עד תחילת ההתאוששות מחומרי ההרדמה. ניתן לעקוב מדי שבוע אחר היחס בין תאי CD4 חיוביים לתאי CD8 חיוביים באמצעות ניתוח דגימות דם. בעלי חיים עם יחס של כ-1.521 קיבלו את התימוס.האחוזים של אוכלוסיות התאים בטימוס המשת transplanted thymus דומים לאחוזים שנמצאו בטימוס אנדוגני של חיות ביקורת. הדמיה תוך-חיה (intravital imaging) של הטימוס המשת תדרוש ניתוח חדש בבעל החיים ושימוש במכשיר ההחזקה שלנו לבעלי חיים. ראשית, מזריקים ketamine, xylazine וחומרי הרדמה.ברגע שהבעל חיים אינו בהכרה, הניחו אותו על גבי מדפנית חימום. מזריקו לו ורידית Rodin b isothiocyanate dextran כדי לאפשר תצפית עתידית על זרימת הדם ברקמה. פתחו את העור ואת חלל הפריטונאום כדי לחשוף את הכליה המכילה את התימוס המושתל, כדי למנוע מהכליה לחזור למקומה המקורי.סגרו את הצד הלטראלי של חתך העור באמצעות תפרים. העבירו את בעל החיים למשטח החימום שמעל למעמד החיות. צבטו את שני צדדיו של הכליה.השתמשו בתפסן העשוי מרדיד אלומיניום. סגרו את מחזיק בעל החיים והניחו את המחמם העליון. קרבו את הפרובה ככל האפשר לרקמה.הוסיפו אגאר בעל נקודת התכה נמוכה מעל לדגימה. כסו את כל ההכנה במחמם העליון. עקבו אחר ההרדמה ותנו מנות דחיפה של חומר ההרדמה מדי 40 דקות.לאחר סיום הניתוח, מועבר כל המערך למיקרוסקופ דו-פוטוני לצורך רכישת הדמיאות. במקרה שלנו, השתמשנו במיקרוסקופ דו-פוטוני Prairie Ultima המצויד בלייזר sapphire tie, בארבעה PMTs ובעדשת immersion במים 20x. ראשית, הפעילו את הלייזר ואת המיקרוסקופ.לאחר מכן, הוסיפו מראות RIC ומערכות מסננים בהתאם לאורכי הגל הרצויים. הניחו את בעל החיים במיקרוסקופ. חברו את כל רפידות החימום לבקרי השליטה שלהן.הוסיפו מים מעל פתח המחמם העליון, והנמיקו בזהירות את העדשה לתוך המים. התמקדו בכלי דם או באזורים בעלי GFPT באמצעות בקר ה-XY, Z החיצוני. אתרו במהירות את אזור העניין.כווננו את ההגבר (gain) ב-PMTs כדי למקסם את הפרדת הצבעים ולמזער את עוצמת הלייזר הנדרשת להשגת אות מספיק מעל הרקע. לאחר איתור אזור העניין, התחילו ברכישת דימות time-lapse על ידי רכישה רצופית של תמציתי נפח רקמה בעומק 50 micrometer בהגדרות הבסיסיות שלנו. רכישת כל נפח אורכת 30 seconds.לפיכך, זמן רכישת תמונה של 30 דקות מושג לאחר 60 חזרות רצופות של נפח זה. סרטון זה מציג תאים חיוביים ל-GFP בתוך התימוס. שימו לב לתנועת התאים ולזרימת הדם בתוך כלי הדם.עם זאת, אם ההכנה אינה טובה, במקרה זה טמפרטורת האיבר תהיה נמוכה. התאים יפסיקו לנוע גם כאשר זרימת הדם נמשכת. השיטה המתוארת כאן מאפשרת תצפית בתזרימיה (thymocytes) ב-ViiV.שיטות אלו יהיו מועילות מאוד עבור כל אימוןולוג המעוניין לצקת את התפלגות הת'ימוציטים והאינטראקציות ביניהם במהלך התפתחות תאי T; עם זאת, למרות פשטותן, יש להקפיד על מספר שלבים כדי למנוע ארטיפקטים ניסיוניים. לדוגמה, יש להקפיד שלא לפגוע בכלי דם כלשהם, שכן הדבר יפחית את החמחמון בתוך הרקמה. כמו כן, יש לשמור על טמפרטורה של 37 Celsius degree לאורך כל הזמן.לבסוף, התוצאות שהושגו כאן צריכות להיות יעילות מאוד לתיקוף של כל תוצאה אחרת שהושגה באמצעות טכניקות x vivo.

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שני הפוטונים הדמיה חשף תנועתיות הלימפוציטים אינטראקציות הסלולר בתוך הצומת לימפה בתנאי הבסיס, במהלך תגובה חיסונית 1. הנה, אנחנו מדגימים העברת המאמצת של תאים T, בידוד של בלוטות הלימפה, ועל תנועתיות הדמיה של CD4 + T תאים בתוך הצומת לימפה explanted.

Dissection ו 2-Photon הדמיה של בלוטות לימפה הפריפריה עכברים

אנו מציגים צעד אחר צעד הוראות עבור הדור של מפלצות הילוד וכן לנתיחה והכנת התימוס עבור vivo לשעבר הדמיה על ידי מיקרוסקופית 2-פוטון.

בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת...

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

Source: Nishimura, C. et al. כימות של ארכיטקטורת כלי דם מוחיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית במודל עכבר של דלקת עצבית הנגרמת על ידי HIV. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את ההדמיה in vivo של נימים בקליפת המוח במוח העכבר באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. הוא מתאר את השלבים להזרקת צבע פלואורסצנטי לעכבר מורדם עם חלון קליפת המוח דק הגולגולת, הכנת ההתקנה להדמיה ורכישת תמונות מפורטות של מבנים מיקרו-וסקולריים במוח לניתוח.

 מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיה In Vivo של מיקרו-כלי דם במוח העכבר 

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

המטרה של הפרוטוקול היא להציג האורך intravital מעקב בזמן אמת אחר thymocytes על-ידי סריקת מיקרוסקופ ב שתלים הרתי בתא הקדמי של העין עכבר לייזר. את השקיפות של הקרנית, אמוניה השתל מאפשר הקלטה ברציפות קדמון תא גיוס ויציאה T-cell בוגרת.

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע שני הפוטונים intravital הדמיה ותא ניתוח אינטראקציות בין רירית והכו אותי מאתר לאחר ההדבקה בנגיף שפעת. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי עבור החוקרים ללמוד את הדינמיקה תא החיסון במהלך זיהומים בדרכי הנשימה.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך רדיולוגיה התערבותי שנקבע להזרקה תוך-תימית בעכברים כדי למנוע את הסיכון לניתוח פתוח ולשפר את הדיוק של זריקות מלעוריות עיוורות.

טכניקה זעיר פולשנית, מדויקת ויעילה להזרקה תוך-תימית בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

מחקר זה מציג גישת הדמיה דו-פוטונית ב-in vivo להמחשת המבנים של טרמינלי אקסון בעלי סף נמוך (LTMR) בעור כף הרגל הקדמית של עכברים. באמצעות דימות חוזר ברזולוציה גבוהה של אקסונים בודדים, שיטה זו מספקת פלטפורמה חדשה לחקר מבנה ותפקוד המעגל החישי העור במהלך ההתפתחות ובמבוגרים.

הדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים של מורפולוגיית אקסון חושי במגע בעור עכבר

למד הדמיה אינטרה-ויטלית של קורנית עכבר באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לעקוב אחר התנהגות תימוסיטים ופיתוח תאי T בזמן אמת בחיות חיות.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

גלה סרטונים נוספים