ויזואליזציה של כלי דם Ca ^{2 +} איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין איתות סידן בכלי הדם המופעל על ידי מיני חמצן תגובתיים שמקורם בפריקריני או r os. זה מושג על ידי הדמיה ראשונה של R os באמצעות צבעים רגישים לחמצון במקרופאגים פעילים. ניתן לדמיין ROS גם בתאי אנדותל באמצעות חיישני פלורסנט מבוססי פלסמיד.

לאחר מכן המשך לדמיין בו זמנית מעקב אחר תאים, מקרופאגים מופעלים עם תווית אדומה ושפעת של ארבעה תאי אנדותל מסומנים במודל תרבית משותפת. לבסוף, מדוד את איתות הסידן בתאי אנדותל המופעלים על ידי מקרופאגים שמקורם ב-R os. על ידי שימוש במערכת הדמיה קונפוקלית.

תוצאות אלו יכולות להדגים רמות R os באופן עצמאי וכן להעריך בו זמנית ניוד סידן תוך תאי המופעל על ידי ROS שמקורו ב-Peregrine. שיטה זו מאפשרת הערכה בו זמנית של שתי מולקולות איתות שונות המעוררות באופן אינטימי איתות כלי דם וסביבה פתופיזיולוגית של סימולטור. שני פוסט-דוקטורנטים במעבדה שלי, Karthik ו-Raj ידגימו את ההליך על מדידות גולמיות וסידן ואינטראקציות בין תאי אנדותל מקרופאגים.

מקרופאגים שמקורם במונוציטים של עכברי תרבות על תחתית זכוכית של 35 מילימטר. לאחר מכן אתגרו את התאים עם אגוניסטים לקולטן דמויי טול ודגרו במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. להדמיה של הציטוזולי.

ROS מוסיפים צבע רגיש לחמצון ודוגרים על התאים למשך 20 דקות. כעת דמיין את התאים בשלב מבוקר טמפרטורה של מערכת הדמיה קונפוקלית. לחלופין, כדי לדמיין ROS מיטוכונדריאלי בתאים המופעלים על ידי TLR, הוסף את מחוון הסופראוקסיד המיטוכונדריאלי ודגירה על התאים למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לבקרה שלילית, טפל בתאים עם PBS או DMSO לבקרה חיובית. טפל בתאים עם שני אנטימיצין מילי-מולרי. המשך להמחשת כל התאים בשלב מבוקר הטמפרטורה של מערכת הדמיה קונפוקלית.

באמצעות תוכנת image J, נתח את כל נתוני התמונה. החיישן הפלואורסצנטי חש באופן ספציפי ריכוזים תת-מיקרומולריים של מי חמצן ובהתבסס על ביטוי יונקים, ניתן למקד את תכנון הווקטור לציטופלזמה או למיטוכונדריה. באמצעות אלקטרופורציה, צור קווים יציבים של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים של עכברים הנושאים פלסמיד ביטוי יתר לא מתאים.

כדי להקל על תאי צלחת צמיחת המושבה בצפיפות נמוכה ב-TMEM מלא ולדגור למשך 48 שעות, החלף את המדיום במדיום תרבית שלם בתוספת אנטיביוטיקה מובחרת. מסננים שיבוטים עבור האחוז הגבוה ביותר של תאים היפר-חיוביים ומגבירים את התרבית כדי ליצור קווים היפר-חיוביים יציבים בניסויים בודדים. תאי זרעים בציפוי ג'לטין 0.2% מחליקים ותרבית בן לילה למפגש של 80%.

כעת הפעילו את התאים עם ליגנדים TLR ודגרו במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לזיהוי ROS ציטופלזמי, הרכיב את החלקות הכיסוי של התאים על תא תאי אדלו. הוסף מיליליטר אחד של מיכלים מחוממים מראש, איזון תמיסת מלח והנח את החדר על שלב מבוקר טמפרטורה של מערכת ההדמיה הקונפוקלית.

רשום שינויים פלואורסצנטיים בתאים לזיהוי מיטוכונדריה. רוס. כלול בקרה חיובית של שני אנטימיצין מיקרומולרי A.לאחר מכן הכן את החלקות הכיסוי של התאים המטופלים למיקרוסקופיה קונפוקלית. בצע ניתוח תמונה באמצעות תוכנת image J.

התחל עם תאי אנדותל שגדלו ל-80% מפגש על החלקות כיסוי זכוכית מצופות ג'לטין להדמיה ומדידה של שינויים בסידן תוך תאי. דגרו תאים בשפעת הצבע הפלואורסצנטי בשעה 4:00 בבוקר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי למזער את אובדן הצבע שטפו תאים עם תמיסת הדמיה ניסיונית המכילה אזור סואן פירו. כעת מכסה הרכבה מחליק על תא תאי אדלו ב-800 מיקרוליטר של תמיסת הדמיה ניסיונית מחוממת מראש ומקם את התאים על שלב מבוקר טמפרטורה של מערכת ההדמיה הקונפוקלית בצינור נפרד.

השתמש ב-500 ננוגרם למיליליטר של גשש תאים אדום C-M-T-P-X למשך 15 דקות כדי לתייג את אוכלוסיית המקרופאגים הנחקרת, לשטוף תאים ולהשעות מחדש כדורים ב-200 מיקרוליטר של תמיסת הדמיה ניסיונית. עכשיו הוסף את המקרופאגים המסומנים על שפעת הו 4:00 בבוקר טעון. תאי אנדותל במכלול התא הקונפוקלי רושמים את הקרינה הירוקה והאדומה כל שלוש שניות למשך 10 דקות.

בניסוי זה, תאי J 7 74 0.1 אותגרו עם TLR שניים, שלושה וארבעה ליגנדים במשך שש שעות. תמונות קונפוקליות מייצגות מראות R os ציטוזולי מוגבר כפי שנמדד על ידי DCF. מעניין שגרבי מיטוזות פלואורסצנטיות אדומה מעידה על עלייה דומה ב-ROS המיטוכונדריאלי.

שינויים פלואורסצנטיים אלה הם כמותיים. לפיכך יש לנרמל את התוצאות ולבטא אותן כשינוי קפל יחסי לכל טיפול, אות האנטימיצין A מאמת בקרה חיובית לייצור ROS מיטוכונדריאלי. איור זה מציג תמונות של רמות מי חמצן אנדותל, ציטוזולי ומיטוכונדריאלי בביטוי יציב של היפר ציטו או היפר D מיטו.

MP ECS מגורה עם אגוניסטים של TLR. כימות השינוי הקרינה הממוצע מדגים עלייה של פלואורסצנטיות היפר ציטו והיפר D מיטו לאחר שש שעות של גירוי במערכת תרבית משותפת. כדי להעריך את איתות ה-ROS של Peregrine מקרופאגים מבודדים טריים של מירין הן מסוג בר והן מ-GP 91, עכברי פוקס אפסים הופעלו על ידי מיקרוגרם אחד למיליליטר של LPS למשך שש שעות.

מקרופאגים סומנו באדום עם C-M-T-P-X ונוספו לשפעת ירוקה ארבע. טעון. MPM ecs. מעניין שמקרופאגים המופעלים על ידי LPS שבודדו מעכברים מסוג בר עוררו גיוס סידן גדול ומהיר ב-MPM ECS בהשוואה למקרופאגים מעכברי GP 91 Fox null.

בזמן ש-LI מנסה לבצע הליך זה, חשוב לזכור שהורדה ממושכת או חשיפה ללייזר מובילים לחמצון אוטומטי של DCF. חיוני להימנע מהלבנת תמונות של היפר ציטו והיפר D מיטרל. לאחר שליטה, מדידת RA במקרופאגים כמו גם בתאי אנדותל יכולה להיעשות תוך שבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.