Name: קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: למד כיצד לכמת חלוקת רפסודות ליפידים בתאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מדידת זמני דיפוזיה של חלבונים פלואורסצנטיים בתוך ומחוץ לרפסודות ליפידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם סוכנות הידיעות הלאומית דה לה משוכלל ונדיר (ChoAD). אנחנו גם מודים ICM Fondation (Institut du Cerveau et de la Moelle) עבור תמיכה כלכלית שלהם.

1. כיול של תוכנית ההתקנה של FCS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מיקרוסקופ confocal, לייזרים, מחשבים, חממה טמפרטורה בקרת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא SPAD (דיודה פוטון יחיד מפולת שלגים) פועל מסנן הקרינה בתוך SPAD הוא גם מתאים המדגם שלך. בדוק SPAD מסונכרן בזמן. היזהרו רק להתחיל תוכנת FCS שלך פעם אחת ההגדרות SPAD שלך מוכנים לרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון חדש של כולרה הרעלן Alexa488 מדולל PBS להגיע ריכוז של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​(17.5 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב הדמיה confocal של פתרון באמצעות זיהוי הפנים של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב סריקה להצביע ולבחור נקודה במדגם פתרון. לוודא את משך התאורה לייזר מספיק זמן כדי לבצע רכישות FCS שלך (&gt; 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זיהוי חיצוני על ידי SPAD ו לתוכנה FCS. מעקב אחר אותות הקרינה שלך לוודא שהוא גם סויטד ל SPAD (האות מספיק אך לא רוויה, 10 000 50 000 ספירת / s זה בסדר). במידת הצורך, לשנות עמדה רווח Z, ו / או כוח לייזר על מנת להשיג אות הקרינה הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת 10 סטים של 30 מדידות שניות. בזמן הרכישה צריך להיות מותאם במיוחד מדגם שלך (פשרה בין הדגימה הטובה ביותר ובעיות photobleaching). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים (ראה שלב 4) כדי לוודא שיש לך עקומת אוטומטי המתאם המתאים מין אחד ניאון מתפשטים והולכים בתמיסה (משוואה בתרשים. 2), וכי הפעם דיפוזיה המתקבל לאחר מתאים נכון (כ 0.2 ms) (איור . 3). </li></ol> 2. צביעת תאים החיים עם דה מרקר ליפידים רפסודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEK293 צלחת התאים על 8-גם Labteks מצופה פולי-L-ליזין (1mg/ml) יום לפני הדמיה לוודא כי הידבקות שלהם נכונה. השתמש בינוני ללא פנול אדום כדי להבטיח שאין הפרעה של אותות הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לשטוף את התאים פעמיים עם HBSS (שנאגרו של האנק תמיסת מלח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כולרה הרעלן Alexa488 (1 מיקרוגרם / מ"ל) / BSA (0,1%) ב -500 HBSS μl על התאים למשך 30 דקות ב 37 ° C. רעלן הכולרה יהיה לאגד ganglioside GM1, ידוע כי למחיצות מועדף על רפסודות שומנים בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם HBSS (שנאגרו של האנק תמיסת מלח). </li></ol> 3. FCS רכישת נתונים על תאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים צבעונית על הבמה מיקרוסקופ. הפוך את הטמפרטורה CO בטוח ו -2 התנאים הם אופטימליים אחרת זה עלול להוביל חפצים בזמנים דיפוזיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב הדמיה confocal של תא עניין באמצעות זיהוי הפנים של המיקרוסקופ (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב סריקה להצביע ולבחור טעם קרום הפלזמה של התא של עניין. בצעו 1-2 תמונות חיות של התא כדי לוודא התא לא זז במהלך הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זיהוי חיצוני על ידי SPAD וכדי הרך FCSכלי. מעקב אחר אותות הקרינה שלך לוודא שהוא מתאים גם SPAD (האות מספיק אך לא רוויה, 10 000 50 000 ספירות / s זה בסדר). במידת הצורך, לשנות עמדה רווח Z, ו / או כוח לייזר על מנת להשיג אות הקרינה הנכון. אם זה לא מספיק, ניתן לשקול שינוי התנאים צביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת 10 דגימות של 30 מדידות שניות. כמו רוב התאים הם אוטומטי ניאון, אתה עשוי לראות ירידה הקרינה במהלך הרכישות הראשונות, עקב דהייה אוטומטי פלואורסצנטי. </li></ol> 4. FCS ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מרווח המתאם וליצור אוטומטית עקומות קורלציה עם תוכנות FCS. מרווח המתאם יהיה בדרך כלל נע בין הזמן הקצר ביותר לפתרון בעומר עד הזמן הארוך ביותר האפשרי (כמו נתוני המדידה הופך להיות יותר ויותר בלתי מספקת כאשר זמן הקורלציה המקסימלי מתקרב בזמן הרכישה הכולל, זמן השהיה המרבי מוגבל ל 80% רכישת זמן PicoquaNT תוכנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדגם זה, לייצא קבצים המתאימים תנודות פלואורסצנציה אוטומטי מתאם כפונקציה של הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ניתוח נתונים ותוכנה מתאימה, כגון מקור Pro לייבא את הקבצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדגם זה, ודא שיש photobleaching לא במהלך הרכישה כלומר הקרינה נשארת יציבה במשך 30 שניות. לבטל את כל אמצעי להצגת photobleaching שכן הדבר עלול לגרום מלאכותיים פעמים דיפוזיה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את צורת הנותרים FCS עקומות נכון (ראה איור 5). לקבוע את עקומת הממוצע FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את עקומת עם מודל מתמטי המתאים (איור 2). התאמה זה ייתן לך זמן דיפוזיה (ים) ו שיעור מולקולות מתפשטים והולכים עם הזמן (מזרח) זה דיפוזיה (ים). </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה כיול FCS פתרון כולרה הרעלן Alexa488 מוצגת באיור 3 &gt; חזק. לאחר בדיקה, כי צעדים בודדים של הקרינה כפונקציה של הזמן לא הראה שום photobleaching (איור 3 א), כלומר הפרט עקומות FCS חושבו. מתכוון עקומות FCS צוידו משוואות דיפוזיה המתאימים מודלים שונים (דוגמאות באיור 2). פרמטר נחשב קלאסי כדי לקבוע את איכות ההתאמה הוא מקדם בנחישות R 2. ככל R 2 היא 1, יותר טוב מתאים. במקרה זה, המודל המדויק ביותר כדי להתאים את עקומת הממוצע FCS הוא זה המתאר האוכלוסייה של מולקולות ניאון מתפשטים והולכים באופן חופשי בשלושה ממדים (משוואה 1 באיור 2, איור 3 ב). זמן דיפוזיה נגזר בכושר הוא 0.32 אלפיות שנייה. שאריות מן הראוי, עקומת (איור 3 ג) ו - R 2 גורם (0.99906) לתת הערכה של איכות ההתאמה. דוגמה של ניתוח FCS עבור מוכתם הרעלן Alexa488 כולרה HEK293 תאים מוצגת באיור 5. ממוצע multiphasic FCS צורת עקומת חושף את קיומם של אוכלוסיות של מולקולות ניאון עם פעמים דיפוזיה שונים. ההתאמה הטובה ביותר עבור עקומת זו תואמת את המודל עם שלוש אוכלוסיות של בדיקות ניאון: שני עם דיפוזיה הפריע (דיפוזיה בשני ממדים כמו במישור הממברנה) ואחד לשדר באופן חופשי בשלושה ממדים (משוואה 2 באיור 2, איור 5) . אוכלוסייה זו האחרונה תואמת את מולקולות ניאון נעים מחוץ למטוס קרום, כלומר, בין אם מחייב או unbinding ליעדים הממברנה שלהם, להגיע דרך הממברנה מסלול הפרשת או מיחזור, או לעזוב את הממברנה על ידי אנדוציטוזה. שתי פעמים דיפוזיה על הממברנה, המתאימים רעלן הכולרה חייב GM1, היו 2 ms (25% מכלל מולקולות), המקביל ל דיפוזיה מחוץ רפסודות שומנים בדם, טרשת נפוצה ו -75 (50% מכלל מולקולות), המקביל ל דיפוזיה של רפסודות שומנים בדם . שים לב, שכל photobleaching במהלך הרכישה תביא מלאכותיים פעמים דיפוזיה יותר ובכך אולי ליצור הטיה כלפי לוקליזציה של GM1 בתחומים רפסודות שומנים בדם. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ייצוג סכמטי של FCS הגדרת (תמונה שונה מן Marquer et al. 12) <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2. דוגמה מודלים ומשוואות דיפוזיה המתאימים המשמשים להתאים עקומות autocorrelation. פרמטר מבנה S ניתן לכתוב כמו S = Z רדיוס 0 / ל 0 עם Z 0 מוקד אפקטיבי לאורך הציר האופטי ב 1 עוצמת / 2 E ו w0 la יעילרדיוס מיקוד teral בעוצמה 2 1 / e. ערכים אלה ניתן להפיק מדידה קלאסית התפשטות נקודה (כוחות הביטחון הפלסטינים) function. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> איור 3. הערכה של זמן הדיפוזיה של כולרה הרעלן Alexa488 בתמיסה לכיול FCS. א) תנודות Fluorescence כפונקציה של זמן למשל נציג של רכישת 30 שניות. ב) ממוצע עקומת autocorrelation להשיג 10 דוגמאות של רכישת 30 שניות מצויד משוואה 1 (ראה איור 2). C) שאריות של עקומת הולם. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> 4. איור HEK-293 תא מוכתם כולרה הרעלן Alexa488. התאים היו צילמו על מיקרוסקופ SP5 confocal (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה) עם קו לייזר פנימית 488nm. הקרינה נאסף עם X60 apochromat מטרת התוכנית שמן טבילה בין 500ו -650 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 5"> איור 5. הערכת הזמן דיפוזיה של כולרה הרעלן Alexa488 על קרום הפלזמה של HEK293 תאים. א) ממוצע עקומת autocorrelation מצויד משוואה 2 (ראה תרשים 2). ב) שאריות של עקומת הולם. (שונה מ Marquer et al. 12)

<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Gerl, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revitalizing+membrane+rafts%3A+new+tools+and+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Revitalizing membrane rafts: new tools and insights.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).</li>
<li>Simons, K., Ehehalt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol%2C+lipid+rafts%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cholesterol, lipid rafts, and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).</li>
<li>Munro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%3A+elusive+or+illusive%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts: elusive or illusive.</a> Cell. , 115-377 (2003).</li>
<li>Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%3A+now+you+see+them%2C+now+you+don%27t%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts: now you see them, now you don't.</a> Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).</li>
<li>Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid-cholesterol+rafts+diffuse+as+small+entities+in+the+plasma+membrane+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+sphingolipid-+and+cholesterol-rich+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts.</a> J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).</li>
<li>Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+lipid+rafts%3A+an+identity+crisis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).</li>
<li>Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+lipid+mobility+of+raft-exhibiting+model+membranes+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li>
<li>Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+relates+rafts+in+model+and+native+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes.</a> Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).</li>
<li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy in living cells.</a> Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).</li>
<li>Marquer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cholesterol+increase+triggers+amyloid+precursor+protein-Bace1+clustering+in+lipid+rafts+and+rapid+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.</a> FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).</li>
<li>Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+review+of+biochemical+and+microfluidic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications.</a> Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).</li>
<li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+novel+variations+of+an+established+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).</li>
<li>Ilien, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pirenzepine+promotes+the+dimerization+of+muscarinic+M1+receptors+through+a+three-step+binding+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process.</a> J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).</li>
<li>Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-receptor+kinetics+measured+by+total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).</li>
<li>Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+surface+dynamics+of+biomolecules+by+total+internal+reflection+fluorescence+with+photobleaching+recovery+or+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 33, 435-454 (1981).</li>
<li>Thompson, N. L., Steele, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).</li>
<li>Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457, 1159-1162 (2009).</li>
<li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+image+correlation+spectroscopy%3A+measuring+number+densities%2C+aggregation+states%2C+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).</li>
<li>Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differently+anchored+influenza+hemagglutinin+mutants+display+distinct+interaction+dynamics+with+mutual+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts.</a> J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).</li>
<li>White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holin+triggering+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Holin triggering in real time.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).</li>
<li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).</li>
<li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).</li>
<li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+correlation+spectroscopy+with+a+laser-scanning+microscope%3A+exploiting+the+hidden+time+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure.</a> Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).</li>
<li>Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+GPI-anchored+proteins+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells.</a> Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).</li>
<li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+image+correlation+spectroscopy+%28PICS%29%3A+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys. J. 92, 613-621 (2007).</li>
<li>Bates, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lateral+diffusion+and+capture+of+CFTR+within+transient+confinement+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones.</a> Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

שיטת FCS המוצג כאן מאפשר ניתוח רגיש מהירה של חלוקת השומנים הרפסודה של בדיקות ניאון של עניין תאים חיים. FCS המשלבת את הדיוק של לוקליזציה של מיקרוסקופיה confocal עם רגישות של ספירת פוטון יחיד. ההבדל העיקרי בין FCS וטכניקות ביוכימיים התקן היא זאת FCS מאפשר קביעה מוחלטת של חלוקת השומנים רפסודות של יעד ולא מחיצה יחסית כמו במקרה של בידוד DRMs או שיתוף תיקון. רכישת FCS הנתונים לוקח כ 5 דקות (10 רכישות של 30 שניות) עבור ...

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> כולרה למקטע רעלן B-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentamer) = 57 ק&quot;ג / mol </td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> החממה עבור 2 טמפרטורה CO </td><td> חיים שירותי הדמיה </td><td> הקוביה Box </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (דיודה פוטון יחיד מפולת שלגים) </td><td> MPD (Micro Devices פוטון) </td><td> PDM Serie (100 מיקרומטר אזור רגיש) </td><td></td></tr><tr><td> 488 nm גבוהה לעבור סינון </td><td> Semrock </td><td> 488 ננומטר חסימת קצה BrightLine ארוך לעבור סינון חלק #ails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS יחידת איתור </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 מודול </td><td></td></tr><tr><td> רכישה אוטומטית מתאם תוכנה </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> מתאים תוכנה </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (fcs)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

בחמש עשרה השנים האחרונות את הרעיון קרום התא לא הומוגנית להסתמך על microdomains להפעיל פונקציות שלהם הפכה מקובלת מאוד. רפסודות שומנים בדם הם microdomains קרום המועשר כולסטרול sphingolipids. הם ממלאים תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים הסלולר כגון איתות, ו 1,2 סחר אבל נחשבים גם להיות שחקני מפתח מחלות שונות, כולל זיהומים נגיפיים או חיידקים ומחלות ניווניות 3. עם זאת, קיומם הוא עדיין עניין של מחלוקת 4,5. אכן, רפסודה בגודל שומנים בדם כבר מוערך כ 20 ננומטר 6, הרבה מתחת לגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ רגיל (סביב 200 ננומטר), ובכך precluding הדמיה ישירה שלהם. עד עכשיו, את הטכניקות העיקריות להערכת החלוקה של חלבונים בעלי עניין בתוך רפסודות שומנים בדם היו ממברנות עמידות דטרגנט (DRMs) בידוד ושיתוף תיקון עם נוגדנים. למרות שימוש נרחב becaהשימוש ביישום די קל שלהם, טכניקות אלה היו מועדים חפצים ובכך מתח ביקורת על 7,8. שיפורים טכניים היו לכן, יש להתגבר על חפצים כדי להיות מסוגל לחקור רפסודות מחיצה שומנים בתאים חיים. כאן אנו מציגים שיטה ניתוח רגישות של מחיצת רפסודות שומנים בדם של חלבונים או שומנים fluorescently-מתוייגים בקרום פלזמה של תאים חיים. שיטה זו, המכונה ספקטרוסקופיה מתאם פלואורסצנטי (FCS), מסתמך על הפער בזמנים דיפוזיה של בדיקות ניאון הממוקמים או מחוצה לו, רפסודות שומנים בדם. למעשה, כפי שעולה הן ממברנות מלאכותיים בתרביות תאים, בדיקות היה לפזר הרבה יותר מהר מאשר בחוץ בתוך רפסודות שומנים בדם צפופים 9,10. כדי לקבוע את הזמנים דיפוזיה, תנודות זעירות הקרינה נמדדים כפונקציה של הזמן בנפח מוקד (כ 1 femtoliter), הממוקם בקרום הפלסמה של התאים באמצעות מיקרוסקופ confocal (איור1). אוטומטי המתאם עיקולים לאחר מכן, ניתן להסיק שינויים אלו מצויד המתאימים מודלים מתמטיים דיפוזיה 11. FCS ניתן להשתמש כדי לקבוע את הרפסודה השומנים מחיצות של בדיקות שונות, כל עוד הם מתויגים fluorescently. תיוג פלורסנט ניתן להשיג על ידי ביטוי של חלבונים היתוך ניאון או באמצעות קשירה של ligands ניאון. יתר על כן, FCS יכול לשמש לא רק ממברנות מלאכותיים שורות תאים, אלא גם בתרבויות העיקריות, כפי שתואר לאחרונה 12. זה יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר הדינמיקה של חלוקת השומנים הרפסודה לאחר הוספת התרופה או שינוי הרכב השומנים קרום 12.

טכניקה לחקור את הרפסודה השומנים חלוקה של חלבונים ניאון על הממברנה של התאים החיים המתואר. הוא מנצל את הפער בזמנים דיפוזיה של חלבונים המצויים בתוך או מחוץ רפסודות שומנים בדם. הרכישה יכולה להתבצע באופן דינמי בתנאי בקרה, או אחרי כן התרופה.

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

במהלך חמש עשרה השנים האחרונות, התפיסה שקרומי תא אינם הומוגניים וכי הם מסתמכים על מיקרו-דומיינים (microdomains) כדי לממש את תפקודיהם הפכה למקובלת באופן נרחב.

רפטי ליפידים (Lipid rafts) הם מיקרו-דומיינים בתוך ממברנה הפלזמה המשמשים כמרכזי ארגון לתהליכים תאיים כגון איתות ותעתוע. כאן, הפרדה של רפטי ליפידים בממברנה הפלזמה של תאים חיים נמדדת כמותית באמצעות ספקטרוסקופיית קורלציית פלואורסצנציה (fluorescence correlations spectroscopy) כדי לבחון את ההפרדה של רפטי ליפידים עבור הגנגליוזיד GM one. תאי יונקים נסרקים באמצעות תת-יחידות B של רעלן כולרה המסומנות ב-Alexa 4 88.החלבונים הפלואורסצנטיים נקשרים לגנגליוזיד GM1, אשר מופרד באופן מועדף אל רפטי ליפידים (lipid rafts), באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. תנודות פלואורסצנציה זעירות בממברנת הפלזמה נמדדות. עקומות אוטוקורלציה נוצרות ומותאמות למודלים מתמטיים מתאימים של דיפוזיה כדי לקבוע את זמני הדיפוזיה של הפלואורופור.מכיוון שגששים מפעפעים הרבה יותר מהר מחוץ לרפטים ליפידיים צפופים מאשר בתוכם, התוצאות שהתקבלו מעידות על רמת החלוקה (partitioning). היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בידוד ממברנות עמידות לדטרגנט או co patching באמצעות נוגדנים, הוא ש-FCS מאפשרת קביעה של דפוס הרפט הליפידי המוחלט של המטרה, ולא רק את הדפוס היחסי. יתרה מכך, ניתן להשתמש בשיטה עבור ליפידים וחלבונים כאחד, כל עוד הם מסומנים פלואורסצנטית.שיטה זו יכולה לסייע במענה לשאלות מפתח בתחום מחלת האלצהיימר, כגון מהי החשיבות של ליפידים בייצור עמילואיד בטא? הדבר יוביל לתגליות חשובות, כגון מעכבים חדשים הנקשרים ספציפית לרכיבי השכבה הליפידית. התחילו את הפרוצדורה כיול של מערכת הספקטרוסקופיית קורלציית פלואורסצנציה או מערכת FCS.מערכת FCS זו מורכבת ממיקרוסקופ קונפוקלי המחובר ליחידת גילוי חיצונית עם מסנן גילוי ופוטודיודה מסוג avalanche, ומערכת ספירה של פוטון בודד במתאם זמן (TCSPC). הפעילו את לייזרי המיקרוסקופ הקונפוקלי, את מחשב הדימות הקונפוקלי ואת מחשב רכישת נתוני ה-FCS. לאחר מכן, הפעילו את האינקובטור וכוון אותו ל-37 °C ו-5% carbon dioxide.וודאו שדיודת הע avalanche לפוטון בודד (spad) דולקת ושהמסנן הפלואורסצנטי בתוך ה-spad מתאים לדגימה. בדקו שה-spad מסונכרן בזמן. ברגע שהגדרות ה-spad מוכנות לרכישה, הפעילו את תוכנת ה-FCS PICO quant.הכינו תמיסה רעננה של רעלן כולרה (cholera toxin) מסומן ב-Alexa 488, המדולל ב-PBS בריכוז סופי של 1 µg/mL. העבירו את התמיסה בעזרת פיפטה אל על גבי זכוכית כיסוי. לאחר מכן, כווננו את הגדרות ציר ה-Z במיקרוסקופ כדי למצוא את המישור שבו הפלואורסצנציה היא העזה ביותר.כדי לעבור למצב סריקת נקודות, לחצו על כפתור ה-bleach point, ולאחר מכן לחצו על מסך התמונה כדי לבחור אזור עניין (ROI) נקודתי בדגימת התמיסה. באמצעות התוכנה, הגדירו זמן חשיפה הגבוה מחמש דקות. פעולה זו מבטיחה שההארה בלייזר תהיה מספיק ארוכה כדי לבצע את רכישות ה-FCS.לאחר מכן, באמצעות תוכנת ה-FCS, עברו לגילוי חיצוני באמצעות ה-spad. ודאו שהאות הפלואורסצנטי נמצא בטווח של 10,000 עד 50,000 counts per second. המטרה היא להשיג אות טוב אך ללא רוויה.רכשו 10 סדרות של 32 מדידות באותו שדה. יש לאפתם את זמן הרכישה עבור הדגימה כך שיושג דגימה באיכות גבוהה ללא פוטו-بلیச்சிנג (photo bleaching). לאחר רכישת נתוני דגימת האופטימיזציה, יש להשתמש בהם ליצירת עקומות אוטוקורלציה שמהן ייקבעו זמני הדיפוזיה של המינים הפלואורסצנטיים. ראשית.באמצעות תוכנת ה-FCS, הגדירו את מרווח המתאם והפיקו עקומת אוטו-קורלציה התואמת למינים הפלואורסצנטיים המפעפעים בתמיסה. עבור כל מדידה 32, התוכנה תנתח כל דגימה 32 באופן עצמאי ותפיק עקומות אוטו-קורלציה מעוצמות הפלואורסצנציה באמצעות פונקציה מתמטית קלאסית, המדווחת על הדמיות בין תצפיות כפונקציה של הפרדת הזמנים ביניהן. מרווח המתאם ישתנה בדרך כלל מזמן ה-LAC הקצר ביותר שניתן לה phân רזולוציה ועד לזמן הארוך ביותר האפשרי.כפי שניתן לראות כאן, המדידה הופכת לפחות מדויקת ככל שזמן הקורלציה המקסימלי מתקרב לזמן הרכישה הכולל. כאן, זמן הפיגור המקסימלי מוגבל ל-80% מזמן הרכישה. לאחר מכן, עבור כל דגימה, ייצאו את הקבצים המתאימים לתנודות פלואורסצנציה ואוטוקורלציה כפונקציה של הזמן. לאחר מכן, ייבאו את הקבצים לתוכנה לניתוח והתאמת נתונים כגון Origin Pro כדי לוודא שלא התרחשה פוטו-הלבנה (photo bleaching) במהלך הרכישה.בדוק את קובץ תנודות הפלואורסצנציה. הפלואורסצנציה צריכה להיות יציבה במהלך 30 השניות וצריכה להיות מיוצגת כקו שטוח. כאשר מדידות פלואורסצנציה מראות הבהרה פוטוכימית (photo bleaching).אין להשתמש בעקומות FCS התואמות להמשך הניתוח, שכן הדבר עלול לגרום לזמני דיפוזיה ארוכים באופן מלאכותי בעקומות FCS שנותרו. קבע את עקומת ה-FCS הממוצעת על ידי חישוב ממוצע של ערכי האוטו-קורלציה עבור כל נקודת זמן. לבסוף, כדי להתאים את העקומה למודל המתמטי המתאים, השתמש במודול ההתאמה (fitting module) של Origin Pro עם המשוואה המתאימה.התאמה זו תיתן את זמן הדיפוזיה של המולקולות והתמיסה. במקרה זה, ישנה רק אוכלוסייה אחת המתפשטת בחופשיות בדיפוזיה. אם זמן הדיפוזיה שהתקבל נכון, הוא יהיה בערך 0.2 מילי-שניות.המערך מכויל היטב וניתן להשתמש בו לניסויים נוספים. כעת, לאחר שכיול המערך נבדק, ניתן להשתמש במערכת כדי למדוד את חלוקת ה-RAFs של ליפידים בצמחייה. הוצאו ארבעה תרביתי תאי HEC 2 93 חיים שמעניינים את המחקר מהאינקובטור.יש להעמיד את התאים על שקופיות מצופות poly L lysine מדגם eight wheel lab Tech ביום שלפני כן, כדי לאפשר להם זמן להיצמד. יש להשתמש במצע ללא phenol red כדי להבטיח שלא תהיה הפרעה לאות הפלואורסצנציה. השתמשו בפיפט כדי להסיר בעדינות את רוב המצע מהבאר, תוך הקפדה שהתאים לא יתייבשו.לאחר מכן, הוסיפו בעדינות HBSS לבאר. חזרו על שטיפה זו פעם אחת לכל באר. הוסיפו לתאים 500 µL של רעלן כולרה מהול, Alexa 488, למשך 30 דקות.בטמפרטורה של 37 °C, רעלן החולה (cholera toxin) נקשר לגנגליוזיד GM1, אשר ידוע כבעל נטייה להתחלק באופן מועדף ברפטים ליפידיים (lipid rafts) לאחר האינקובציה. שטוף את התאים פעמיים עם HBSS כפי שבוצע קודם לכן; התאים מוכנים כעת לרכישת נתוני FCS. הנח את התאים הצבועים עלבמת המיקרוסקופ ובדוק את הגדרות הטמפרטורה והפחמן הדו-חמצני.בצעו אופטימיזציה של הדמיה קונפוקלית של תא שנבחר באמצעות הגילוי הפנימי של המיקרוסקופ. מצאו תא עם ממברנה צבועה היטב. עברו למצב סריקת נקודות (point scanning) כפי שנעשה קודם לכן, ובחרו נקודה בממברנת הפלזמה של התא שנבחר.צלמו תמונה אחת או שתיים של התא כדי לוודא שהתא אינו זז במהלך הרכישה. עברו לגילוי חיצוני באמצעות ה-spad ולתוכנת ה-FCS כפי שנעשה קודם, כדי להבטיח אות תקין בטווח של 10,000 עד 50,000. שנו את הגבר של מיקום ה-Z ו/או את הספק הלייזר.רכשו 10 דגימות של מדידות 32, מכיוון שרוב התאים הם בעלי פלואורסצנציה עצמית. ייתרה ירידה בפלואורסצנציה במהלך הרכישות הראשונות עקב דהיית הפלואורסצנציה העצמית. נתחו את תנודות הפלואורסצנציה כפי שנעשה קודם לכן כדי לקבוע את עקומת ה-FCS הממוצעת.לאחר מכן, התאימו את עקומת ה-FCS הממוצעת הרב-פאזית למודל המתמטי המתאים. השתמשו במודול ההתאמה (fitting module) של Origin Pro עם המשוואה המתאימה. התאמה זו תספק את זמני הדיפוזיה ואת פרופורציית המולקולות המפיצות בזמני דיפוזיה אלה.איור זה מציג דוגמה לכיול FCS עם תמיסת cholera toxin Alexa 488. לאחר בדיקה שביצועי המדידות הבודדות של הפלואורסצנציה כפונקציה של הזמן לא הראו פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching), חושבו עקומות FCS בודדות וממוצעות. עקומות FCS הממוצעות הותאמו למשוואות התואמות למודלי דיפוזיה שונים.הפרמטר הנחשב קלאסית לקביעת איכות ההתאמה הוא מקדם המתאם R squared. ככל ש-R squared קרוב יותר למספר אחת, כך ההתאמה טובה יותר ובמקרה זה, המודל המדויק ביותר להתאמה. עקומת ה-FCS הממוצעת היא זו המתארת אוכלוסייה של מולקולות פלואורסצנטיות המפעפפות באופן חופשי בשלושה ממדים.זמן הדיפוזיה שהתקבל מההתאמה הוא 0.32 milliseconds. השאריות מהתאמת העקומה ומקדם ה-R squared מספקים כאן הערכה לאיכות ההתאמה. ערך ה-r squared הוא 0.99906, המעיד על התאמה טובה.כאן מוצגת דוגמה לניתוח FCS עבור תאי HC 2 93 שצבעו רעלן כולרה עם Alexa 4 88. בדוגמה זו, הרעלן מתחיל לעבור אנדוציטוזה, כפי שניתן לראות בנוכחות נקודות פלואורסצנטיות תוך-תאיות קטנות להערכת הדיפוזיה. זמן השהייה של רעלן כולרה Alexa 4 88 בממברנה הפלזמתית.הנתונים נאספו ונותחו כפי שמתואר בסרטון זה. צורת עקומת ה-FCS הממוצעת הרב-פאזית חושפת קיומן של אוכלוסיות של מולקולות פלואורסצנטיות עם זמני דיפוזיה שונים. ההתאמה הטובה ביותר לעקומה זו תואמת למודל עם שלוש אוכלוסיות של גששים פלואורסצנטיים, שתיים מהן בעלות דיפוזיה מעוכבת.דיפוזיה בשני ממדים, כפי שקורה במישור הממברנה, ואושה אחת המפעפפת באופן חופשי בשלושה ממדים. אוכלוסייה אחרונה זו תואמת למולקולות פלואורסצנטיות הנעות מחוץ למישור הממברנה. במילים אחרות, המולקולות הפלואורסצנטיות נקשרות או נפרדות ממטרות בממברנה, מגיעות לממברנה דרך נתיב ההפרשה או המיחזור, או עוזבות את הממברנה באמצעות אנדוציטוזה.שני זמני דיפוזיה נצפו בממברנה. ל-25% מהמולקולות היו קצבי דיפוזיה של שני מילישניות, התואמים לדיפוזיה מחוץ לרפטים ליפידיים (lipid rafts). ל-50% מהמולקולות היו זמני דיפוזיה של 75 מילישניות, התואמים לדיפוזיה בתוך רפטים ליפידיים.בעקבות הליך זה, על ידי שילוב של תצורה אופטית חלופית, ניתן לבצע זיהוי של מולקולה בודדת מתחת לגבול הדיפרקציה, מה שמאפשר גישה לטווח רחב יותר של זמני דיפוזיה לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום רפידי הלפידים (lipid rafts) לבחון דינמיקה הקשורה למחלות של חלוקת רפידי הלפידים לאחר מתן תרופה, שינוי בהרכב הליפידים של הממברנה בקווי תאים ובתרביות ראשוניות.

determination-lipid-raft-partitioning-fluorescently-tagged-probes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את השימוש בספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות כדי לזהות את האינטראקציה בין חלבוני פני התא במגעים בין תאי התא. על ידי ביטוי קולטן ההידבקות הטרנסממברנה של עניין המסומן בחלבון פלואורסצנטי וערבוב שתי אוכלוסיות תאים שונות המכילות שתי תוויות פלואורסצנטיות מופרדות ספקטרלית, האינטראקציה הטרנסית בין קולטנים של שני תאים שכנים בעלי פלואורסצנטיות בצבעים שונים מוערכת באמצעות מתאם צולב בתנודות של עוצמת הפלואורסצנטיות.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של חלבונים במגעים עם תאים

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות אירועי היתוך אחד, בתיווך מלכודת בין ליפוזומים bilayers נתמך ערוצי microfluidic באמצעות TIRFM המקוטב, עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec. ליפידים ושחרור מטען מסיס ניתן לאתר בו זמנית. Liposome גודל, diffusivity שומנים, ואת הנקבוביות היתוך מאפיינים נמדדים.

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

מתוארת שיטה למדידת דיפוזיה של חלבון בממברנות של תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (FCS). במאמר זה מודגם השימוש בנוגדנים לסימון פלואורסצנטי.

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

נוגדנים לאגד היעד הקולטנים על פני השטח של התא יכול להתייעץ קונפורמציה והשינויים קיבוץ באשכולות. שינויים דינמיים אלה יש השלכות על אפיון פיתוח תרופות בתאי המטרה. פרוטוקול זה מנצל מיקרוסקופיה קונפוקלית וספקטרוסקופיה של המתאם תמונה דרך ImageJ/פיג'י לכמת את מידת קולטן קיבוץ באשכולות על פני התא.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

מאמר זה נועד להציג פרוטוקול כיצד לבנות מיקרוסקופ ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (svFCS) של וריאציה נקודתית כדי למדוד דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים.

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

למד כיצד לכמת חלוקת רפסודות ליפידים בתאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מדידת זמני דיפוזיה של חלבונים פלואורסצנטיים בתוך ומחוץ לרפסודות ליפידים.

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

גלה סרטונים נוספים