Name: שב וקיפל תאיים Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למדו למדוד קיפול חלבונים תוך-תאי לאחר הלם חום באמצעות מערכת דיווח לוציפראז. שיטה זו מאפשרת הערכת פעילות שפרונים מולקולריים בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

דנילו מדלו הוא מקבל מלגת מחקר כמו קבוצת לחוקר הצעיר (YIG) מהמכון הטכנולוגי של קרלסרוהה.

1. מתזמן את התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, לחמם את המדיום תרבות, 1X PBS ואת טריפסין באמבט מים 37 ˚ C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התאים מתוך החממה לשאוב את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחיל 5 מ"ל של PBS 1X על התאים כדי לשטוף אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 1X PBS וליישם 1 מ"ל של טריפסין המכיל 0,025% EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב בעדינות את הצלחת יש חלוקה שווה של טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום התאים החממה ב 37 ˚ C למשך 5-10 דקות (תלוי בסוג התא). מדי פעם לבדוק אם התאים מנותקים על ידי רועדת את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 10-20 מ"ל של מדיום ולאסוף אותם צינור בז 50 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות דלפק Beckman. מספר תאים צריך להיות מספיק כדי להבטיח מפגש של כ 60-70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט את התאים ולאפשר להם זרע במשך 6-8 שעות. </li></ol> 2. טרנסfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני transfection, להתחמם aliquot של המדיום בסרום ללא באמבט מים ב 37 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את X-treme ג'ין 9 לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet המדיום החופשי בסרום 2 צינורות Eppendorf (1 שפופרת = 1 transfection). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet X-treme ג'ין 9 תשומת לב בינוני בסרום החופשי משלמים כי טיפ אינו נוגע בקיר הפלסטיק של Eppendorf ו דגירה במשך 5 דקות. בינתיים להכין שתי תערובות DNA: בתוך הגליל האחד לערבב יחד את פלסמידים עבור renilla, גחלילית ואת פקד וקטור ריק, ב renilla עוד צינור, גחלילית ואת המלווה מולקולרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת DNA זה Eppendorf המכיל מדיום חופשי בדם + X-treme ג'ין 9, מערבולת דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף dropwise כל תערובת לצלחת כל דגירה למשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2 </li></ol> 3. פיצול תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות אחרי, tryps transfectioninize התאים כמתואר 1.4-1.6 ו לדלל אותם confluency סופי של 60-70% על צלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת אחת על השליטה הלא בהלם וכפי הצלחות רבות ככל הפעם נקודות שחזור כי צריך להיות מנותח, כמו הראו באיור. 2. </li></ol> 4. מחממים הלם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הלם חום, טרום חם סרום המכיל בינוני באמבט מים ב 37 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן "הלם החום חיץ" על ידי דילול ב cycloheximide בסרום בינוני המכיל ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - מגבים ל 20 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת מוציאים את הצלחות מן החממה לשאוב את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל כל טוב של "חיץ הלם חום", ו דגירה במשך 30 דקות ב 37 ˚ C ו 5% של CO 2 (כוללים גם את הצלחת הפניה לטיפול זה). זה יעצור דה נובו סינתזת החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב לעבור בינתיים על אמבט מים ולהגדיר את temperature ב 45 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לאטום את המכסה של צלחות עם Parafilm בעבר לחתוך פסים. צלחת ההתייחסות (100% מכלל refolfed גחלילית) נשאר בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 45 ˚ C במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות מן האמבטיה במים, להסיר את parafilm ולשים את הצלחות בחזרה בחממה כדי לאפשר התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הקציר בכל פעם לנקודה תאים לשטוף אותם PBS 1X ידי centrifuging ב 2000Xg דקה 1 בשעה 4 ˚ C. </li></ol> 5. תא תמוגה ו assay בלוציפראז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תמוגה תא יעיל, הצמד להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של חיץ תמוגה פסיבי בדילול 1:05 במים מזוקקים כפול בתוך שפופרת זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של lysate התא בצלחת 96 באר. מדגם כל pipetted בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק "לא מזועזע" דגימות התייחסות ישמשלקרוא את פעילות בלוציפראז renilla, שכן צעד זה נעשה שימוש כדי לבדוק יעילות transfection שווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות assay. עבור הפתרון luciferin לדלל luciferin לריכוז סופי של mM 0.2 במאגר גלאי, גלאי. עבור למאגר התגובה לדלל DTT ו-ATP ריכוז 1mm הסופי חיץ גלאי, גלאי. בשביל חיץ התגובה coelenterazine, לדלל coelenterazine לריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר במאגר coelenterazine. שמור על פתרון luciferin והתגובה coelenterazine חיץ אור מוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו במקום צלחת 96-היטב luminometer ועל להפעיל את תוכנית 'Wallac 1420 תחנת עבודה ". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את Pump1 לתוך הצינור בז המכיל את פתרון coelenterazine. סגור את המכסה כך אור לא יכול לבוא במגע עם הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מתוך התפריט "תחזוקה Dispenser" וסמן את האפשרות Pump1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות "מלא". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לערוך את פריסת צלחת לבחור באפשרות "חקור פרוטוקול ותוצאות" בתפריט. בחר את פרוטוקול לחץ פעמיים על זה. כעת בחר את בארות לקרוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל "Wallac מנהל" ולחץ על "התחל". התגובה בין בלוציפראז renilla ו coelenterazine המצע שלה פולט אור עם אורך גל של 482 ננומטר השיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קריאת, ללכת על "תחזוקה Dispenser 'ובחר' ריק 'ו Pump1 לשחרר את כל הפתרון שיורית חזרה הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להעביר את צינור לצינור בז המכיל מים לתקתק "פלאש". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב השטיפה לרוקן את הצינור על ידי בחירת 'ריקה'. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור מתוך Pump1 בתוך הצינור חיץ התגובה הבז ואת אחד מן Pump2 בצינור luciferin בז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי הפריסה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר "מלא" עבור Pump1 ו Pump2 מ 'דיספנסר תחזוקה "בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרוטוקול ואת תחילת הקריאה. התגובה בין בלוציפראז Firefly ו luciferin המצע שלה פולט אור עם אורך גל של 560 ננומטר השיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הקריאה לחזור על התהליך בידיים ריקות, ריקון עבור Pump1 ו Pump2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות זמינים כעת ב 'Wallac 1420 Explorer ". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניסוי קשורה למספר assay, שם משתמש, להתחיל ולסיים תאריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות כעת ניתן לייצא כקובץ Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חישובים, התאים מתחלקים לשלוש קבוצות: 1. לא בהלם התייחסות דגימות (כמפורט 100% וקיפלתי גחלילית בלוציפראז); 2. תאים ללא המלווה בחום מולקולרית בהלם; 3. תאים עם המלווה בחום מולקולרית בהלם. </li></ol> 6. נציג תוצאות Refolding חלבון קשורה ישירות הזמן של ההתאוששות ולכן כדי לבדוק אם המערכת עובדת הפרו perly, assay צריך להתבצע איסוף התאים בנקודות זמן שונות. קשר ישיר זמן / אחוז refolding מציין כי הניסוי שבוצעה כהלכה, ולכן מהווה גורם מגביל. עם זאת, יש להתייחס תמיד refolding לאחר הלם החום הוא אירוע להרוות ולכן ניתוח תקין כמובן זמן יש לבצע לפני תחילת כל ניסוי. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סקירה של הניסוי. ב assay refolding vivo דורש 3 עד 4 ימים להסתיים. ביום 1 תאים seeded ו transfected. תאים למחרת הם splitted לפורמט קטן יותר ביום 3 הם חום בהלם. בשלב זה ניתן לבצע את assay בלוציפראז מיד לאחר קצירת התאים או לשמור את תא גלולה ב -80 ° C ו לבצע את assay עוד רגע _content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> באיור 2. חלוקת התא. ביום 2 תאים מחולקים צלחת 6 באר. כל transfection יהיה מדולל היטב על מנת לקבל את כל transfection בצלחת אחת. כל צלחת יתאים זמן החלמה מסוים בתוספת צלחת ללא התייחסות בהלם. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> באיור 3. תוצאה טובה נציג. שיעור א 'של refolding נמדד ישירות על ידי פעילות גחלילית בלוציפראז. כל תרשים בר מייצג את אחוז refolding בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרי בנקודות זמן שונות התאוששות. ב קורלציה בין זמן refolding בהעדר (קו שחור) ובנוכחות (הקו האדום) של המלווה. ערכי r בריבוע עולה מתאם טוב. ב Fig.3A מוצג תוצאות נציג שבו תאים שנאספו דקות 15, 30, 45, 60 ו - 120 לאחר הלם החום בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרית. אחוז וקיפלתי מגביר בלוציפראז עם זמן החלמה ממושך עם transfection של המלווה המולקולרית. המתאם בין refolding זמן לשליטה (איור 3B, קו שחור) לבין המלווה המולקולרי-transfected התאים (איור 3B, קו אדום) מוצגת. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> איור 4. תוצאה רעה נציג. שיעור א 'של refolding נמדד ישירות על ידי פעילות בלוציפראז. כל תרשים בר מייצג את אחוז refolding בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרי בנקודות זמן שונות התאוששות. ב קורלציה בין זמן refolding בהעדר ובנוכחות (אדום line) של המלווה. הערכים מצביעים על מתאם r בריבוע רע. איור 4 א. מראה תוצאה נציג של ניסוי לא ביצע כראוי. גם הביקורת (פסים שחורים) לבין המלווה המולקולרי-transfected תאים (ברים אדומה) לא הראה עלייה חלבון refolding עם הזמן. בנוסף, transfection של המלווה המולקולרי לא הביא לעלייה של refolding. מתאם זה עני הוא אישר באיור. 4B מראה ערך r בריבוע של 0.6619 ו 0.1882 בהתאמה לשליטה (קו שחור) המולקולרית המלווה-transfected תאים (קו אדום).

<ol><li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+and+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li>
<li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+the+heat+shock+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li>
<li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li>
<li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+proteins+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast.+Cancer.+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li>
<li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li>
<li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li>
<li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17-AAG%3A+mechanisms+of+antitumour+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Investig.+Drugs%22%5BJournal%5D)">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li>
<li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP70+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li>
<li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pineal.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li>
<li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DnaK%2C+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li>
<li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li>
<li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li>
<li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבודה זו בפרוטוקול כדי למדוד את פעילות refolding תאיים של מלווים מולקולרית מוצג. Assay כולו ניתן לבצע 3 עד 4 ימים כפי שמוצג על ידי סקירה של איור. 1. עמידות ליניאריות של אות אור המיוצר על ידי גחלילית ואת בלוציפראז renilla מהווים בסיס מוצק עבור שחזור של הפרוטוקול. השלב הקריטי של assay היא הבחירה של מגיב transfection יעיל על מנת ל...

לצורך ניסוי זה &quot;אור וקטור&quot; צורה Luminometer פרקין אלמר &#39;1420 הארה מונה שימשה תוכניות Luminometer: Renilla: משאבה 1, 100 הזרקה μl מאגר התגובה: Pump1, 70 הזרקה μl Luciferin: Pump2, הזרקת 30μl עבור מאגרים להכין פתרונות אלו המניות מים מזוקקים כפול: <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1M MgSO 4: 246,48 גרם MgSO 4 * 7H 2 O ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 0,5 M EGTA: 190,18 גרם EGTA ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 גרם KH 2 PO 4 ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1M K2 HPO 4: 228,23 גרם K 2 HPO 4 * 3H 2 O ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - NaCl 5M: 292,2 גרם NaCl ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 0,5 M EDTA: 186,12 גרם EDTA * 2H 2 O ב 1 ליטר &nbsp;</li></ul> גלאי, גלאי-חיץ: <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 25mm Glycylglycin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 15mm MgSO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 4 מ&quot;מ EGTA </li></ul> עבור 1 ליטר להשתמש 3,3 גרם Glycylglycin, 15 מ&quot;ל של פתרון MgSO4 1M ו 8ml של פתרון 0,5 EGTA ז. לפתור במים, כדי להתאים את pH 7,8 ומביאים בהיקף כולל של 1 ליטר. תגובת חיץ חיץ עבור Renilla / Coelenterazine: <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 0.5 M NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1mm EDTA </li></ul> עבור 1 מ&quot;ל להשתמש 13,4 ליטר פתרון 1M KH 2 PO 4, 86,6 מ&quot;ל של פתרון 1M K 2 HPO 4, 100 מ&quot;ל של תמיסת NaCl 2ml 5M של פתרון 0.5 EDTA M. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> חברה </td><td> קטלוג / מספר מוצר: </td></tr><tr><td> DMEM (השתנה Dulbecco הנשר בינוני 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> עוברית זהב בסרום שור </td><td> PAA </td><td> ת 15-151 </td></tr><tr><td> X-treme ג&#39;ין 9 Transfection DNA מגיב </td><td> רוש </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS פוספט של Dulbecco בופר 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> מגבים 3 - (N-Morpholino) Propanesulfonic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> תמוגה הצפת פסיבי 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (4 * MgSO 7H 2 O) </td><td> Sigma-Aldrich רוט רוט </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> רוט רוט רוט רוט </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferin Firefly </td><td> ביוסינט </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> ביוסינט </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> רוט </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ה-ATP (אדנוזין טריפוספט) </td><td> רוש </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

שב וקיפל תאיים assay

Intracellular Refolding Assay

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי למדוד את הפעילות האנזימטית של מלווים מולקולרית במערכת התא מבוסס ואת ההשפעות האפשריות של תרכובות בעלות פעילות המעכבת / מגרה. מלווים מולקולרית הם חלבונים המעורבים בוויסות של החלבון המתקפל 1 יש תפקיד מכריע בקידום ההישרדות תא הלחץ על עלבונות כמו מכת חום 2, רעב מזין וחשיפה לכימיקלים / רעלים 3. מסיבה זו מלווים הם מצאו להיות מעורבים באירועים כמו התפתחות הגידול, chemioresistance של 4 תאים סרטניים, כמו גם ניוון מוחיים 5. עיצוב של מולקולות קטנות מסוגל לעכב או להמריץ את הפעילות של אנזימים אלה ולכן הוא אחת האסטרטגיות ביותר למד לטיפול בסרטן ומחלות ניווניות 7 9. Assay המתואר כאן מציע את האפשרות למדוד את פעילות refolding של המלווה מולקולרי מסוים ללמוד את ההשפעה של compounds על פעילותה. בשיטה זו הגן של המלווה המולקולרי הוא נחקר transfected יחד עם קידוד ביטוי עבור וקטור הגן בלוציפראז גחלילית. היא תוארה כבר denaturated בלוציפראז גחלילית ניתן וקיפלתי על ידי מלווים מולקולרית 10,11. כמו נורמליזציה מלאה transfection, קידוד וקטור עבור הגן בלוציפראז renilla הוא transfected. Transfections כל המתואר בפרוטוקול זה מבוצעות עם X-treme ג&#39;ין 11 (Roche) ב HEK-293 תאים. בשלב הראשון, סינתזת החלבון היא מעוכבת על ידי טיפול בתאי עם cycloheximide. לאחר מכן חלבון התגלגלות הוא המושרה על ידי הלם חום 45 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר התאוששות ב 37 ° C, חלבונים מחדש מקופל לתוך קונפורמציה פעילה שלהם את הפעילות של בלוציפראז גחלילית משמש לקריאה מתוך: האור יותר יופק, החלבון יותר יהיה מחדש זכתה קונפורמציה המקורי. ללא חום תאים בהלם מוגדרות כנקודת התייחסות (100% מכלל וקיפלתיבלוציפראז).

בפרוטוקול בשיטה זו כדי למדוד refolding חלבון תאיים לאחר הלם החום מתואר. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד foldases כמו מלווים המולקולרית שלהם שיתוף גורמים או תרכובות מסוגל להשפיע על פעילותם. פעילות גחלילית בלוציפראז משמש ככתב למדוד refolding פעילות המלווה.

שב וקיפל תאיים Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד קיפול מחדש של חלבון תוך-תאי התלוי בליווי (chaperone) לאחר הלם חום. באמצעות רפורטר לוסיפרז, בצע תחילה טרנספקציה לתאים עם פלסמידים המקודדים לגן הרפורטר של הלוסיפרז ולחלבון הליווי המבוקש. לאחר מכן, חלק את התאים שעברו טרנספקציה לנקודות זמן של התאוששות בהתאם למערך הניסויי.ביום למחרת, בצעו הלם חום לתאים כדי להשראת פתיחה של קיפולי החלבון (protein unfolding). המתינו להחלמה כדי להחזיר את קיפול החלבון התוך-תאי, ולאחר מכן מדדו את פעילות ה-luciferase reporter. התוצאות מודדות קיפול מחדש של חלבון התלוי בזמן ובתלויי-lyaperone, על בסיס בדיקת ה-luciferase.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת קיפול מחדש in vitro, הוא האפשרות לקבל מדד פיזיולוגי להשפעת תרכובות או חלבונים על פעילות השפרונים. ההשלכות של טכניקה זו משתמעות לטיפול במגוון רחב של מחלות, כגון מחלות נוירודגנרטיביות או סרטן, מכיוון ששפרונים ממלאים תפקיד חשוב בהתפתחות פתולוגיות אלו. ראשית, חממו מראש את מצע התרבית, את ה-PBS ואת ה-trypsin ל-37 °C במסבך מים.שטפו תרבית הופעתה (confluent) של תאי HEK 2 93 בעזרת חמישה מיליליטר של PBS. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של trypsin המכיל 0.025%EDTA, סובבו בעדינות את הפלטה להבטחת פיזור אחיד של ה-trypsin והדריכו (incubate) בטמפרטורה של 37 degrees Celsiu

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

מקור: דאל, ג'. ואחרים. זיהוי פעילות התלויה ב-pH של Escherichia coli Chaperone HdeB במבחנה ובחיים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים בדיקה מבוססת ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה להערכת פעילות צ'פרון על חלבון סובסטרט תחת לחץ חומצי וחום. הוא מפרט את השלבים לניטור התפתחות התפתחות והצטבר של המצע באמצעות פיזור אור, תוך השוואת תנאים עם ובלי המלווה (chaperone).

הערכת פעילות צ'פרון חיידקית באמצעות התפתחות תרמית של חלבון מודל

סרטון זה מתאר בדיקת פירוק עבור חלבונים שאינם מקופלים כהלכה באמצעות טיפול cycloheximide יחד עם שבר דטרגנט. שיטה זו מסייעת בחקר הדינמיקה של חלבונים שאינם מקופלים כהלכה ובחשיפת המנגנונים המעמיקים של תחלופת החלבונים.

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי

סרטון זה מתאר בדיקת מיקרו-צלחות מבוססת פלואורסצנטיות במבחנה כדי לחקור את קינטיקה הפירוק של חלבון מוטנטי לוציפראז מקופל בצורה פלואורסצנטית המבוטא בגרעינים של תאי יונקים נגועים. הבדיקה כוללת טיפול בתאים המבטאים את החלבון המוטנטי הפלואורסצנטי עם מעכב תרגום ומעכב פרוטאזום כדי להעריך את הפירוק בתיווך פרוטאזום של החלבון המקופל בצורה שגויה.

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: טכניקה לניטור קינטיקה של פירוק חלבונים גרעיניים פלואורסצנטיים שאינם מקופלים כהלכה

כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל,...

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

כאן אנו מתארים טכניקה אופטימלית לייצור ויטמין איכותי מורכב / RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד ויטמין הובלה בSTRA6, קולט RBP.

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית...

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

דוח זה מתאר פרוטוקולים למדידת שיעורי פירוק של חלבונים לא מקופלים על ידי כתם מערבי או מבחנים מבוססי פלואורסצנטיות. ניתן ליישם את השיטות לניתוח של חלבונים אחרים שקופלו בצורה לא נכונה ולסינון תפוקה גבוהה.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

אנו מספקים שיטה לסינון בו-זמנית של ספרייה של שברי נוגדנים לזיקה קשירה ומסיסות ציטופלזמית על ידי שימוש במסלול הטרנסלוקציה של Escherichia coli Twin-arginine, שיש לו מנגנון בקרת איכות מובנה לקיפול חלבון תוך תאי, כדי להציג את שברי הנוגדנים על הממברנה הפנימית.

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

הליך זה הציג את refolding של התחום מחייב ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni chemoreceptor Tlp3 מן ההכללה וגופי הטיהור להניב כמויות מיליגרם של חלבון.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

למדו למדוד קיפול חלבונים תוך-תאי לאחר הלם חום באמצעות מערכת דיווח לוציפראז. שיטה זו מאפשרת הערכת פעילות שפרונים מולקולריים בתאים חיים.

שב וקיפל תאיים Assay

גלה סרטונים נוספים