שב וקיפל תאיים Assay

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד חלבון תוך-תאי תלוי מלווה, המתקפל מחדש לאחר הלם חום. באמצעות מדווח לוציפראז תחילה טרנספט תאים עם פלסמידים המצפים את הגן המדווח של לוציפראז ואת המלווה המעניין. לאחר מכן פיצל את התאים שעברו טרנספטציה לנקודות זמן התאוששות בתכנון הניסוי.

למחרת, הלם חום מחשמל את התאים כדי לגרום לחלבון להתפתח. אפשר להתאוששות כדי להחזיר את קיפול החלבון התוך תאי, ולאחר מכן למדוד את פעילות מדווח הלוציפראז. התוצאות מודדות קיפול מחדש של חלבון תלוי זמן ותלוי מלווה על סמך בדיקת הלוציפראז.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בדיקת קיפול מחדש במבחנה, הוא האפשרות לקבל קריאה פיזיולוגית של השפעת תרכובות או חלבונים על פעילות המלווה . ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במגוון רחב של מחלות כמו מחלות ניווניות או סרטן מכיוון שמלווים ממלאים תפקיד חשוב בהתפתחות פתולוגיות אלו. ראשית, יש לחמם מראש את מדיום התרבות, PBS וטריפסין ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים.

שוטפים תרבית משולבת של תאי HEK 2 93 עם חמישה מיליליטר PBS. לאחר מכן יש למרוח מיליליטר אחד של טריפסין המכיל 0.025% EDTA, לסובב בעדינות את הצלחת לפיזור אחיד של הטריפסין ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. נער מעת לעת את הצלחת כדי לוודא ניתוק תאים.

כעת יש להשעות את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום DMEM שלם ולהעביר לצינור בז של 50 מיליליטר. לאחר מכן ספר תאים באמצעות לוחית מונה של בקמן. התאים בשטף של כ-60 עד 70% ודוגרים במשך שש עד שמונה שעות.

לאזן את הגן הקיצוני, תשעה ריאגנטים לטמפרטורת החדר ואת העלייה של מדיום חופשי בסרום ל-37 מעלות צלזיוס. הכניסו את הסרום לשתי שפופרות. לאחר מכן הוסף את המגיב הקיצוני של גן תשע מבלי לגעת בדופן צינור האיינור למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בינתיים, הכינו את תערובות הטרנספקציה הדו-ממדיות של NA בצינור הראשון, הוסיפו גחלילית וניל ובקרת וקטור ריקה בצינור השני. מוסיפים את גחלילית הוניל ואת המלווה המולקולרי. הוסף את ה- DNA למערבולת תערובת ריאגנט טרנספקציה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

המשיכו להוסיף את התערובת הזו על התאים המצופים ודגרו למשך 24 שעות. קצרו את התאים המועברים באמצעות תאי זרעי טריפסין בשטף של 60 עד 70% בשש צלחות באר, והשאירו אותם בחממה למשך הלילה. שאפו את המדיום מתאים שעברו טרנספטציה.

לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מאגר הלם חום ודוגרים למשך 30 דקות. כדי לעצור את סינתזת החלבון של Denovo, יש לאטום את המכסים ברצועות פרפורמים ולדגור באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כעת הסר את הפרפורם והנח את התאים בחזרה לאינקובטור להתאוששות בנקודות זמן מוגדרות.

קצרו את התאים ושטפו פעם אחת ב-PBS לקבלת הצמדת ליזה יעילה של תאים, הקפיאו את גלולת התא בחנקן נוזלי, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה פסיבי מדולל. עכשיו aliquot בשלוש עותקים. 30 מיקרוליטר של התא ליזאט לבאר של צלחת 96 בארות.

על מנת להעריך את יעילות הטרנספקציה, התחל עם דגימות הייחוס הלא מזועזעות. כדי למדוד פעילות לוציפראז רץ, הכינו לוציפר טרי של 0.2 מילי-מולרית במאגר תגובת מאגר גלי גלי המכיל מילי-מולרית אחת A TP ו-0.2 מיקרו-מולרית מאגר תגובת אזין. הכנס את צלחת 96 הבאר לתוך הלומינומטר והתחל את התוכנית.

תחנת עבודה וולך 1420. הכניסו את המשאבה אחת לתוך צינור ה-Falcon המכיל 0.2 מאגר תגובת אזין מיקרו-מולרי. בחר מהתפריט, את האפשרות תחזוקת מתקן וסימון משאבת אחת.

בחרו באפשרות fill לעריכת פריסת הצלחת. בחר באפשרות, חקור את הפרוטוקול והתוצאות בתפריט. בחר את הפרוטוקול.

כעת בחר את הבארות לקריאה. חזור למנהל וולך ולחץ על התחל כדי למדוד את הפליטות לדוגמה. ב-482 ננומטר, המשך לתחזוקת המתקן ובחר ריק ושאב אחד כדי לשחרר את כל התמיסה הנותרת בחזרה לצינור.

עכשיו העבירו את הצינור לבז המכיל מים וקרציות, שטפו. המשך על-ידי בחירה באפשרות ריק. לאחר מכן הנח את הצינור ממשאבה אחת לתוך מאגר התגובה ואת הצינור ממשאבה שתיים לתוך תמיסת LUCIFERIAN.

שנה את פריסת הצלחת. בחר מילוי עבור משאבה אחת ומשאבה שתיים. מתפריט תחזוקת המתקן, בחר את הפרוטוקול והתחל למדוד את אורך הגל של תגובת לוציפראז הגחלילית של 560 ננומטר.

בתום החזרה, חזור על ההליך, ריק, סומק, ריק. עבור משאבה אחת ומשאבה שתיים, צפו בתוצאות ב-Wallach 1420 Explorer. כל ניסוי קשור לבדיקה.

מספר תוצאות ייצוא של תאריכי התחלה וסיום של שם משתמש כקובץ Excel. לניתוח קיפול מחדש של חלבון קשור ישירות לזמן ההתאוששות. בניסוי זה, תאים מוערכים בנקודות זמן שונות לאחר הלם חום.

בהיעדר ובנוכחות מלווה מולקולרי. כצפוי, אחוז הלוציפראז המקופל מחדש עולה עם זמן התאוששות ממושך הן בבקרות והן בתאים שעברו טרנספטציה עם המלווה המולקולרי. לעומת זאת, מערך נתונים לא חוקי מציג ערכי R בריבוע גרועים למתאם בין זמן לקיפול מחדש.

בעקבות טכניקה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת TPA במבחנה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו עיכוב הפעילות האנזימטית של המלווה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד חלבון תוך תאי. אנחנו עוקבים אחרי הלם טרמפ.