מערכת ניסיונית ללמוד Mechanotransduction ב לתאי ריאה עוברית

כוחות מכניים לשחק תפקיד מפתח בהתפתחות הריאות ופגיעה ריאות. כאן אנו מתארים שיטה לבודד העובר מכרסמים ריאה מסוג תאים השנייה אפיתל fibroblasts ולחשוף אותם באמצעות גירוי מכני

מטרת הליך זה היא לתאר מערכת ניסויית לחקר התמרה מכנית בתאי ריאה עובריים. זה מושג על ידי קידוד לוחות תרבית עם חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. לאחר מכן מבודדים תאי אפיתל מסוג שני ריאות של עכבר עוברי, ואחריהם בידוד של פיברובלסטים עובריים של עכבר.

השלב האחרון מתאר מערכת חוץ גופית המספקת גירוי מכני לתאי הריאה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות עלייה בהתמיינות תאים מסוג 2 באמצעות תמונות PCR בזמן אמת, כתם מערבי ואימונוכימיה פלואורסצנטית. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התמרת המכאנו, כגון התפתחות ריאות עובר ופגיעה בריאות.

מדגים את ההליך יהיה ג'וליאן גו, טכנאי מהמעבדה שלי בזמן שאנחנו עובדים במכסה זרימה למינרי בתנאים סטריליים מייצר 120 מיקרוגרם למינין עם 12 מיליליטר קר סטרילי XPBS אחד לצלחת. ניתן להשתמש בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים אחרים לציפוי. עיין בפרוטוקול הכתוב לפרטים, ולאחר מכן קח צלחת BioFlex לא מטופלת והוסף שני מיליליטר מתמיסת הלמינציה לכל באר לריכוז סופי של שני מיקרוגרם לסנטימטר מרובע.

ודא שהבארות מכוסות לחלוטין על ידי התמיסה. מכסים את הצלחת במלואה בניילון נצמד ומניחים על משטח ישר בסביבה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לרבד להיספג לתחתית הבארות. ניתן לאחסן צלחות מצופות בתנאים אלה למשך שבוע לפחות תוך שמירה על תפקוד ECM טוב למחרת.

בתנאים סטריליים יש לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם XPBS אחד. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של 1% BSA ב-XPBS אחד לכל אחד. דגרו היטב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לחסום אתרי קשירה לא ספציפיים על הממברנות.

ואז שוב, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם XPBS אחד. כדי להסיר חלבונים שלא נספגו, הוסף מיליליטר אחד של DMEM לכל באר בצלחת. לאחר מכן אחסן את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד ששני תאי אפיתל מסוג ריאת מכרסמים עובריים מבודדים ומוכנים לציפוי.

יום לפני תחילת הליך בידוד התאים, הרכיבו את כוסות המסך עם רשתות ניילון 130 ו-15 מיקרון ועקרו אותן על ידי חיטוי. כמו כן, חיטוי אותו מספר של פסגות זכוכית של 150 מיליליטר ביום התרבות. השג ריאות עובריות מעכברה בהריון מתוזמן ב-E 17 עד 19 להריון.

מעבירים את הרקמה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר המכיל מדיום DMEA ומניחים אותה על קרח. הכינו מאגר עיכול טרי בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר לפי המתכון בפרוטוקול הכתוב. ותוך כדי עבודה במסנן קולט אדים למינארי, יש לעקר דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרון.

10 מיליליטר של מאגר זה מספיקים לרקמת הריאה המתקבלת מכ-20 עוברי עכברים. הנח את הצינור החרוטי המכיל את מאגר העיכול באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הורד את ה-dium מהצינור החרוטי המכיל את רקמת הריאה של העובר והעביר את הרקמה לצלחת פטרי סטרילית באמצעות מספריים סטריליות או סכין גילוח, טחון את הרקמה לחתיכות בגודל של פחות ממילימטר אחד.

לאחר מכן העבירו את הרקמה לצינור החרוטי המכיל את מאגר העיכול הטרום-חם. לאחר מכן, סייע מכנית לעיכול הרקמה על ידי פיפטינג של תרחיף תאי הריאה של העובר מאה פעמים כל אחד באמצעות פיפטות בגודל צמצם יורד. לאחר השלמת תהליך העיכול, צנטריפוגה את ההומוגנאט ב -1, 300 סל"ד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הסר בזהירות את השכיבה על ידי שאיפה והשהה מחדש את הגלולה המכילה את התאים ב -15 מיליליטר DMEM בתוספת 20% FBS. לאחר מכן, שלפו את כוסות המסך עם רשתות ניילון של 130 ו-15 מיקרון והניחו אותן על גבי כוסות ה-150 מיליליטר הסטריליות. פיפטה התא הומוגני על רשת 100 מיקרון.

אוספים את המסנן ומעבירים אותו על רשת 30 מיקרון. שטפו את רשת ה-30 מיקרון מספר פעמים עם DMEM טרי בתוספת 10% FBS. רוב התאים מסוג שני מתקבצים יחד ואינם עוברים דרך הרשת.

שטיפות אלו מסירות תאים שאינם אפיתל שעלולים להיות מחוברים לגושים. מרחו את הפילטר מהרשת של 30 מיקרון על הרשת של 15 מיקרון. שוב, יש לשטוף מספר פעמים כמו קודם.

שלב זה מגייס תאים מסוג שני שאולי עברו דרך רשת ה-30 מיקרון. אסוף את התאים הלא מסוננים הגושים מרשתות 30 ו-15 מיקרון להעשרה נוספת של תאים מסוג שני. שמור על הסינון מהרשת של 15 מיקרון אם יש לגדל פיברובלסטים של ריאות מכרסמים עובריים.

אחרת, השליכו את התסנין הזה. נוסף. טהר את אוכלוסיית תאי האפיתל מסוג 2 על ידי הוספת מדיה ודגירה של התאים הלא מסוננים מכוסות הרשת של 30 ו-15 מיקרון בבקבוק תרבית רקמות של 75 סנטימטר מרובע למשך 30 דקות לאחר צנטריפוגת הדגירה הזו את שם העל כמו קודם, הפעילו את התאים ולאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של פיפטה DMEM pro fetus ללא סרום מיליליטר אחד של תרחיף התא לכל באר של הלמינציה המצופה שש צלחות באר BioFlex בשלב זה, התאים מופיעים בגושים כאשר הם נצפים תחת המיקרוסקופ, דוגרים את הצלחת בחממת תרבית רקמות המוגדרת על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. דגירה של 24 שעות היא אופטימלית ונדרשת דגירה של שש שעות לפחות.

לפני שתתחיל בניסויי מתח מכניים, קח את המסנן מהרשת של 15 מיקרון והעביר לבקבוק תרבית רקמה בגודל 75 סנטימטר מרובע ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות כדי לאפשר לפיברובלסטים להידבק, לשאוב ולהשליך את הסט. לאחר מכן החלף את הנפח בבקבוק ב-DMEM ללא סרום ודגר למשך הלילה. למחרת, קצרו את התאים עם 0.25% טריפסין ב-0.4 מילי-מולרי EDTA וצלחו אותם על לוחות BioFlex מצופים פיברונקטין בדגירה באינקובטור תרבית רקמה המוגדר ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, באופן אידיאלי למשך 24 שעות לפני תחילת ניסויי מאמץ מכניים.

נדרשת דגירה של שש שעות לפחות אם נדרש מספר מסוים של תאים לניסויים. תאים מסוג שני נשמרים בצלוחיות DMEM 75 סנטימטר רבוע ללא סרום לאחר הבידוד, ולמחרת התאים נספרים בטריפס, ואז יושבים חד-שכבתי לא צריכים להיות גדולים מ-80% לפני תחילת הניסויים. ביום ניסוי הגירוי המכני, אמצעי תרבית התאים מוחלף בשני מיליליטר של DMEM טרי ללא סרום לכל באר, ולאחר מכן הצלחת מותקנת ביחידת מתח של תא גמיש FX 5,000.

לאחר מכן, הפעל מתח דו-צירי EQU על הממברנות. משטר המתח משתנה בהתאם לסימולציה של כוחות מכניים in vivo. כפי שנדון בפרוטוקול הכתוב, תאים שגדלו על ממברנות שאינן ST נמתחו.

תרבית במקביל משמשת כבקרות לניסוי. בסוף הניסוי, ניתן לעבד חד-שכבות כדי לנתח שינויים בביטוי גנים על ידי PCR בזמן אמת או שינויים בשפע החלבון על ידי כתם מערבי. בנוסף, ניתן לתקן חד-שכבות לניסויים אימונוכימיים לטכניקה זו.

לאחר הקיבוע, ממברנות אסטיות נחתכות מהצלחות ומורכבות על שקופיות זכוכית תוך שימוש ב -10 עד 20 מיקרוליטר מים כחומר הרכבה לפני חדירה ודגירה עם נוגדנים. הסופר דטין מהניסוי יכול לשמש גם כדי לחקור את נוכחותם של חומרים משוחררים כמו גורמי גדילה או ציטוקינים. תמונה זו מציגה שני תאי אפיתל עובריים קבועים קבועים E 18 שבודדו כמו בפרוטוקול זה ומצופים על לוחות BioFlex המקודדים בלמינין.

התאים תוקנו והתצלום צולם. יום לאחר תאי מתיחה שאינם ST היו מצופים. טוהר התאים נקבע כ-90 פלוס מינוס 5% על ידי ניתוח מיקרוסקופי של מורפולוגיה של תאי אפיתל וצביעה חיסונית לחלבון פעילי שטח C.האיורים הבאים מציגים נתונים מתאי אפיתל עובריים מסוג שני שנחשפו למתח מחזורי של 5% ב-40 מחזורים לדקה במשך 16 שעות.

כתם צפוני זה של ביטוי mRNA של חלבון פעילי שטח C ממחיש כי זן גורם להתמיינות תאים מסוג שני באמצעות מצעי ECM שונים. סימני הפלוס מינוס מייצגים חשיפה למתח או אי חשיפה למתח בהתאמה. נתוני הביטוי מוצגים בהיסטוגרמה כממוצע פלוס או מינוס SEM, ה-N שווה לשלוש, והכוכבית מציינת ערך P של פחות מ-0.05.

תמונות אימונוכימיה פלואורסצנטיות אלה מראות רמות חלבון פעילי שטח C בירוק. בסוג עוברי שני תאים שלא נחשפו למתח מכני משמאל ונחשפו למתח מכני בגרעינים הימניים היו מוכתם נגד עם dapi, שנראה כחול. היסטוגרמה זו מכמתת את תוצאות הכתם המערבי משלושה ניסויים המראים כי מתיחה מכנית מעלה את רמות חלבון פעילי השטח C.

בניסוי זה, ה-N שווה ל-3 והכוכבית מציינת ערך P של פחות מ-0.05. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להאיץ את תאי הריאה של העובר ולחשוף אותם למתיחה מכנית.