מערכת ניסיונית ללמוד Mechanotransduction ב לתאי ריאה עוברית

מטרת הליך זה היא לתאר מערכת ניסויית לחקר התמרה מכנית בתאי ריאה עובריים. הדבר משיג על ידי ציפוי פלטות תרבית בחלבוני מטריצה חוץ-תאית. לאחר מכן מבודדים תאי אפיתל מסוג 2 מריאות עובריות של עכבר, ולאחריהם מבודדים פיברובלסטים מריאות עובריות של עכבר.

השלב הסופי מתאר מערכת in vitro למתן גרייה מכנית לתאי ריאה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות עלייה בדיפרנציאציה של תאים מסוג שני באמצעות real-time PCR, western blot ותמונות אימונוכימיה פלואורסצנטיות. שיטות אלו יכולות לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום ההעברה המכנית (mechanotransduction), כגון התפתחות ריאות עוברית ופגיעות ריאה.

את הפרוצדורה ידגים ג'וליאן גו (Julian gu), טכנאי מהמעבדה שלי. בעודנו עובדים תחת מ 빠르게-זור (laminar flow hood) בתנאים סטריליים, נכין 120 מיקרוגרם של למינין (laminin) ב-12 מיליליטר של 1XPBS סטרילי קר לכל פלטה. ניתן להשתמש בחלבונים אחרים של המטריצה החוץ-תאית לציפוי. עיינו בפרוטוקול הכתוב לפרטים, לאחר מכן קחו פלטת BioFlex לא מטופלת והוסיפו שתי מיליליטרים של תמיסת הלמינין לכל באר, עד לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם לסנטימטר רבוע.

וודאו שהבארים מכוסות לחלוטין על ידי התמיסה. כסו את הפלטה במלואה בנייר נשף והניחו אותה על משטח שטוח בסביבה של 4 °C למשך הלילה, כדי לאפשר ללמינציה להיספג לתחתית הבארים. ניתן לשמור פלטות מצופות בתנאים אלה למשך שבוע לפחות תוך שמירה על תפקוד טוב של ה-ECM למחרת.

בתנאי סטריליות, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 1X PBS. לאחר מכן, הוסיפו לכל בארה מילליטר אחד של 1% BSA ב-1X PBS. דגרו את הבארות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים על הממברנות.

לאחר מכן, שטפו את הבארות שלוש פעמים ב-XPBS. כדי להסיר חלבונים שלא נספגו, הוסיפו מיליליטר אחד של DMEM לכל בארה בלוחית. לאחר מכן, אחסנו את הלוחית בטמפרטורה של 37 °C עד שבידוד תאי אפיתל מסוג 2 מריאות של עובר מכרסם יושלם והם יהיו מוכנים לזריעה.

ביום שלפני תחילת הליך בידוד התאים, הרכיבו את כוסות הסינון עם רשתות ניילון של 130 ו-15 מיקרון ועקרו אותן באמצעות אוטוקלאב. עקרו באוטוקלאב מספר זהה של בקבקי זכוכית (glass peaks) בנפח 150 מיליליטר ביום התרבית. השגיו ריאות עובריות מעכבר בהריון במועד של E 17 עד 19 של gestation.

העבירו את הרקמה למבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר המכילה מצע DMEA והניחו אותה על קרח. הכינו תמיסת עיכול רעננה במבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר לפי המתכון המופיע בפרוטוקול הכתוב. ובזמן העבודה תחת מנדף עם זרימה למינרית, סננו את התמיסה באמצעות מסנן מזרקה של 0.2 מיקרון לצורך עיקור.

10 milliliters של באפר זה מספיקים לרקמת ריאה שהושגה מכ-20 עוברים של עכברים. מקמו את הפסולה הקונית המכילה את באפר העיכול במבן מים בטמפרטורה של 37 °C. הוציאו את הרקמה מהפסולה הקונית המכילה את רקמת הריאה העוברית והעבירו אותה לצחנת פטרי סטרילית באמצעות מספריים סטריליים או להב תער, וקצצו את הרקמה לחתיכות שגודלן פחות מ-1 millimeter.

לאחר מכן, העבירו את הרקמה למבחנה קונית המכילה את תמיסת העיכול שחוממה מראש. לאחר מכן, סייעו באופן מכני לעיכול הרקמה על ידי פיפוט של תרחיף תאי ריאות העובר מעלה ומטה מאה פעמים בכל פעם, תוך שימוש בפיפטות בעלות פתח קטן יותר ויותר. לאחר השלמת תהליך העיכול, סבבו את ההומוגנאט בצנטריפוגה במהירות של 1,300 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסירו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות שאיבה ושעלו שוב את המשקע המכיל את התאים ב-15 milliliters של DMEM בתוספת 20%FBS. כעת, הוציאו את כוסות הסינון עם רשתות ניילון של 130 ו-15 מיקרון והניחו אותן מעל כוסות סטריליות של 150 milliliters. העבירו בעזרת פיפטה את הומוגנאט התאים אל על הרשת של 100 מיקרון.

אספו את התסנן והעבירו אותו בעזרת פיפטה לרשת של 30 מיקרון. שטפו את רשת ה-30 מיקרון מספר פעמים ב-DMEM טרי בתוספת 10% FBS. מרבית התאים מסוג שני נצמדים זה לזה ואינם עוברים דרך הרשת.

שטיפות אלו מסירות תאים שאינם אפיתליאליים שעשויים להיות צמודים לגושים. העבירו את התסנין מהרשת של 30 micron למסננת של 15 micron. שטפו שוב מספר פעמים כפי שנעשה קודם לכן.

שלב זה גייס את תאי סוג שני שעשויים היו לעבור דרך רשת ה-30 micron. אספו את התאים הבלתי מסוננים שהצטברו ברשתות ה-30 וה-15 micron לצורך העשרה נוספת של תאי סוג שני. שמרו את התסנין מרשת ה-15 micron במידה ויש צורך בתרבית של פיברובלסטים של ריאה עוברית של מכרסמים.

במקרה אחר, יש להשליך מסננת זו. לאחר מכן, טהרו את אוכלוסיית התאי האפיתליים מסוג 2 על ידי הוספת מצע והדגרה של התאים שלא עברו סינון מהמסננויות בגודל 30 ו-15 מיקרון בבקבוק תרבית רקמה של 75 סנטימטר רבוע למשך 30 דקות. לאחר הדגרה זו, צנטריפגו את הנוזל העליון כפי שנעשה קודם לכן, השליכו את הנוזל שמעל המשקע ואז השעיקו מחדש את המשקע ב-2 מיליליטר של DMEM ללא סרום. העבירו באמצעות פיפטה 1 מיליליטר מתליהית התאים לכל באר של פלטות BioFlex בעלות 6 בארות המצופות בלמינאט. בנקודה זו, התאים ייראו כצברים כאשר הם נצפים תחת המיקרוסקופ. הדגירו את הפלטה באינקובטור לתרבית רקמה המוגדר ל-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide. הדגרה של 24 שעות היא אופטימלית, והדגרה של 6 שעות לפחות היא הכרחית.

לפני תחילת ניסויי המתיחה המכנית, קחו את התסנין מהמסנן של 15 micron והעבירו אותו לבקבוק תרבית רקמה של 75 square centimeter בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 עד 60 דקות כדי לאפשר לפיברובלסטים להיקשר; שאבו והשליכו את העל-סף. לאחר מכן, החליפו את הנפח בבקבוק ב-DMEM ללא סרום והדגריו למשך הלילה. למחרת, קצרו את התאים באמצעות 0.25%trypsin ב-0.4 millimolar EDTA ושתלו אותם בצלחות BioFlex מצופות פיברונקטין; הדגירו באינקובטור לתרביות רקמה המכוון ל-37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide, באופן אידיאלי למשך 24 שעות לפני תחילת ניסויי המתיחה המכנית.

דרושה דגירה של שש שעות לפחות אם נדרש מספר תאים ספציפי עבור הניסויים. תאי סוג 2 מתוחזקים בבקבוקי DMEM נטולי סרום בנפח של 75 סנטימטר רבוע לאחר הבידוד, ולמחרת התאים עוברים טריפסינציה, ספירה, ולאחר מכן זריעה. השכבה החד-שכבתיות (Monolayer) לא צריכה לעבור התמגשות (confluence) של יותר מ-80% לפני תחילת הניסויים. ביום הניסוי של הגירוי המכני, מצע תרבית התאים מוחלף בשני מיליליטר של DMEM טרי נטול סרום לכל באר, ולאחר מכן הפלטה מורכבת ביחידת מתיחה מסוג flex cell FX 5,000.

בשלב הבא, הפעילו מאמץ דו-צמתי (biaxial strain) שווה על הקרומים. משטר המאמץ משתנה בהתאם לסימולציה של הכוחות המכניים in vivo. כפי שנדון בפרוטוקול הכתוב, תאים שגדלו על קרומים שאינם מתוחים (non-ST).

תרביות במקביל משמשות כביקורות לניסוי. בסיום הניסוי, ניתן לעבד את השכבות החד-שכבתיות (monolayers) כדי לנתח שינויים בביטוי גנים באמצעות real-time PCR או שינויים בשכיחות חלבונים באמצעות western blot. בנוסף, ניתן לקבע את השכבות החד-שכבתיות עבור ניסויי אימונוכימיה בטכניקה זו.

לאחר הקיבוע, ממברנות אסטיות נגזרות מהפלטות ומוצמדות לשקיקיות זכוכית באמצעות 10 עד 20 µL של מים כחומר הצמדה, לפני שלב הפרמיאציה והדגירה עם נוגדנים. ניתן להשתמש גם בסופרנאט מהניסוי כדי לבחון את נוכחותן של חומרים ששחררו, כגון גורמי גדילה או ציטוקינים. תמונה זו מציגה תאי אפיתל מסוג 2 עובריים ביום 18 (E 18) מקובעים בפורמלין, אשר בודדו לפי פרוטוקול זה ונשתלו בפלטות BioFlex מצופות למינין.

התאים קובעו והצילום נלקח. למחרת, לאחר מתיחה שאינה ST, התאים נזרעו. טהרת התאים נקבעה כ-90% פלוס או מינוס 5% באמצעות אנליזה מיקרוסקופית של מורפולוגיית תאי אפיתל וצביעה אימונוהיסטוכימית לחלבון סורפקטנט C. הדמויות הבאות מציגות נתונים מתאי אפיתל עובריים מסוג שני שנחשפו למתיחה מחזורית של 5% ב-40 מחזורים לדקה למשך 16 שעות.

סמיכה זו של Northern blot עבור ביטוי mRNA של חלבון סורפקטנט C ממחישה כי מאמץ מכני משרה גבישת תאים מסוג שני תוך שימוש בתתי-מצעים שונים של ECM. הסימנים פלוס ומינוס מייצגים חשיפה למאמץ או אי-חשיפה למאמץ, בהתאמה. נתוני הביטוי מוצגים בהיסטוגרמה כממוצע פלוס או מינוס SEM, כאשר N שווה לשלושה, והכוכבית מציינת ערך P של פחות מ-0.05.

תמונות אימונוכימיה פלואורסצנטיות אלו מראות את רמות חלבון surfactant protein C בירוק. בתאי סוג שני עובריים שלא נחשפו למאמץ מכני משמאל, ובאלו שנחשפו למאמץ מכני מימין, הגרעינים נצבעו בצביעה נגדית של dapi, המופיע בכחול. היסטוגרמה זו מכמתת תוצאות של western blot משלושה ניסויים, המראים שמתיחה מכנית מגבירה את רמות חלבון surfactant protein C.

בניסוי זה, ה-N שווה לשלוש והכוכבית מציינת ערך P הקטן מ-0.05. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להאיץ תאי ריאה עובריים ולהחמיע אותם למתיחה מכנית.