נבט השתלת ורקמות testis Xenografting ב עכברים

בסרטון זה מודגמות שתי טכניקות קשורות. הראשון הוא השתלת תאי גזע של זרע או השתלת SSC, והשני הוא בדיקת רקמות אלה. קסנוגרפ. השתלת SSC משמשת ליצירת זרע מ-SSCs של תורם באשכים של מקבל.

זה מושג על ידי הכנת תרחיף תאים מאשכים של תורם או תאים מתורבתים המכילים SSCs מתורם עם סמן טרנסגני הניתן לזיהוי כגון GFP או LAC Z.לאחר מכן, האשכים של הזכר המקבל מוחצנים. המושתל טופל כך שהאשכים שלו מתרוקנים מתאי נבט. לאחר מכן מבודדים את ברווזי ה-EENT של הזכר המקבל ומוזרקים להם תאי תורם שעורבבו עם טאן.

צבע כחול. בסופו של דבר קולוניזציה של אפיתל הזרע של המקבל. צינוריות זרע על ידי תאי נבט שמקורם בתורם ניכרות חודשיים עד שלושה לאחר ההשתלה שנצפו בדוגמה זו על ידי צביעת xal של אשכי הנמען המדגימה קולוניזציה של תאי תורם המבטאים חוסר Z.

הטכניקה השנייה שתודגם בסרטון זה כוללת קסנוגרפט של רקמת האשכים. רפטינג רקמות אשכים משמש להחדרת התפתחות אשכים וזרע ממין תורם על ידי השתלת שברי אשכים מתורמים לא בשלים למארחי עכברים חסרים. זה מושג על ידי הכנת שברי רקמה מתאימים להשתלה מאשכיו של מין תורם גדול כמו חזיר כמו בדוגמה המוצגת כאן.

השלב הבא הוא לסרס עכבר מושתל בוגר חסר חיסון ולאחר מכן להשתיל את שברי האשכים של התורם מתחת לעור הגבי של העכבר המקבל. העכברים המקבלים מתפקדים כמו אינקובטורים in vivo, ומאפשרים התפתחות מלאה של השתלות האשכים תוך שישה עד שבעה חודשים בהתאם למין התורם. השתלת תאי גזע ספרל פותחה לראשונה על ידי ראלף בריסטר ועמיתיו באוניברסיטת פנסילבניה ודווחה לראשונה בשנת 1994.

מאז הוא מצא יישום נרחב וכיום מייצג את הבדיקה הביולוגית של תקן הזהב בתחום הביולוגיה של תאי גזע של קו הנבט כדי לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי גזע של קו הנבט, כגון הבהרת מסלולי איתות השולטים בחידוש עצמי של תאי גזע. הרעיון לראשונה להשתלת זרעים עלה כאשר אנו מזהים שהשתלת תאי גזע מבודדים מתורמים שאינם מכרסמים, למשל, חזירים, פרימטים או בני אדם לאשך של עכבר, לא הביאה לזרע שמקורו בתורם מלא. קבענו כי שימור המיקרו-סביבה של האשך על ידי השתלת שברים קטנים של רקמת האשך במקום תאי נבט מבודדים יכול להתגבר על מגבלה זו ולהוביל לזרע שמקורו בתורם מלא ממין מרוחק מבחינה פילוגנטית במארח עכבר.

זה דווח לראשונה על ידינו בשנת 2002. פרוטוקול השתלת תאי נבט דורש הכנת תרחיף התא להזרקה. עיין בכתב היד הכתוב לפרטי הכנה.

התחל את הליך ההשתלה על ידי הרדמת העכבר המקבל והקפדה על עומק הרדמה מספיק על ידי הקפדה על כך שהוא אינו מציג רפלקס כאב. לאחר מכן מקם את גב החיה שוכב והכן בניתוח את אזור הבטן. בצע חתך בקו האמצע באורך של כסנטימטר אחד כדי לחשוף את דופן הבטן.

הרם את הקיר באמצעות מלקחיים בנקודת הקו הלבן כדי למנוע פגיעה בטעות באיברי הבטן. לאחר מכן בצע חתך של חצי סנטימטר כדי לחשוף את חלל הצפק בעזרת מלקחיים עדינים. הוצא את האשך על ידי משיכת כרית השומן המחוברת לאשך ולאפידידימוס, והנח מבנים אלה על כרטיס אינדקס סטרילי.

כעת הוסף צבע כחול טריאן למתלה התאים. לאחר מכן טען את מתלה התא לצינור פוליאתילן המחובר למזרק מיליליטר אחד והצמד את הפיפטה המשוככת לצינור. דחפו בעדינות את מתלה התא לתוך הפיפטה על ידי הפעלת לחץ על המזרק.

כעת אנו הולכים להעדיף את השלב הקריטי ביותר להשתלת SCC, שהוא זיהוי וקנולציה של צינורות אף אוזן גרון. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, זהה את הצינורות הזורמים בין האשכים ל- EPIs והסר בעדינות את רקמת השומן סביב הצינורות. עבדו בזהירות מכיוון שהברווזים והקרום סביבם שקופים.

ייצב את התעלות על ידי כוסות רוח בחתיכת פלסטיק משולשת סטרילית. לאחר מכן הכנס בזהירות את פיפטת ההזרקה לצינור בצרור צינורות פרין. השחילו בעדינות את הפיפטה כמה מילימטרים לכיוון האשך.

שמירה על פיפטת ההזרקה דוממת, הזריקה לאט לאט את התאים כאשר האשך האחורי והצינוריות הברזליות מתחילות להתמלא, שומרת על זרימה קבועה עד שכמעט כל הצינוריות הנראות על פני השטח מתמלאות. אין למלא יתר על המידה או שהאשך יהפוך לאיסכמי. כעת החזירו את האשך לחלל הבטן וחזרו על ההליך על האשך הנגדי.

בסיום, סגור את דופן הבטן עם שישה תפרי משי או וסגור את העור עם קליפסים פצעי מתכת. לאחר הניתוח, יש לעקוב אחר העכבר על משטח חימום עד שהוא מתאושש מספיק מההרדמה כדי להחזירו לגיל הכלוב הביתי שלו. ההליך השני שיש להדגים, השתלת רקמת אשך, כרוך בשימוש בביופסיות אשכים או באשכים שלמים מתורמים.

במקרה של ביופסיות, יש לשטוף את שברי האשכים פעמיים או שלוש במדיום תרבית קר כקרח המכיל אנטיביוטיקה. לאחר כל שטיפה, סובב את המתלה והעלה את הגלולה. בתמיסה טרייה, העבירו את רקמת הכביסה לכלי נקי וחתכו את הביופסיות לשברים קטנים יותר להשתלה.

שימוש במלקחיים מעוקלים ולהב אזמל אשכים שלמים דורשים הכנה רבה יותר. התחל בשטיפת כל אשך ו-PBS קר כקרח המכיל אנטיביוטיקה פעמיים או שלוש. ואז העבירו את האשכים הנקיים לכלי נקי עם PBS.

לאחר מכן, הסר את הטוניקה של הנרתיק על ידי ביצוע חתך לאורך פני השטח והוציא את האשכים. הסר את כל מבני הנספח כגון matic, cord, epididymus ורקמת חיבור. שוטפים את האשכים המופקים פעם אחת ב- PBS קר ומעבירים אותם לכלי תרבות עם PBS.

לאחר מכן, הסר בזהירות את הטוניקה אלבוגינאה בעזרת להב אזמל במספריים. אם האשכים קטנים מאוד, ניתן להסיר את הטוניקה על ידי סחיטת רקמת האשך מהטוניקה דרך חתך קטן בכלי תרבית קטן מלא בקרח. מדיום קר, חותכים בהדרגה את האשכים לחתיכות קטנות כפי שתואר קודם לכן.

לבסוף, בחר שברי רקמה ל-xenograft ובודד אותם בכלי תרבית עם מדיום תרבית קר כקרח עד שהם נחוצים. להרדים עכבר כפי שתואר קודם לכן. ואז עם העכבר על משטח חימום.

הכן את שדה הניתוח הסטרילי על ידי גזירת השיער על הבטן והגב. נגב את הבטן עם 70% אתנול ותמיסת בטדין. כדי לבצע את הסירוס, בצע חתך עור בקו האמצע הגחוני של חצי סנטימטר עד סנטימטר אחד כדי לחשוף את דופן הבטן.

לאחר מכן חתוך את דופן הבטן כדי לחשוף את חלל הבטן. חשוף בזהירות את האשכים, עורק האשכים והאפידידימוס כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן נתק את זנב ה-EPIs מהגוברנקולום על ידי דיסקציה קהה.

לאחר מכן, קשרו את עורק האשכים בכבוד VA יחד עם כלי הדם באמצעות תפרי משי. לאחר מכן חתכו את המבנים הקשורים על ידי חיתוך בין האשכים לקשירה. לאחר חזרה על ההליך עבור האשך השני, תפר את דופן הבטן עם תפר כירורגי אחד או שניים וסגור את חתך העור עם קליפס מיקרופון אחד או שניים כדי להשתיל את השתלות החוץ רחמיות.

מקם עכבר מורדם מסורס בשכיבה גחונית והכין שדה כירורגי סטרילי על גבו. עבור כל שתל שיוכנס, בצע חתך עור באורך של חצי סנטימטר בכל צד של קו האמצע באמצעות מלקחיים כדי להחזיק גבול של חתך העור. השתמש במספריים כדי ליצור חלל תת עורי בעומק של חמישה עד 10 מילימטרים.

הפרידו את רקמת החיבור כדי ליצור חלל עמוק מספיק עבור השתל כך שהוא לא ייתפס על ידי קליפ הסגירה. שימוש במלקחיים עדינים. הנח חתיכה מרקמת האשך עמוק לתוך החלל התת עורי המחזיקה את גבול חתך העור בעזרת מלקחיים לקשתית.

סגור כל חתך בעור עם תפס מיקרופון אחד. לאחר מכן אפשר לעכבר להתאושש מההרדמה על כרית חימום. לאחר ההתאוששות, העבירו את העכבר לכלוב הביתי שלו והמשיכו לעקוב אחריו עד להתאוששות מלאה.

תאי גזע של זרע תורם מושתלים המבטאים טרנסגן lae נמצאו כמאכלסים את האשך של המקבל חודשיים עד שלושה לאחר ההשתלה iCal. הצביעה חשפה מקטעים כחולים מובהקים של צינורות הזרע של המקבל. למושבה מבוססת היטב יש רצועה ארוכה בצבע כחול כהה של מקטעים מלאים לחלוטין עם שתי שכבות או יותר של תאים כחולים קרובים יותר למרכז בשני קצות המושבה.

ניכרת גם רשת של זוגות בודדים או קבוצות קטנות של תאים. חתך רוחב של אזור צינורית הזרע הכחולה הכהה חשף אגנזה של פראטו, מבוססת ומאורגנת היטב עם תאי נבט כחולים בשלבי התמיינות שונים. במקרה של רקמות האשכים, שברי קסנוגרפט של אשך תורם לא בוגר הושתלו מתחת לעור הגבי של עכברים חסרי חיסון והצליחו לשרוד ולהגיב לגונדוטרופינים של עכברים.

וכתוצאה מכך, רקמת האשכים עברה התפתחות מלאה, כולל היווצרות זרע מוכשר להפריה. לאחר שנאספו השתלות אשכים, הם שימשו להשגת זרע לייצור אקסי ועוברים. השתלת תאי גזע מטומטמת מקדמת את תחום הביולוגיה של תאי גזע באמצעות חקר אינטראקציות נישה של תאי גזע באשכים ופיתוח תנאי תרבית להרחבת תאי גזע של תאי גזע רפואיים במבחנה לאחר התפתחות קסנוגרפט של רקמת האשכים.

הטכניקה סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הרבייה הגברית לחקור היבטים של זרע זרע, טוקסיקולוגיה של רבייה ושימור חומר גנטי מזכרים לא בוגרים במגוון מינים תורמים, החל מעכברים ועד גברים.