בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג תכשיר מטהר מאוד של תאי דנדריטיים מריאת עכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף רקמת הריאה ללא קשרי הלימפה המנקזים. לאחר מכן, מתקבל תמיסת תאים בודדים (single cell suspension) באמצעות עיכול בקולגנאז.

השלב הבא הוא העשרה של תאים חיוביים ל-CD 11 C באמצעות מערכת בידוד תאים מגנטית. כעת, תת-אוכלוסייה של תאי דנדריטים קונבנציונליים מבודלת באמצעות מיון תאים בציטומטריה של זרימה. לבסוף, ניתן לנתח תאי דנדריטים קונבנציונליים שבודדו מרקמת ריאה של עכבר באמצעות ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה של אור.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון מהי המעורבות של תת-אוכלוסיית תאי דנדריטיים קונבנציונליים בחסינות מולדת ובמחלות זיהומיות בדרכי הנשימה? את הפרוצדורה ידגימו איסא לנסלין, עמית מחקר מהמעבדה שלי, ואני. לאחר הדמיות העכבר, התחילו בחיתוך ולאחר מכן במשיכה עדינה של העור החיצוני של הפריטוניאום כדי לחשוף את חלל בית החזה.

המשיכו בפתיחת הסרעפת על ידי חיתוך כלוב הצלעות כדי לחשוף הן את הלב והן את הריאות. ברגע שהלב והריאה חשופים, ניתן להתחיל בהליך הפרפוזיה. מלאו מזרק של חמישה מיליליטר ב-E-D-T-A-H-B-S-S וחברו מחט במידה 25 למזרק.

לאחר מכן, הכניסו את המחט לתוך החדר הימני כדי למנוע דליפה במהלך ההזרקה. השתמשו בפינצטה כדי לקבע את רקמת השריר הלבבי מסביב למחט. לאחר מכן, הזיקו בעדינות את התמיסה תוך שמירה על לחץ קבוע.

פרפוזיה מדויקת תביא לנפיחות של הריאה ולשינוי צבע לוורוד או לבן. כדי למנוע זיהום פוטנציאלי, יש להסיר ולהשליך את קשרי הלימפה המנקזים. לאחר מכן, אספו את רקמת הריאה והעבירו את האיבר שהוצא לצלוחית פטרי על קרח. מלאו צינור gentle max C ב-5 mL של תמיסת עיכול קולגנאז לריאה, ולאחר מכן קצצו את הריאה לחתיכות קטנות.

בעזרת להב תער, העבירו את הרקמה אל תוך המבחנה תוך שימוש בפירוק מקסימלי עדין. כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים, בחרו בתוכנית M lung zero one. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות, תוך ניעור המבחנה בכל חמש דקות כדי להשעות מחדש את פרגמנטים של הרקמה F, והמשיכו בתוכנית M lung zero two.

כעת העבירו את הדגימה לפרועת קונית של 15 מיליליטר וסבבו את התאים בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-335 $\times$g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העלייה והוסיפו לשקיעה שני מיליליטרים של בופר ליזיס CK למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להמיס את תאי הדם האדומים שנותרו. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 13 מיליליטרים של PBS קר המועשר ב-0.5%BSA.

לאחר השלכת הנוזל העליון, השביה שוב את המשקע בחמישה מיליליטר של PBS קר בתוספת BSA, ולאחר מכן העבר את תמיסת התאים דרך רשת ניילון של 100 מיקרומטר. לבסוף, קבע את מספר התאים הכולל באמצעות שיטת הדחת trypan blue. במקום להשתמש ב-gentle max dissociation, מלא מבחנה קונית של 15 מיליליטר בחמישה מיליליטר של תמיסת collagenase לכל ריאה.

הוסיפו את רקמת הריאה הקצוצה למבחנה, והדגירו את רקמת הריאה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C. בצעו ערבוב ב-Vortex לתאים בכל 15 דקות כדי לסובב מחדש את חלקי הרקמה. לאחר מכן, פרקו את הרקמה העיכולית על ידי העברת הדגימה שש עד שמונה פעמים דרך מזרק של 3 mL המחובר למחט במידה 20 gauge.

יש להימנע מיצירת בועות במהלך התהליך. ראשית, שטפו את סספנסיית התאים הבודדים למשך 10 דקות ב-200 ×g בטמפרטורה של 4°C והסִירו את העליליות. לאחר מכן, השעיקו שוב את התאים ב-400 µL של בופר הפרדה.

חסמו את קישור הנוגדנים הבל-ספציפי המתווך על ידי FC בתאים הכוללים השמינית באמצעות 0.5 µg של נוגדן anti CD 1632, והדגירו את ששת התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר שטיפת התאים ב-10 mL של חוצץ הפרדה קר, השעיקו שוב את התאים ב-400 µL של חוצץ הפרדה. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של CD 11 C micro beads לתאים הכוללים השמינית, ערבבו היטב והדגירו את תמיסת התאים והחרוזים למשך 15 דקות במקרר.

לאחר הסרת החרו지를 שלא נקשרו באמצעות 10 milliliters של תמיסת הפרדה קרה, השליכו את הנוזל העליון והשביו שוב את משקע התאים ב-one milliliter של תמיסת הפרדה קרה. לבסוף, העמיסו את הדגימות למפריד AutoMax pro והפעילו את תוכנית P-O-S-S-E-L-D, כדי לאסוף את פראקציית התאים המבטאים CD 11 C.

דגרו את תרחיף התאים המועשר ב-CD 11 C positive יחד עם נוגדנים anti CD 11 C PEI seven ונוגדנים המכוונים נגד מולקולות MHC Class Two הנמצאות על תאים אלו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר שטיפת התאים ב-PBS פלוס BSA קר, השעיקו מחדש את התאים ב-0.5 milliliters של PBS פלוס BSA, והעבירו אותם דרך מסנן רשת ניילון של 40 micrometer. לבסוף, העבירו את תאי ה-CD 11 C positive המנוקים למבחנת fax לצורך כימות מאוחר יותר במבחנות ריקות נפרדות.

הוסיפו 100 µL של PBS פלוס BSA למבחנות איסוף של 5 mL כדי למנוע נזק לתאים המופרדים, ומיינו את תרחיף התאים המסונן באמצעות FACS; שמרו את התאים שנאספו בטמפרטורה קרה לאורך כל תהליך מיון התאים. בתרשימי צפיפות אלו, נמצא מספר תאים דנדריטיים קונבנציונליים ברחה הגבוה פי שלושה לפחות מהמספר שנמצא בריאה. יתרה מכך, תאים חיוביים ל-CD11c בריאה כוללים אוכלוסיית תאים שאינם תאים דנדריטיים קונבנציונליים, כפי שניתן לראות מקבוצת האירועים בעלת ביטוי נמוך של MHC Class II מחוץ לשער התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים.

בצד שמאל של האיור כפי שמוצג בתרשים צפיפות זה, הפרדה מגנטית של תאי ריאה כוללים עבור CD 11 C מעלה את מספר התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים מכ-1.5% מכלל התאים לכ-16.5%. עם זאת, מקרופאגים CD 11 C positive MHC Class two low עדיין מהווים למעלה מ-70% מאוכלוסיית התאים הכוללת, ובכך מזיהמים באופן משמעותי את טוהר תת-אוכלוסיית התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים של הריאה המועשרים בשלב זה של תהליך הבידוד. מיון באמצעות fax, לעומת זאת, משפר את טוהר התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים למעלה מ-96%, כפי שניתן לראות במיקרופוטוגרפיה הימנית העליונה. התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים מסוג CD 11 C high MHC Class two high הם תאים עגולים הנושאים דנדריטים טיפוסיים, בעוד שהתאים מסוג CD 11 C high MHC class two low הנראים במיקרופוטוגרפיה הימנית התחתונה מראים בליטות תאיות המאפיינות יותר מורפולוגיה של מקרופאגים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לטפל ברקמת הריאה ובהכנת התאים הבודדים בטמפרטורות המצוינות. דבר זה קריטי לשמירה על חיוניות התאים ועל תנובה קונבנציונלית של תאים דנדריטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן בידוד תתי-אוכלוסיות של תאים דנדריטיים מריאת עכבר.

בידוד תתי-אוכלוסיות של תאי דנדריטיים ריאתיים מהווה כלי יעיל מאוד להשגת תובנות לגבי תפקודי תאים אלו בתגובה לפתוגנים בדרכי הנשימה ולגורמים סביבתיים העשויים לעורר את התגובה החיסונית של המארח בריאה.