Name: בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאים דנדריטיים קונבנציונליים מריאות עכבר באמצעות עיכול קולגנזה, הפרדה מגנטית ומיון ציטומטרי זרימה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח תפקודי של תאים אלו במערכת החיסון של דרכי הנשימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למרילין דיטריך במתקן cytometry זרימה LSU Core עזרתה עם מיון התא ופיטר Mottram עזרתו עם microphotographs. עבודה זו מומנה על ידי דיילת מכון המחקר הרפואי, את LSU-תחרותי תוכנית פרס המחקר, ו-NIH / NIAID מענקים P20 RR020159 ו R03AI081171.

1. ריאות זלוף ההשעיה תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של תערובת ההרדמה קטאמין / xylazine (ב mg / עכבר 1.8 קטמין, xylazine 0.19) ו exsanguination דרך וריד הירך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את חלל בית החזה על ידי חיתוך משיכתו בעדינות בחזרה את העור החיצוני של הצפק. המשך כדי לפתוח את הסרעפת על ידי חיתוך החזה כדי לחשוף גם את הלב והריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse בעדינות את הריאות באמצעות מזרק 5 מ&quot;ל מלאים EDTA-HBSS (1mm EDTA סידן / מגנזיום ללא HBSS). חבר מחט 25 G ו להכניס מחט לתוך החדר הימני. כדי למנוע דליפה במהלך ההזרקה, לאבטח את הרקמה myocardiac סביב המחט באמצעות מלקחיים. בעדינות להזריק פתרון תוך שמירה על לחץ קבוע. זלוף מדויק תגרום לאינפלציה ריאה ושינוי צבע ורוד / לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ניקוז בלוטות הלימפה כדי לבטל כל אפשרות של זיהום מן הרקמה הזאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגבותרקמת הריאה, להעביר בצלחת פטרי על קרח, לקצוץ אותו לחתיכות קטנות בעזרת סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמה מעוגנת לתוך צינור gentleMACS C המכיל 5 מ&quot;ל / ריאות של פתרון העיכול collagenase (collagenase סוג 1A 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בתוספת סוג IV שור הלבלב DNase 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב HBSS המכיל 5% FBS, 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש dissociator gentleMACS לקבל השעיה תא בודד. בחר תוכנית: m_lung_01. דגירה מדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. Shake צינור כל 5 דקות כדי resuspend שברי הרקמה. המשך m_lung_02 התוכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מדגם צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. לאחר שלב זה, לשמור את כל ריאגנטים centrifugations ב 4 ° C כדי למנוע ירידה כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו lyse הנותרים כדוריות דם אדומות על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של חיץ lysing ACK דקה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 13 תאיםמ&quot;ל של BSA PBS/0.5% צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, תאים הכולל resuspend ב 5 מ&quot;ל של BSA PBS/0.5% קר לעבור יסודית רשת ניילון 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את מספר הסלולרי סך באמצעות trypan צבע כחול הדרה. </li></ol> 2. בידוד מגנטי והעשרה CD11c + תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא בודד במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 400 μl של חיץ ההפרדה (PBS, BSA 0.5%, ו - 2 mM EDTA) לכל 10 8 תאים בסך הכל. בלוק Fc בתיווך נוגדנים נוקבים מחייב באמצעות anti-CD16/CD32 נוגדן (0.5μg / 10 6 תאים) במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 10 מ&quot;ל של חיץ ההפרדה צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C. Resuspend תאים μl 400 של חיץ ההפרדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של microbeads CD11c לכל 10 8 </sup&gt; תאים בסך הכל. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר (2-8 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 10 מ&quot;ל של חיץ ההפרדה צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 200 x גרם ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 3 מ&quot;ל של חיץ ההפרדה קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו הפרדה מגנטי באמצעות מפריד Pro autoMACS TM ידי בחירת posseld התוכנית. אסוף את חלק חיובי (0.5 מ&quot;ל). </li></ol> 3. הדנדריטים בתא בידוד קונבנציונלי (CDC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מועשר CD11c ההשעיה התא חיובי עם אנטי CD11c PE-Cy7 ו anti-IA/IE (MHC-II), FITC נוגדנים במשך 30 דקות 4 ° C. ריכוז מיטבי של נוגדנים הוא 0.5 מיקרוגרם / 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם BSA PBS/0.5% צנטריפוגות קרים במשך 10 דקות ב 335 x גרם ב 4 ° C. תאים Resuspend ב 0.5 מ&quot;ל של BSA PBS/0.5% ולהעביר אותם דרך רשת ניילון 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשךלמיין את התאים באמצעות סדרן תא FACS Aria במצב טוהר. הוסף 100 μl של BSA PBS/0.5% ל צינורות לאיסוף כדי למנוע נזק של תאים מטוהרים. שמור את התאים בטמפרטורה בקירור לאורך כל תהליך מיון התא. </li></ol> 4. פרוטוקול חלופי לקבלת ההשעיה תא בודד והעשרה CD11c + תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת החלפת dissociator gentleMACS, רקמת הריאה מעוגנת משלב 1.5 ניתן להעביר צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ל של תמיסת collagenase לכל ריאה דגירה במשך שעה 1 ב 37 ° C. וורטקס תאים כל 15 דקות כדי resuspend שברי הרקמה. לשבש את הרקמה על ידי העברת מדגם 6-8 פעמים פנימה והחוצה דרך מזרק 3 מ&quot;ל קשור מחט G 20. הימנע עושה בועות בתהליך, אחרת הכדאיות התא יהיה בסכנה. לאחר ההשעיה תא בודד מתקבל, המשך לשלב 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת החלפת TM AutoMACSPro separaטור, בידוד מגנטי להעשרת התאים CD11c, יכולה גם להתבצע על ידי העברת מתלה התא באופן ידני באמצעות שתי עמודות MACS. בחירת העמודות המתאימות ישתנה בהתאם לגודל המדגם. </li></ol> 5. נציג תוצאות: ריאות CDC מזוהים CD11c היי / MHC-II האוכלוסייה היי התא. כפי שמוצג באיור. 1, ה-CDC מהווים אחוז קטן יותר של 1.4% לעומת כ ברקמות אחרות כגון הטחול (4.8%). עם זאת, בניגוד טחול, ריאות תאים CD11c חיובית לבטא כמויות שונות של MHC-II, כולל האוכלוסייה תא שונה מזו של ה-CDC. לאחר הכנה מתא בודד, התשואה של התא לתאי ריאה הכולל היה כ 3.0-3.8 x 10 7 תאים / ריאות עם הכדאיות של 60-70% ממנה קצת מעל 1% מיוצג משנה CDC. אחוז זה עלה לאחר בידוד המגנטי CD11c שבו הריאות CDC הכולל היה מוגדל כ 10 times (&gt; 16%) מן הכנה המקורי (איור 2A). עם זאת, תאים CD11c לבטא כמויות נמוכות של MHC-II (CD11c היי / MHC-II והנה, מקרופאגים) ייצג האוכלוסייה גבוה תא מזהם (&gt; 70%) אשר היה מעורב עם תת הריאה ה-CDC. כפי שמוצג באיור. 2B, תאים אלה בוטלו לאחר שלב המיון, כאשר תא טוהר CDC הגיע&gt; 96%. התשואה הרגילים של ה-CDC לאחר ההליך כולו היה 5 x 10 4 תאים / ריאות. Microphotographs להראות מאפיינים מורפולוגיים של ה-CDC כמו תאים מעוגלים עם דנדריטים טיפוסי (הפאנל העליון). מצד שני, המיוצג על CD11c היי / MHC-II lo תת שונים מורפולוגית שמראה בליטות הסלולר האופייניים של מקרופאגים (MΦ, הפאנל התחתון) 12. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> 1. איור דיפרנציאלי DC תדירות הריאות והטחול העכבר. ריאותרקמת טחול nd מ C57BL / 6 עכברים נאספו שטופלו collagenase. בעקבות עיכול collagenase, התאים היו מוכתמות אנטי עכבר CD11c-PE-Cy7 ואנטי עכבר IA / IE-FITC. תזרים נציג מגרשים cytometry להראות אחוזי ה-CDC (CD11c היי / MHC-II היי) בתוך הריאות והטחול. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> באיור 2. בידוד של ה-CDC מן הריאות העכבר. ריאה עכבר תא בודד ההשעיה סומן עם אנטי CD11c microbeads ויעברו מפריד תא אוטומטי.) נציג העלילה מראה את האחוזים של ה-CDC (CD11c היי / MHC-II היי) ו המקרופאגים (MΦ, CD11c היי / MHC-II LO) אוכלוסיות לאחר העשרה CD11c. מכתים נוסף של השבר בעקבות מועשר באמצעות אנטי עכבר CD11c-PE-Cy7 ואנטי עכבר IA / IE-FITC. תאים חיובית כפולה מוינו ונותחו על ידי cytometry הזרימה. אלמורפולוגיה לזהות שלהם, התאים היו cytospun ומוכתמת עם צביעה שונה רייט Giemsa. B) מגרשים נציג להראות אחוזי ה-CDC MΦ לאחר מיון התא. Microphotographs להראות תמונה מייצגת של הריאה-CDC MΦ ריאות. בר סולם = 20 מיקרומטר.

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
<li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בידוד ריאתי עכבר DC היא טכניקה חשובה לחקר מגוון רחב של גירויים בדרכי הנשימה. תהליך קבלת תאים אלה כולל שלבים קריטיים למנוע אובדן של תאים, כמו גם כדאיות התא וטוהר. המרוססת הריאה לפני איסוף יעזור לחסל את כל התאים הפריפריה כמו גם לצמצם את זיהום אריתרוציטים. השימוש ניתוק אוטומטי ניתן advanteogus כאשר מספר גדול של הריאות מטופלים, אחרת אתה יכול לבחור עבור פרוטוקול חלופי, תוך התחשבות כי הפיזור של הרקמה לאחר עיכול collagenase צריך להיעשות בעדינות כאשר נעשה באופן ידני. תקופת הדגירה של רקמת ...

<table width="200" border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Lysing ACK חיץ </td><td> Invitrogen </td><td> D6-0005DG </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD11c (HL3) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5580979 </td><td> PE-Cy7 מצומדות </td></tr><tr><td> אנטי עכבר IA / IE (269) </td><td> BD-Pharmingen </td><td> 553623 </td><td> מצומדות FITC </td></tr><tr><td> Collangenase סוג 1A </td><td> סיגמא </td><td> 9891-500mg </td><td></td></tr><tr><td> תא strainers </td><td> BD פלקון </td><td> 352340, 352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> D5025-150KU </td><td></td></tr><tr><td> האנק של פתרון מאוזן מלח </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes פתרון חיץ </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי 60 מ&quot;מ </td><td> BD פלקון </td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C צינורות </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> Dissociator MACS עדין </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS-Pro ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS Aria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

תאים דנדריטים ריאות (DC) לשחק תפקיד מהותי חישה הפולש 1,2 פתוגנים כמו גם בשליטה על התגובות tolerogenic 3 בדרכי הנשימה. לפחות שלושה תת העיקרי של התאים הדנדריטים ריאות תוארו בעכברים: DC קונבנציונלי (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 ו IFN-בהפקת הרוצח DC (IKDC) 6,7. משנה ה-CDC היא משנה DC הבולטים הריאה 8. סמן משותף ידוע לזהות תת DC היא CD11c, סוג אני הטרנסממברני integrin (β2) אשר באה לידי ביטוי גם על מונוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים חלק מתאי B 9. ברקמות מסוימות, באמצעות CD11c כסמן העכבר לזהות DC תקף, כמו הטחול, שם רוב התאים + CD11c לייצג את קבוצת המשנה CDC המבטא רמות גבוהות של הגדולים מורכבים histocompatibility מחלקה II (MHC-II). עם זאת, הריאה היא רקמה הטרוגנית יותר להיות שםצד תת DC, יש אחוז גבוה של האוכלוסייה תא ברורים המבטא רמות גבוהות של CD11c התקף רמות נמוכות של MHC-II. בהתבסס על האפיון שלה בעיקר על ביטויו של F4/80, סמן macrophage הטחול, היי CD11c MHC-II תא lo האוכלוסייה ריאות זוהה מקרופאגים ריאתי 10 ולאחרונה, כמבשר פוטנציאל DC 11. בניגוד עכבר PDC, ללמוד את התפקיד הספציפי של ה-CDC בתגובה החיסונית ריאתי הוגבל בשל היעדר של סמן מסוים שיכול לעזור בבידוד של תאים אלה. לכן, בעבודה זו אנו מתארים הליך לבודד מטוהרים עכבר ריאות CDC. הבידוד של ריאתי תת DC מייצג כלי מאוד שימושי כדי לקבל תובנות לתוך הפונקציה של תאים אלה בתגובה פתוגנים בדרכי הנשימה, כמו גם גורמים סביבתיים שיכולים לעורר את התגובה החיסונית לארח בריאה.

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

תאי דנדריטיים (DC) בריאות ממלאים תפקיד בסיסי בזיהוי פתוגנים פולשים 1,2 וכן בבקרה של תגובות טולרוגניות 3 ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג תכשיר מטהר מאוד של תאי דנדריטיים מריאת עכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף רקמת הריאה ללא קשרי הלימפה המנקזים. לאחר מכן, מתקבל תמיסת תאים בודדים (single cell suspension) באמצעות עיכול בקולגנאז.השלב הבא הוא העשרה של תאים חיוביים ל-CD 11 C באמצעות מערכת בידוד תאים מגנטית. כעת, תת-אוכלוסייה של תאי דנדריטים קונבנציונליים מבודלת באמצעות מיון תאים בציטומטריה של זרימה. לבסוף, ניתן לנתח תאי דנדריטים קונבנציונליים שבודדו מרקמת ריאה של עכבר באמצעות ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה של אור.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון מהי המעורבות של תת-אוכלוסיית תאי דנדריטיים קונבנציונליים בחסינות מולדת ובמחלות זיהומיות בדרכי הנשימה? את הפרוצדורה ידגימו איסא לנסלין, עמית מחקר מהמעבדה שלי, ואני. לאחר הדמיות העכבר, התחילו בחיתוך ולאחר מכן במשיכה עדינה של העור החיצוני של הפריטוניאום כדי לחשוף את חלל בית החזה.המשיכו בפתיחת הסרעפת על ידי חיתוך כלוב הצלעות כדי לחשוף הן את הלב והן את הריאות. ברגע שהלב והריאה חשופים, ניתן להתחיל בהליך הפרפוזיה. מלאו מזרק של חמישה מיליליטר ב-E-D-T-A-H-B-S-S וחברו מחט במידה 25 למזרק.לאחר מכן, הכניסו את המחט לתוך החדר הימני כדי למנוע דליפה במהלך ההזרקה. השתמשו בפינצטה כדי לקבע את רקמת השריר הלבבי מסביב למחט. לאחר מכן, הזיקו בעדינות את התמיסה תוך שמירה על לחץ קבוע.פרפוזיה מדויקת תביא לנפיחות של הריאה ולשינוי צבע לוורוד או לבן. כדי למנוע זיהום פוטנציאלי, יש להסיר ולהשליך את קשרי הלימפה המנקזים. לאחר מכן, אספו את רקמת הריאה והעבירו את האיבר שהוצא לצלוחית פטרי על קרח. מלאו צינור gentle max C ב-5 mL של תמיסת עיכול קולגנאז לריאה, ולאחר מכן קצצו את הריאה לחתיכות קטנות.בעזרת להב תער, העבירו את הרקמה אל תוך המבחנה תוך שימוש בפירוק מקסימלי עדין. כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים, בחרו בתוכנית M lung zero one. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות, תוך ניעור המבחנה בכל חמש דקות כדי להשעות מחדש את פרגמנטים של הרקמה F, והמשיכו בתוכנית M lung zero two.כעת העבירו את הדגימה לפרועת קונית של 15 מיליליטר וסבבו את התאים בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-335 $\times$g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העלייה והוסיפו לשקיעה שני מיליליטרים של בופר ליזיס CK למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להמיס את תאי הדם האדומים שנותרו. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 13 מיליליטרים של PBS קר המועשר ב-0.5%BSA.לאחר השלכת הנוזל העליון, השביה שוב את המשקע בחמישה מיליליטר של PBS קר בתוספת BSA, ולאחר מכן העבר את תמיסת התאים דרך רשת ניילון של 100 מיקרומטר. לבסוף, קבע את מספר התאים הכולל באמצעות שיטת הדחת trypan blue. במקום להשתמש ב-gentle max dissociation, מלא מבחנה קונית של 15 מיליליטר בחמישה מיליליטר של תמיסת collagenase לכל ריאה.הוסיפו את רקמת הריאה הקצוצה למבחנה, והדגירו את רקמת הריאה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C. בצעו ערבוב ב-Vortex לתאים בכל 15 דקות כדי לסובב מחדש את חלקי הרקמה. לאחר מכן, פרקו את הרקמה העיכולית על ידי העברת הדגימה שש עד שמונה פעמים דרך מזרק של 3 mL המחובר למחט במידה 20 gauge.יש להימנע מיצירת בועות במהלך התהליך. ראשית, שטפו את סספנסיית התאים הבודדים למשך 10 דקות ב-200 ×g בטמפרטורה של 4°C והסִירו את העליליות. לאחר מכן, השעיקו שוב את התאים ב-400 µL של בופר הפרדה.חסמו את קישור הנוגדנים הבל-ספציפי המתווך על ידי FC בתאים הכוללים השמינית באמצעות 0.5 µg של נוגדן anti CD 1632, והדגירו את ששת התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר שטיפת התאים ב-10 mL של חוצץ הפרדה קר, השעיקו שוב את התאים ב-400 µL של חוצץ הפרדה. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של CD 11 C micro beads לתאים הכוללים השמינית, ערבבו היטב והדגירו את תמיסת התאים והחרוזים למשך 15 דקות במקרר.לאחר הסרת החרו지를 שלא נקשרו באמצעות 10 milliliters של תמיסת הפרדה קרה, השליכו את הנוזל העליון והשביו שוב את משקע התאים ב-one milliliter של תמיסת הפרדה קרה. לבסוף, העמיסו את הדגימות למפריד AutoMax pro והפעילו את תוכנית P-O-S-S-E-L-D, כדי לאסוף את פראקציית התאים המבטאים CD 11 C.דגרו את תרחיף התאים המועשר ב-CD 11 C positive יחד עם נוגדנים anti CD 11 C PEI seven ונוגדנים המכוונים נגד מולקולות MHC Class Two הנמצאות על תאים אלו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר שטיפת התאים ב-PBS פלוס BSA קר, השעיקו מחדש את התאים ב-0.5 milliliters של PBS פלוס BSA, והעבירו אותם דרך מסנן רשת ניילון של 40 micrometer. לבסוף, העבירו את תאי ה-CD 11 C positive המנוקים למבחנת fax לצורך כימות מאוחר יותר במבחנות ריקות נפרדות.הוסיפו 100 µL של PBS פלוס BSA למבחנות איסוף של 5 mL כדי למנוע נזק לתאים המופרדים, ומיינו את תרחיף התאים המסונן באמצעות FACS; שמרו את התאים שנאספו בטמפרטורה קרה לאורך כל תהליך מיון התאים. בתרשימי צפיפות אלו, נמצא מספר תאים דנדריטיים קונבנציונליים ברחה הגבוה פי שלושה לפחות מהמספר שנמצא בריאה. יתרה מכך, תאים חיוביים ל-CD11c בריאה כוללים אוכלוסיית תאים שאינם תאים דנדריטיים קונבנציונליים, כפי שניתן לראות מקבוצת האירועים בעלת ביטוי נמוך של MHC Class II מחוץ לשער התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים.בצד שמאל של האיור כפי שמוצג בתרשים צפיפות זה, הפרדה מגנטית של תאי ריאה כוללים עבור CD 11 C מעלה את מספר התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים מכ-1.5% מכלל התאים לכ-16.5%. עם זאת, מקרופאגים CD 11 C positive MHC Class two low עדיין מהווים למעלה מ-70% מאוכלוסיית התאים הכוללת, ובכך מזיהמים באופן משמעותי את טוהר תת-אוכלוסיית התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים של הריאה המועשרים בשלב זה של תהליך הבידוד. מיון באמצעות fax, לעומת זאת, משפר את טוהר התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים למעלה מ-96%, כפי שניתן לראות במיקרופוטוגרפיה הימנית העליונה. התאים הדנדריטיים הקונבנציונליים מסוג CD 11 C high MHC Class two high הם תאים עגולים הנושאים דנדריטים טיפוסיים, בעוד שהתאים מסוג CD 11 C high MHC class two low הנראים במיקרופוטוגרפיה הימנית התחתונה מראים בליטות תאיות המאפיינות יותר מורפולוגיה של מקרופאגים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לטפל ברקמת הריאה ובהכנת התאים הבודדים בטמפרטורות המצוינות. דבר זה קריטי לשמירה על חיוניות התאים ועל תנובה קונבנציונלית של תאים דנדריטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן בידוד תתי-אוכלוסיות של תאים דנדריטיים מריאת עכבר.בידוד תתי-אוכלוסיות של תאי דנדריטיים ריאתיים מהווה כלי יעיל מאוד להשגת תובנות לגבי תפקודי תאים אלו בתגובה לפתוגנים בדרכי הנשימה ולגורמים סביבתיים העשויים לעורר את התגובה החיסונית של המארח בריאה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים תסיסה רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת הריאות הוא הסביר.

הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS

במאמר זה אנו מדגימים את הבידוד של Murine ריאות תושב בתאי גזע mesenchymal (ריאות MSC), הרחבה שלהם, אפיון וניתוח של מאפייני המערכת החיסונית.

בידוד &amp; אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד תאי המציגים אנטיגנים מבלוטת התימוס אנושית דרך שלבים שונים של עיכול אנזימטי של הרקמה ואחריו צנטריפוגה צפיפות של ההשעיה התא בודדת ומיון לבסוף מגנטי ו / או FACS של אוכלוסיות התאים של עניין.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

אנו מתארים שיטה לייצור פרוסות ריאה-לחתוך Precision (PCLS) ו immunostaining להם לדמיין את הלוקליזציה של סוגי תאים שונים חיסוניים הבריא. פרוטוקול שלנו ניתן להאריך לדמיין את המיקום והתפקוד של סוגי תאים שונים תחת מגוון של תנאים.

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

נגזר מונוציט DC (MoDC) יכול לחוש כמויות זעירות של מולקולות הקשורות סכנה, ולכן טענתי בקלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של MoDC של דם וגידולים שלהם הפעלה עם מכלולים חיסוניים תוך הדגשת מפתח הזהירות הנחשבות על-מנת למנוע הפעלה מוקדמת שלהם.

בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

למדו שיטה לבידוד תאים דנדריטיים קונבנציונליים מריאות עכבר באמצעות עיכול קולגנזה, הפרדה מגנטית ומיון ציטומטרי זרימה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח תפקודי של תאים אלו במערכת החיסון של דרכי הנשימה.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

גלה סרטונים נוספים