Name: הערכת Hypermutation תאים סומטיים ב ראמוס B לאחר Overexpression או מציאה של גנים ספציפיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: חקור השפעת שינויי ביטוי גנים על hypermutation סומטי בתאי Ramos B באמצעות זיהומים רטרו-ויראליים או לנטי-ויראליים. שיטה זו מאפשרת זיהוי גורמים חדשים המעורבים בגיוון נוגדנים ומסייעת להבנת מנגנוני מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PMSCV-AID-I-Thy1.1 ו pKat2 וקטורים היו מתנה סוג של DG שץ לבין pVSV-G, pRSV-Rev ו pMDLg / pRRE וקטורים היו מתנה סוג של BR קאלן.

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
<li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li>
<li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li>
<li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li>
<li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li>
<li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li>
<li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li>
<li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li>
<li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A%2FT+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li>
<li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A%3AT+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li>
<li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li>
<li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li>
<li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li>
<li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality%2C+abnormal+embryonic+development%2C+and+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li>
<li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li>
<li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כפי שנאמר קודם לכן, שורת תאים מודלים גיוון נוגדן הפכו נקודת המוצא הפופולרית לזהות חלבונים חדשים המשפיעים על שלבים שונים במהלך פיזור נוגדנים. אנו מציגים כאן שיטה באמצעות זיהום ויראלי חלבונים או לדפוק למטה או overexpress בקו ראמוס B-cell ולאחר מכן לבחון את ההשפעה על SHM. עבור מחקרים אלה, אנו מנצלים גם ראמוס WT ו AID היי תאים ראמוס. תאים WT יכול לשמש כדי לחקור גורמים המעורבים מיקוד או ביטוי של תרומת זרע, ...

ריאגנטים מוצע - רוב אלה עשוי להיות מוחלף עם מוצרים דומים מיצרנים אחרים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th > חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td > 6-TC גם ברור שטופלו צלחות </td><td > קורנינג </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 מ&quot;ל BD-Luer Loksyringes </td><td > BD רפואי </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-TC גם ברור שטופלו צלחות </td><td > קורנינג </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96-היטב לתחתית ברור קלקר שטוחה TC שטופלו microplates </td><td > קורנינג </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 מ&quot;מ TC שטופלו תרבות מנות </td><td > קורנינג </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Acrodisc מסננים מזרק, 0.45 מיקרומטר </td><td > מל מדעי החיים </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > אגר </td><td > Teknova </td><td > A7777 </tד&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarose </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > אמפיצילין </td><td> סיגמא </td><td > A0166 </td><td> 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מים </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II cytometer זרימה </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > או דומה </td></tr><tr><td> BD פלקון קלקר עגול התחתונה צינורות </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > עבור FACS </td></tr><tr><td > בוסק 23 תאים </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2 באינקובטור מסוגל 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (מדיום שונה Dulbecco של הנשרים) </td><td > סיגמא </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (בסרום שור העובר) </td><td > ג&#39;מיני Bio-מוצרים </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-עכברוש CD90/mouse CD90.1 נוגדן </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 transfection מגיב </td><td > רוש </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES פתרון חיץ </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi DNA פולימראז </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB מרק (מרק lysogeny - לוריא) אבקת </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > המשימה TRC shRNA מניות גליצרול חיידקי </td><td > סיגמא </td><td ></td><td> shRNA וקטורים </td></tr><tr><td > NCS (נסיוב עגל בן יומו) </td><td > ג&#39;מיני Bio-מוצרים </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (פוספט פתרון שנאגרו) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > מדולל במים עד 1x </td></tr><tr><td > Α PE-IgM נוגדנים אנושיים </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (פניצילין, סטרפטומיצין, גלוטמין פתרון) </td><td > ג&#39;מיני Bio-Products </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine ברומיד) </td><td > סיגמא </td><td > 107689 </td><td > 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מים </td></tr><tr><td > PureYield מערכת פלסמיד Midiprep </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> סיגמא </td><td > P8833 </td><td > 250 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מים </td></tr><tr><td > QIAquick ג&#39;ל ערכת חילוץ </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> ראמוס (ע&quot;ר 1) תאים </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 בינוני </td><td > סיגמא </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > עילי II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST qPCR ערכת </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > תקי פולימראז ה-DNA </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > Topo ת&quot;א ערכה שיבוט </td><td > מבחנהgen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > אשף ה-DNA SV הגנום טיהור מערכת </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-גל [5-bromo-4-כלורו-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב DMSO </td></tr></tbody></table>

הערכת hypermutation תאים סומטיים ב ראמוס b לאחר overexpression או מציאה של גנים ספציפיים

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

בתאי B להתחיל את החיים שלהם עם נוגדנים זיקה נמוך שנוצר על ידי רקומבינציה V J (ד &#39;). עם זאת, על גילוי פתוגן, (V) את המשתנה באזור של גן אימונוגלובולינים (איג) עובר מוטציה כ -100,000 פי יותר משאר הגנום באמצעות hypermutation סומטי (SHM), וכתוצאה מכך 1,2 זיקה נוגדנים גבוהה. בנוסף, מתג בכיתה רקומבינציה (CSR) מייצר נוגדנים עם מפעיל פונקציות שונות בהתאם לסוג התגובה החיסונית הדרוש פתוגן מסוים. שני CSR ו SHM הם שיזמו דאמינז ההפעלה הנגרמת cytidine (AID), אשר deaminates שאריות ציטוסין ב-DNA כדי לייצר uracils. Uracils אלה מטופלות על ידי צורות מועדת לטעויות של מסלולי תיקון, המוביל בסופו של דבר מוטציות רקומבינציה 1-3. ההבנה הנוכחית שלנו את הפרטים המולקולריים של SHM ו CSR לבוא משילוב של מחקרים בעכברים, תאים ראשוניים, שורות תאים, ותא-fרי ניסויים. מודלים עכבר להישאר תקן הזהב עם knockouts הגנטי מראה תפקידים קריטיים עבור גורמים רבים לתקן (למשל אונג, Msh2, MSH6, Exo1 ו פולימראז η) 40-10. עם זאת, לא כל הגנים הנוחות ללימודי בנוקאאוט. לדוגמה, knockouts של כמה גדיל פעמיים חלבונים לתקן לשבור הם קטלניים embryonically או לפגום B-cell פיתוח 11-14. יתר על כן, לפעמים הפונקציה ספציפי של חלבון ב SHM או אחריות חברתית עשויה להיות רעולי פנים על ידי פגמים הגלובלי הנגרם על ידי יותר בנוקאאוט. בנוסף, מאז ניסויים בעכברים יכול להיות ארוך, לשנות את הביטוי של גנים בודדים שורות תאים הפך יותר ויותר פופולרי הצעד הראשון לזיהוי ואפיון גנים מועמדים 15-18. ראמוס - תא לימפומה Burkitt קו constitutively עובר SHM - כבר מודל פופולרי תא שורת ללמוד SHM 18-24. אחד היתרונות של תאים ראמוס הוא שיש להם מובנית למחצה נוחמדד כמותי-SHM. תאים מסוג Wild להביע IgM, וכפי שהם להרים מוטציות, כמה מוטציות לדפוק את הביטוי IgM. לכן, assaying הפסד IgM ידי סריקת הקרינה המופעל תאים (FACS) מספק מהיר לקריאה החוצה ברמה של SHM. מדידה כמותית של SHM יותר ניתן להשיג על ידי ישירות רצף הגנים נוגדנים. מכיוון שתאי ראמוס קשה transfect, אנחנו מייצרים נגזרים יציב הגדילו או הוריד הביטוי של גן יחיד על ידי הדבקה של תאים עם בונה retroviral או lentiviral המכילות קלטת overexpression או סיכת ראש רנ&quot;א קצרות (shRNA), בהתאמה. כאן, אנו מתארים כיצד אנו להדביק תאים ראמוס ולאחר מכן להשתמש בתאים אלה כדי לחקור את תפקידה של גנים ספציפיים על SHM (איור 1).

אנו מתארים כיצד לבצע זיהומים retroviral או lentiviral של overexpression או shRNA המכילים בונה את קו האדם ראמוס תא B וכיצד למדוד hypermutation סומטיים בתאים אלה.

הערכת Hypermutation תאים סומטיים ב ראמוס B לאחר Overexpression או מציאה של גנים ספציפיים

תאי B מתחילים את חייהם עם נוגדנים בעלי זיקה נמוכה הנוצרים על ידי רקומבינציית V(D)J. עם זאת, עם זיהוי פתוגן, האזור המשתנה (V) של...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לשנות את הביטוי של גן ולאחר מכן למדוד את השפעתו על היפרמוטציה סומטית. דבר זה מושג על ידי טרנספקציה של תאי Bosque 23 כדי לייצר חלקיקים ויראליים המכילים או מבנה של ביטוי יתר או מבנה המכיל SHRA. כשלב שני, תאי ramo מזוהמים עם הווירוסים, מה שמוביל להשחת ביטוי (knockdown) או לביטוי יתר של הגן הנבדק.בשלב הבא, שיבוטים של תאים בודדים גודלים במשך מספר שבועות כדי לאפשר לתאים לצבור מוטציות. לבסוף, ניתן לקבוע את ההשפעה של ביטוי הגנים השונה על בסיס ניתוח של אובדן IgM ועל ידי רצף של גני ה-IG. שיטה זו עשויה לסייע בזיהוי גורמים חדשים המעורבים בגיוון נוגדנים.התחל על ידי העברה של 600 µL של DMEM חם ומעשן למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. לאחר מכן, תוך הקפדה על פיפטינג ישירות לתוך המצע, הוסף 30 µL של FUgene 6 למבחנה, ערבב את התמיסה בוורטקס למשך פחות משנייה, ולאחר מכן הדגר את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, עבור הדבקה לנטיויראלית כזו, הוסף 6 µg של מבנה shRNA ו-1.5 µg מכל אחד מ-pVSV-G, pMDLg, pRPRE ו-pRSV-rev לתערובת ה-DMEM ו-FUgene 6.ערבבו את התמיסה בקצרה באמצעות וורטקס ולאחר מכן דגרו שוב בטמפרטורת החדר, הפעם למשך 25 דקות. לבסוף, בצעו טרנספקציה לתרבית תאי Bosque 23 בנשואיות (confluency) של 50% עד 60% עם תערובת ה-D-N-A-D-M-E-M FU. ערבבו ודגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 24 שעות.ביום למחרת, הוסיפו חמישה מיליליטר של DMEM לתאים והחזירו אותם לאינקובטור ל-24 שעות נוספות. ביום השלישי לאחר הטרנספקציה, השתמשו במזרק של 10 מיליליטר כדי לאסוף 10 מיליליטר של מצע מהתאים שטרנספקציה להם, ולאחר מכן חברו מסנן של 0.45 מיקרומטר לקצה המזרק. אספו את המצע המסונן אל תוך פרונטה נקייה של פוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר. 24 שעות לפני ההדבקה, זרעו שני מיליליטר של תאי RAMO בריכוז של פעמיים 10 בחזקת 5 תאים למשליליטר בתוך RPMI מלא בתוך פלטה בעלת שישה בארות. למחרת, הוסיפו שלושה מיקרוליטר של תמיסת polybrenan בריכוז של 10 מיקרוגרם למשליליטר, ומיליליטר אחד של נגיף לתאי ה-RAMO, וערבבו היטב את תרחיף התאים באמצעות פיפטור.עבור ביקורת ללא זיהום, הוסף מיליליטר אחד של RPMI מלא ושלושה מיקרוליטר של poly brain לאחת הבארות במקום את הווירוס. כמו כן, הדבק בארה אחת עם ביקורת שלילית תואמת ובארה נוספת עם וקטור המכיל GFP כדי לקבוע את יעילות ההדבקה באמצעות FACS. כעת, סבב את הפלטה בעלת שש הבארות ב-3000 GS למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן החזר את הפלטה לאינקובטור למשך 48 שעות.לבסוף, סבבו את התאים המודבקים בתוך מבחנה פוליפרופילן של 15 מיליליטר ב-400 Gs למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן שאבו את המצע תוך הקפדה על אי-הפרעה לשכבת התאים, ותלה את התאים ב-RPMI רענן. לאחר ספירת התאים, דללו את תרחיף תאי ה-ramo המודבקים לריכוז של 10 תאים למיליליטר.בתמיסה של מצע RPMI מותנה ו-FBS לנפח סופי של 10 milliliters עבור כל צלחת שזורעה. לאחר מכן, השתמש בפיפט רב-ערוצי לזריעה. פלטות של 96 בארות עם 100 microliters של התאים המדוללים לכל בארה.לאחר דגירה של הפלטות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide, השתמשו במיקרוסקופ כדי לבדוק כל באר בנפרד. הדבר נועד לאשר את נוכחות התאים, שכן קביעת העומק המתאים לזיהוי תאים בודדים עלולה להיות מורכבת. ראשית, נסו להתמקד במספרי הבארה המוטבעים בתחתית פלטת 96 הבארה.לאחר שבועיים, נסו לחפש תאים. בדקו אם קיימות מושבות תאים לאורך דפנות הבארות באמצעות טוש קבוע. סמנו את הבארות שבהן נצפתה צמיחה תאית חזקה, ולאחר מכן העבירו את המושבות לצלחות של 24 בארות במיליליטר אחד של RPMI להמשך דגירה.לאחר מספר ימי גידול, העבירו את התאים לפלטת שש בארות והמשיכו בדגירה של התרביות. שלושה שבועות לאחר זריעת מושבות התאים בפלטת השש בארות, העבירו 5×10⁵ תאים מכל בארה למבחנה מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. במועד זה, קצרו גם את התאים מכל אחת מבארות הביקורת ומבארות ה-HRNA knockdown, וכן דגימה אחת עבור ביקורת לא צבועה.כעת סובב את כל התאים בצנטריפוגה ב-400 Gs למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר, ושטוף את התאים פעמיים עם 1 mL של PBS עבור הסיבוב השני. לאחר השטיפה השנייה, נשעה את משקע הבקרה הבלתי צבוע ב-50 µL של PBS ואת שאר המשקעים ב-PBS בתוספת דילול של 1:20 של נוגדן anti-human IGM המסומן ב-PE. לאחר מכן, דגור את כל דגימות התאים על קרח למשך שעה אחת, ואחרי שטיפת התאים פעמיים נוספות עם PBS כפי שבוצע קודם לכן, השלך את העל-משקע ושעה מחדש את כל המשקעים ב-100 µL של PBS.בשלב הבא, העבירו את התאים הצבועים והתאים שאינם צבועים המשמשים כביקורת לאחר השהייה למבחנות fax, ולאחר מכן נתחו את התאים באמצעות ציטומטריה של זרימה. השוו את אחוז התאים השליליים ל-IgM מהביקורות לעומת התאים שבהם בוצע knockdown של S-H-R-N-A. וקטור ביטוי יתר רטרו-ויראלי עבור ID הועבר לתאי bosque 23.לאחר מכן נאספו הווירוסים ושימשו להדבקת תאי Ramos, הן מסוג הפרא (wild type או wt) והן תאים בעלי ביטוי ייתר של AID או תאי AID.High. התאים הונבתו כשלול תא בודד למשך שלושה שבועות, ובנקודת זמן זו נותחו עבור ביטוי גנים באמצעות qRT-PCR. כצפוי, תוצאות ה-qRT-PCR הראו עלייה ניכרת בביטוי AID בעקבות הדבקת תאים עם וקטור לביטוי ייתר של AID. אובדן IGM בתאים המודבקים הוערך גם באמצעות FACS. רמות IGM על פני השטח נמדדו ב-FACS בנקודת הזמן של שלושה שבועות (כפי שמוצג באיור הקודם), ואחוז אובדן ה-IGM חושב עבור תאי wild type ותאי AID high והוצג גרפית כאן. כצפוי, תאים עם ביטוי ייתר של AID הראו אובדן רב יותר של IGM על פני השטח.בניסוי נפרד, הוכנו בתאי bosque 23 לנטיוירוסים המכילים S-H-R-N-A לא רלוונטי כביקורת או S-H-R-N-A נגד גורם תיקון DNA בעל נאמנות גבוהה, אשר צפוי להגן מפני SHM. לאחר מכן, הלנטיוירוסים הוחדרו לתוך שיבוט ID high של תאי Ramos. שוב, נותח ביטוי הגנים, וכמצופה, נצפתה ירידה ברמות גורם תיקון ה-DNA בנוכחות S-H-R-N-A המכוון נגד גורם זה. כמו כן, נותח אובדן IGM בשיבוטים של תאים בודדים לאחר שלושה שבועות; כיוון שגורם התיקון נחשב כמעניק הגנה מפני מוטציות במהלך SHM, חלה עלייה באובדן IGM וב-SHM בהיעדרו של הגורם, כפי שניתן לראות בדמות זו.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע זיהומים נגיפיים של מבנים המכילים OVEREXPRESSION או S-H-R-N-A בשורת תאי B ראשונית, ולאחר מכן כיצד למדוד היפר-מוטציה סומטית בתאים אלו.

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מספקים שיטה לבדיקת גרסאות BRCA1 ב assay רקמה תרבות המבוססת לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של נזק לדנ"א על ​​ידי depleting החלבון BRCA1 אנדוגני מתא באמצעות RNAi והחלפתו מוטציה נקודת BRCA1 המכיל לשנות קידוד.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג'ין בתאי B.

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

זיהוי של מחזורי חומצה ריבונוקלאית (קרנה) מהדם נמצא צורך בתוכנית האבחון הקליני. כאן נתאר שיטות המאפיינות את קרנה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי רגיש וספציפי. הבדיקות בדרישות עיצוב לאתר גרסאות פיוז'ן בתוך 72 שעות.

דם מבוסס מבחן איתור ROS1 ואת RET פיוז'ן תעתיקים מלהסתובב חומצה ריבונוקלאית באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי

כאן, אנו מתארים בחיי עיר הכלאה assay המאפשרת זיהוי רגיש וספציפי של רצפי קצר ככל נוקלאוטידים 50 עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ברמת תא בודד. וזמינותו, אשר יכול להתבצע באופן ידני או אוטומטי, באפשרותך לאפשר ויזואליזציה של גרסאות splice, רצפים קצרים מוטציות בתוך ההקשר רקמות.

וריאציות גנטיות להמחיש מטרות קצרות, מוטציות נקודה בהקשר רקמות מורפולוגי עם RNA בחיי עיר Assay הכלאה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לזיהוי רקומבינציה הומולוגית אירועים שהתרחשו במהלך בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג בדרום ו/או ה-PCR. שיטה זו היא כשניסחתי את הדור של nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן II גנטי החלפת העכבר מודלים בטכנולוגיה המסורתית עובריים מבוססי תאי גזע הומולוגי בתיווך רקומבינציה מיקוד.

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

כתב יד זה מתאר שיטה CRISPR-Cas9 מבוססי מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) לחקירה פשוט ומהיר של התפקיד של גנים מרובים המועמד בהתפשטות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ב במקביל. טכניקה זו היא מדרגית, יכול להיות מיושם במבנים אחרים סרטן התא גם כן.

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

מוצג כאן הוא מבחנה לכמת היפרמוטציה סומטית בתוך לוקוז גנים שרשרת כבד אימונוגלובולין באמצעות תאי מרכז B נביטה מן המדבקות של העכבר פייר.

ניתוח של היפרמוטציה סומטית באינטרון JH4 של תאי מרכז נגרינל B מן המדבקות של עכבר פייר

מאמר זה מציג את היישום של שיטת זיהוי בתדר נמוך המבוססת על ריצוף Sanger בלימפומה אנגיואימונובלסטית. לספק בסיס ליישום שיטה זו על מחלות אחרות.

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

פרוטוקול זה מתאר גישת סקר CRISPR תוך-צינורית ניתנת להרחבה, המאפשרת מחקרים מקבילים של הכיבוי וההפעלה של הגנים בחיים בבלוטת השד של העכבר.

סקר מקביל ב-vivo של השמדת גנים והפעלה בבלוטת השד של העכברים

חקור השפעת שינויי ביטוי גנים על hypermutation סומטי בתאי Ramos B באמצעות זיהומים רטרו-ויראליים או לנטי-ויראליים. שיטה זו מאפשרת זיהוי גורמים חדשים המעורבים בגיוון נוגדנים ומסייעת להבנת מנגנוני מערכת החיסון.

הערכת Hypermutation תאים סומטיים ב ראמוס B לאחר Overexpression או מציאה של גנים ספציפיים

גלה סרטונים נוספים