הערכת Hypermutation תאים סומטיים ב ראמוס B לאחר Overexpression או מציאה של גנים ספציפיים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לשנות את הביטוי של גן ולאחר מכן למדוד את השפעתו על היפרמוטציה סומטית. דבר זה מושג על ידי טרנספקציה של תאי Bosque 23 כדי לייצר חלקיקים ויראליים המכילים או מבנה של ביטוי יתר או מבנה המכיל SHRA. כשלב שני, תאי ramo מזוהמים עם הווירוסים, מה שמוביל להשחת ביטוי (knockdown) או לביטוי יתר של הגן הנבדק.

בשלב הבא, שיבוטים של תאים בודדים גודלים במשך מספר שבועות כדי לאפשר לתאים לצבור מוטציות. לבסוף, ניתן לקבוע את ההשפעה של ביטוי הגנים השונה על בסיס ניתוח של אובדן IgM ועל ידי רצף של גני ה-IG. שיטה זו עשויה לסייע בזיהוי גורמים חדשים המעורבים בגיוון נוגדנים.

התחל על ידי העברה של 600 µL של DMEM חם ומעשן למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. לאחר מכן, תוך הקפדה על פיפטינג ישירות לתוך המצע, הוסף 30 µL של FUgene 6 למבחנה, ערבב את התמיסה בוורטקס למשך פחות משנייה, ולאחר מכן הדגר את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, עבור הדבקה לנטיויראלית כזו, הוסף 6 µg של מבנה shRNA ו-1.5 µg מכל אחד מ-pVSV-G, pMDLg, pRPRE ו-pRSV-rev לתערובת ה-DMEM ו-FUgene 6.

ערבבו את התמיסה בקצרה באמצעות וורטקס ולאחר מכן דגרו שוב בטמפרטורת החדר, הפעם למשך 25 דקות. לבסוף, בצעו טרנספקציה לתרבית תאי Bosque 23 בנשואיות (confluency) של 50% עד 60% עם תערובת ה-D-N-A-D-M-E-M FU. ערבבו ודגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 24 שעות.

ביום למחרת, הוסיפו חמישה מיליליטר של DMEM לתאים והחזירו אותם לאינקובטור ל-24 שעות נוספות. ביום השלישי לאחר הטרנספקציה, השתמשו במזרק של 10 מיליליטר כדי לאסוף 10 מיליליטר של מצע מהתאים שטרנספקציה להם, ולאחר מכן חברו מסנן של 0.45 מיקרומטר לקצה המזרק. אספו את המצע המסונן אל תוך פרונטה נקייה של פוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר. 24 שעות לפני ההדבקה, זרעו שני מיליליטר של תאי RAMO בריכוז של פעמיים 10 בחזקת 5 תאים למשליליטר בתוך RPMI מלא בתוך פלטה בעלת שישה בארות. למחרת, הוסיפו שלושה מיקרוליטר של תמיסת polybrenan בריכוז של 10 מיקרוגרם למשליליטר, ומיליליטר אחד של נגיף לתאי ה-RAMO, וערבבו היטב את תרחיף התאים באמצעות פיפטור.

עבור ביקורת ללא זיהום, הוסף מיליליטר אחד של RPMI מלא ושלושה מיקרוליטר של poly brain לאחת הבארות במקום את הווירוס. כמו כן, הדבק בארה אחת עם ביקורת שלילית תואמת ובארה נוספת עם וקטור המכיל GFP כדי לקבוע את יעילות ההדבקה באמצעות FACS. כעת, סבב את הפלטה בעלת שש הבארות ב-3000 GS למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן החזר את הפלטה לאינקובטור למשך 48 שעות.

לבסוף, סבבו את התאים המודבקים בתוך מבחנה פוליפרופילן של 15 מיליליטר ב-400 Gs למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן שאבו את המצע תוך הקפדה על אי-הפרעה לשכבת התאים, ותלה את התאים ב-RPMI רענן. לאחר ספירת התאים, דללו את תרחיף תאי ה-ramo המודבקים לריכוז של 10 תאים למיליליטר.

בתמיסה של מצע RPMI מותנה ו-FBS לנפח סופי של 10 milliliters עבור כל צלחת שזורעה. לאחר מכן, השתמש בפיפט רב-ערוצי לזריעה. פלטות של 96 בארות עם 100 microliters של התאים המדוללים לכל בארה.

לאחר דגירה של הפלטות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide, השתמשו במיקרוסקופ כדי לבדוק כל באר בנפרד. הדבר נועד לאשר את נוכחות התאים, שכן קביעת העומק המתאים לזיהוי תאים בודדים עלולה להיות מורכבת. ראשית, נסו להתמקד במספרי הבארה המוטבעים בתחתית פלטת 96 הבארה.

לאחר שבועיים, נסו לחפש תאים. בדקו אם קיימות מושבות תאים לאורך דפנות הבארות באמצעות טוש קבוע. סמנו את הבארות שבהן נצפתה צמיחה תאית חזקה, ולאחר מכן העבירו את המושבות לצלחות של 24 בארות במיליליטר אחד של RPMI להמשך דגירה.

לאחר מספר ימי גידול, העבירו את התאים לפלטת שש בארות והמשיכו בדגירה של התרביות. שלושה שבועות לאחר זריעת מושבות התאים בפלטת השש בארות, העבירו 5×10⁵ תאים מכל בארה למבחנה מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. במועד זה, קצרו גם את התאים מכל אחת מבארות הביקורת ומבארות ה-HRNA knockdown, וכן דגימה אחת עבור ביקורת לא צבועה.

כעת סובב את כל התאים בצנטריפוגה ב-400 Gs למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר, ושטוף את התאים פעמיים עם 1 mL של PBS עבור הסיבוב השני. לאחר השטיפה השנייה, נשעה את משקע הבקרה הבלתי צבוע ב-50 µL של PBS ואת שאר המשקעים ב-PBS בתוספת דילול של 1:20 של נוגדן anti-human IGM המסומן ב-PE. לאחר מכן, דגור את כל דגימות התאים על קרח למשך שעה אחת, ואחרי שטיפת התאים פעמיים נוספות עם PBS כפי שבוצע קודם לכן, השלך את העל-משקע ושעה מחדש את כל המשקעים ב-100 µL של PBS.

בשלב הבא, העבירו את התאים הצבועים והתאים שאינם צבועים המשמשים כביקורת לאחר השהייה למבחנות fax, ולאחר מכן נתחו את התאים באמצעות ציטומטריה של זרימה. השוו את אחוז התאים השליליים ל-IgM מהביקורות לעומת התאים שבהם בוצע knockdown של S-H-R-N-A. וקטור ביטוי יתר רטרו-ויראלי עבור ID הועבר לתאי bosque 23.

לאחר מכן נאספו הווירוסים ושימשו להדבקת תאי Ramos, הן מסוג הפרא (wild type או wt) והן תאים בעלי ביטוי ייתר של AID או תאי AID.High. התאים הונבתו כשלול תא בודד למשך שלושה שבועות, ובנקודת זמן זו נותחו עבור ביטוי גנים באמצעות qRT-PCR. כצפוי, תוצאות ה-qRT-PCR הראו עלייה ניכרת בביטוי AID בעקבות הדבקת תאים עם וקטור לביטוי ייתר של AID. אובדן IGM בתאים המודבקים הוערך גם באמצעות FACS. רמות IGM על פני השטח נמדדו ב-FACS בנקודת הזמן של שלושה שבועות (כפי שמוצג באיור הקודם), ואחוז אובדן ה-IGM חושב עבור תאי wild type ותאי AID high והוצג גרפית כאן. כצפוי, תאים עם ביטוי ייתר של AID הראו אובדן רב יותר של IGM על פני השטח.

בניסוי נפרד, הוכנו בתאי bosque 23 לנטיוירוסים המכילים S-H-R-N-A לא רלוונטי כביקורת או S-H-R-N-A נגד גורם תיקון DNA בעל נאמנות גבוהה, אשר צפוי להגן מפני SHM. לאחר מכן, הלנטיוירוסים הוחדרו לתוך שיבוט ID high של תאי Ramos. שוב, נותח ביטוי הגנים, וכמצופה, נצפתה ירידה ברמות גורם תיקון ה-DNA בנוכחות S-H-R-N-A המכוון נגד גורם זה. כמו כן, נותח אובדן IGM בשיבוטים של תאים בודדים לאחר שלושה שבועות; כיוון שגורם התיקון נחשב כמעניק הגנה מפני מוטציות במהלך SHM, חלה עלייה באובדן IGM וב-SHM בהיעדרו של הגורם, כפי שניתן לראות בדמות זו.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע זיהומים נגיפיים של מבנים המכילים OVEREXPRESSION או S-H-R-N-A בשורת תאי B ראשונית, ולאחר מכן כיצד למדוד היפר-מוטציה סומטית בתאים אלו.