Name: Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: למדו לזהות ולעקוב אחר אירועי Fusion Cell בחיים באמצעות מערכת Cre-LoxP וזיהוי לומינסנציה. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תוצרי Fusion Cell בעכברים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Peiman Hemmati (המחלקה לרפואה, אוניברסיטת וויסקונסין) עבור בנדיבות מתן MSCs H1, ואת ד&quot;ר טים האקר, ד&quot;ר Gouqing שיר גב &#39;ג&#39;יל קוך של אוניברסיטת ויסקונסין לב וכלי דם פיזיולוגיה Core Facility לביצוע ניתוחים העכבר. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות מלגת מחקר לתארים מתקדמים על בריאן פרימן NIH R21 HL089679.

1. תא התורם transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mesenchymal קציר בתאי גזע (MSCs, שמקורם בתאי גזע עובריים H1 נתרם באדיבות על ידי ד&quot;ר Peiman Hematti; לחילופין, כל סוג תא של כל מיני שיערו הפתיל in vivo יכול להיות מועסק), כאשר 70-80% ומחוברות עם 1X טריפסין (Mediatech, Manassas VA) במשך 5 דקות. להשבית טריפסין עם המדיום α-ממ מלא (ללא אנטיביוטיקה, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. צנטריפוגה ב XG 300 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ&quot;ל של 1X PBS ו לספור תאים באמצעות hemacytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1.5 x 10 6 תאים צינור 1.5 צנטריפוגות מ&quot;ל. צנטריפוגה ב XG 300 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend גלולה ב 300 μL של R חוצץ (מערכת נאון transfection, Invitrogen) ו 6 מיקרוגרם (2 מיקרוגרם / 5.0 x 10 5 תאים) של p231 pCMVe-betaAc-STOP לוק (Addgene, Cambridge, MA). מקום 3 מ&quot;ל של הצפת E (Invitrעוגן) ליציאת electroporation עגינה לכל פרוטוקול של היצרן (מערכת transfection נאון, Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התא הפלסמיד פתרון טיפ 100 Neon μL pipet ו electroporate עם משך פעימה של 20 אלפיות ו גודל של 1500 וולט. המקום electroporated תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל מכיל 9.7 מ&quot;ל α-ממ בינוני מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.5 פעמיים נוספות ותאי בריכה transfected להניב בנפח כולל של 10 מ&quot;ל. מוסיפים 10 מ&quot;ל תא ההשעיה (1.5 x 10 6 תאים) כדי T175 בקבוק המכיל 10 מ&quot;ל α-ממ בינוני מלא. כדאיות התא לאחר electroporation הוא כ 30%, תשואה של כ 4.5 x 10 5 תאים לכל קיימא T175. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה α-ממ להשלים בינוני 24 שעות לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר transfected תאים כאשר 70-80 ומחוברות% (~ 2 - 3 ימים לאחר electroporation). בצעו ספירת תאים באמצעות hemacytometer ו resuspend התאים בריכוז של 1.0 x 10 6cells/50 μL של המדיום α-ממ להשלים. מזעור התאים זמן לבלות ההשעיה כדי להפחית מוות של תאים לפני ההזרקה. </li></ol> 2. Intramyocardial Injection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות הרדמה על ידי isoflurane (פיניקס Pharmaceuticals, Inc, סנט ג&#39;וזף, מיזורי) על העכברים הטרנסגניים מהונדסים constitutively להביע Cre recombinase בכל תא (B6.C-Tg (CMV-cre) 1Cgn / J, ג&#39;קסון מעבדה, בר הרבור, ME). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שיער מאזור החזה באמצעות קוצץ שיער או שיער מסיר כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצנרר עם קטטר 18 מד (בקטון דיקינסון ושות&#39;, פרנקלין לייקס NJ) ומקום למכונת הנשמה העכבר 120-130 נשימות לדקה עם נפח של שבץ μL 150. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך לרוחב פני השטח צלעי fourth ובכך לייצר פתיחת בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדמיין את הלב, לעשות שני 25 זריקות μL ההשעיה תא transfected באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל (Temuro רפואי Corporation, Somerset, NJ) ו - 28 מחט מד (Bectעל דיקינסון ושות&#39;, פרנקלין לייקס NJ). כדי להקל על הזרקת intramyocardial ולמנוע נזק מוגזם האיבר, לכופף את ראש מחט ~ 90 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הזריקה, להשתמש בתפרים נספגים (למשל, vicryl) כדי לסגור את הצלעות שכבות השריר. עור תפר סגור באמצעות ניילון משי או 4-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העכבר כדי להתאושש הרדמה extubate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצות הבקרה צריכה לכלול עכברים Cre קבלת זריקות בינוני בלבד, עכברים Cre לקבל את אותו ריכוז של תאים untransfected ועכברים סוג בר קבלת תאים transfected (לחלופין, עכברים Cre קבלת תאים transfected לא נוטה הפתיל). </li></ol> 3. Biophotonic הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמש עד חמש עשרה דקות לפני הדמיה, intraperitoneally (IP) להזריק 10 μL לגרם משקל גוף העכבר של 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​D-Luciferin (Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות הרדמה על עכברים באמצעות isoflurane ב 4% לזירוזד 1-2% לצורך תחזוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עכברים פרקדן בתיבת הדמיה עם facemask מתן 1-2% isoflurane עבור הרדמה תחזוקה (מערכת הדמיה Xenogen Biophotonic, Hopkinton, MA). מספר העכברים ניתן הדמיה במקביל. תמונה דמה עכבר שליטה עם עכברי הניסוי לצורך השוואה קלה של האות זורח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תמונה Living תוכנה (Xenogen), לקבוע זמן החשיפה המתאימה (בדרך כלל 60 שניות, לראות תוצאות). הגדרת שטח של התמונה כך שתתאים עכברים לשמור אזור עקביות לאורך הדמיה כדי למנוע שינויים ברגישות. קביעת גובה הנושא 4.5 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את עוצמת הארה האות המתאים העכבר או עכברים בתחום להציג ולשמור קבצי תמונה ללא שינוי. תמונות תהליך להסיר אות הרקע המתאים כדי לשלוט או עכבר unmanipulated. ערכים עוצמה מעל רקע מתאימות התאים התמזגו בתוך החיה. ניתוח עוצמת ניתן לבצע באמצעות תמונה Living תוכנה (Xenogen) או קוד פתוח תוכנה לניתוח תמונה. T<html> ypically, באזור של עניין (ROI) נבחרה כדי להשוות נתונים בין עוצמת ניסויים בבעלי חיים. </li></ol> 4. נציג תוצאות כדי לקבוע את הרגישות של מערכת הדמיה Biophotonic Xenogen, קו תאים אשר constitutively מבטא בלוציפראז (231-Luc-D3H1, Xenogen) נמסר שריר הלב של C57/Bl6 עכברים (ג&#39;קסון מעבדה). הוזרקו תאים בריכוזים של 1 x 10 6, 1 x 10 3, או 1 1 x 10 תאים. שש שעות לאחר הלידה התא, הוזרקו לעכברים intraperitoneally עם luciferin הדמיה באמצעות מערכת Xenogen. אות מסוים יכול להיות מזוהה עם 1,000 תאים (2 של 6 עכברים הדמיה, איור 2), אבל היה זיהוי אמין יותר עם ​​10,000 תאים (6 מתוך 6 עכברים הדמיה). חשוב לציין כי מחקר זה שימש גם להקים מתאם גס בין מספר בלוציפראז-להביע תאים ועוצמת האות. &gt; כדי להדגים את התועלת של פרוטוקול המתואר גילוי ומעקב אחר איחוי תאים, MSCs היו transfected עם LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז פלסמיד (Addgene) ונמסרו שריר הלב של Cre-לבטא בעכברים. כשבוע לאחר הלידה התא, העכברים היו הדמיה הראשון באמצעות מערכת Xenogen ללא הזרקה D-luciferin. כצפוי, ללא מצע האנזימטית, עוצמת האות לא זוהה (איור 3). בשלב הבא, D-luciferin שהוזרק intraperitoneally ואת האות המתאימה לעוצמת בלוציפראז ובכך איחוי תאים התגלה בשניים מתוך ארבעה עכברים שנבדקו. איתות דומה התגלתה שבוע מאוחר יותר (איור 3), מה שמרמז MSC מצמידים מוצרים היתוך יכול להישמר in vivo. במקרה זה, המחקר הופסק כדי לאפשר הערכה של הלב הרקמה שמסביב, אבל אפשר לחזות לטווח ארוך ניתוחים הדמיה תכופות יותר כדי לעקוב אחר התפשטות, תחזוקהד אולי הגירה של מוצרים היתוך בעכברים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של טכניקה לזהות Fusion Cell in vivo. היתוך בין אם Cre-לבטא בתאי עכבר התאים המושתלים להביע פלסמיד בלוציפראז floxed מתרחשת, בלוציפראז יבוא לידי ביטוי. בלוציפראז ניתן לאתר על ידי הזרקת המצע האנזימטית, D-luciferin, לעכבר ולאחר מכן הדמיה את העכבר באמצעות הדמיה Biophotonic Xenogen System (מעובד מתוך 19) <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig2.jpg" /> באיור 2. רגישות הזיהוי של בלוציפראז-להביע תאים ברקמת הלב עם הדמיה biophotonic. קו תאים אשר constitutively מבטא בלוציפראז (231-Luc-D3H1, Xenogen) נמסר בחלל intramyocardial C57/Bl6 של עכברים שונים מספרים על תא הכולל. נציג תמונות של עכברים מחדשceiving 1 x 10 6, 1 ו - 3 x 10 x 10 1 1 תאים (משמאל לימין) מוצגים, הדמיה נערך כ -6 שעות לאחר ההזרקה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig3.jpg" /> באיור 3. כימות בשנת הארה Vivo אינדיקטיביים של Fusion Cell. MSCs היו transfected עם LoxP-Stop-LoxP-בלוציפראז פלסמיד ונמסרו שריר הלב של Cre-לבטא בעכברים. כשבוע ושבועיים לאחר הלידה התא, עכברים Cre היו הדמיה באמצעות מערכת Biophotonic Xenogen הדמיה כדי למדוד את עוצמת הארה מעיד על איחוי תאים. (א) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של זיוף ועכברים 1-4 (משמאל לימין) 17 ימים לאחר הלידה התא. (ב) עוצמת הארה של זיוף ועכברים 1-4 (משמאל לימין) 17 ימים לאחר הלידה התא. אזור של אינטרס נבחר (צהוב) המתאים הזריקה ואני עוצמתevels נקבעו באמצעות ImageJ (מקור חינם) תוכנה 20. (ג) עוצמת הארה היה מנורמל לאזור באותו עניין על זיוף העכבר על כל תנאי הניסוי. באותו שבוע, 3 ו -4 עכברים הראו אות הארה חיובי המצביע על היתוך ספונטני של תא עכבר MSC המושתלים. האות התמיד העכבר 3 ב שבועיים. כדי לקבוע איבר ספציפי לוקליזציה של האות המתאים העכבר 3, חלל בית החזה נחשף ואיברים העיקרי שנכרת הדמיה. (ד) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של העכבר 3. הערה לוקליזציה של עוצמת האות במעי הדק. (ה) עוצמת הארה של העכבר 3. (F) כיסוי של הצילום ואת עוצמת הארה של זיוף העכבר. (G) עוצמת הארה של זיוף העכבר.

<ol><li>Bernirschke, K. K. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBernirschke%2C+KKP+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer. New York. (2000).</li>
<li>Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+localization+of+chorionic+gonadotropin+alpha+and+placental+lactogen+mRNAs+during+development+of+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta.</a> J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).</li>
<li>Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+deportation+in+human+pregnancy--its+relevance+for+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia.</a> Placenta. 20, 531-539 (1999).</li>
<li>Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+debris%2C+oxidative+stress+and+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, 597-602 (2000).</li>
<li>Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+of+cells+between+species+yields+transdifferentiation+and+retroviral+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo.</a> FASEB. J. 18, 548-550 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+hematopoietic+cells+generate+cardiomyocytes+at+a+low+frequency+through+cell+fusion%2C+but+not+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation.</a> Nat. Med. 10, 494-501 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+and+lymphoid+contribution+to+non-haematopoietic+lineages+through+irradiation-induced+heterotypic+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion.</a> Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).</li>
<li>Kutschka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+human+BCL-2+transgene+expression+attenuates+early+donor+cell+death+after+cardiomyoblast+transplantation+into+ischemic+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts.</a> Circulation. 114, I174-I180 (2006).</li>
<li>Min, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+cord+blood+derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+into+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium.</a> Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).</li>
<li>Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characterization+and+hormonal+regulation+of+kidney+androgen-regulated+protein+%28Kap%29-luciferase+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice.</a> Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).</li>
<li>Weir, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophotonic+imaging+in+HO-1.luc+transgenic+mice%3A+real-time+demonstration+of+gender-specific+chloroform+induced+renal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity.</a> Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).</li>
<li>Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+bioluminescent+Brucella+melitensis+mutants+GR019+%28virB4%29%2C+GR024+%28galE%29%2C+and+GR026+%28BMEI1090-BMEI1091%29+confer+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice.</a> Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).</li>
<li>Kadurugamuwa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+monitoring+of+catheter-associated+urinary+tract+infections+and+therapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice.</a> Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).</li>
<li>Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+monitoring+in+real+time+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+gene+expression+under+relaxin-induced+conditions+in+a+novel+murine+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).</li>
<li>Noiseux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+overexpressing+Akt+dramatically+repair+infarcted+myocardium+and+improve+cardiac+function+despite+infrequent+cellular+fusion+or+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation.</a> Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).</li>
<li>Ajiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+tissue+transplantation+in+rats%3A+fusion+of+donor+muscle+to+the+recipient+site%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site.</a> Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).</li>
<li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).</li>
<li>Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological implications of cell fusion.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת כאן מאפשר, לראשונה, זיהוי וניתוח בדידה הזמני של איחוי תאים באורגניזמים, כולל חיות קטנות. הגישה משלבת Cre-LoxP רקומבינציה עם ניתוח שלאחר מכן תמונה biophotonic. הגישה ניתנת למעקב לא רק תאים תאים היתוך, אלא גם וירוס תאים היתוך ולכן יכול להיות שימושי עבור מעקב אחר זיהומים נגיפיים. ניתוח התמונה היא מהירה אפשר החיות מספר תמונות קטן בו זמנית. איתור של היתוך הוא מוגבל על ידי התדירות של היתוך של שותפים לתא מסוים microenvironments המקביל שלהם על ידי היעילות של transfec...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> נאון מערכת transfection </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> MPK5000 </td><td></td></tr><tr><td> נאון 100 μL Kit </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> MPK10025 </td><td> מכיל R ו-E הצפת </td></tr><tr><td> ממ, אבקת </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) </td><td> Hyclone, לוגן UT </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> B6.C-Tg (CMV-cre) 1Cgn / J </td><td> ג&#39;קסון מעבדה, בר הרבור, ME </td><td> 006054 </td><td></td></tr><tr><td> 10X טריפסין </td><td> פישר סיינטיפיק, יער Lawn, NJ </tד&gt; <td> MT-25-054-Cl </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> פישר סיינטיפיק, יער Lawn, NJ </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Xenogen מערכת הדמיה Biophotonic </td><td> Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA </td><td> IVIS ספקטרום </td><td></td></tr><tr><td> נתרן Biocarbonate </td><td> סיגמא אולדריץ&#39;, סנט לואיס, מיזורי </td><td> S6014-500 גרם </td><td></td></tr><tr><td> שאינם חיוניים חומצות אמינו </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr></tbody></table>

cre-p לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של fusion cell in vivo</em

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

היכולת של שני תאים או יותר מאותו סוג הפתיל נוצל metazoans במהלך האבולוציה כדי ליצור איברים מורכבים רבים, כולל שרירים ועצמות השלד, ואת השליה. מחקרים עכשוויים מראים היתוך של תאים מאותו סוג מעניקה פונקציה משופרת. למשל, כאשר תאים trophoblast של הפתיל את השליה לטופס syncytiotrophoblast, syncytiotrophoblast הוא טוב מסוגל להעביר חומרים מזינים והורמונים דרך מחסום אימהית, העובר מאשר trophoblasts unfused 1-4. מחקרים מאוחרים יותר מראים היתוך של תאים מסוגים שונים יכול לכוון גורל התא. &quot;חזרה&quot; או שינוי גורל התא על ידי היתוך חשבו פעם להיות מוגבל במערכות תרבית תאים. אבל הופעתו של השתלת תא גזע הובילו לגילוי על ידינו ואחרים בתאי גזע יכול להתמזג עם תאים סומטיים in vivo ו היתוך המאפשר בידול תא גזע 5-7. לפיכך, המיזוג התא תהליך מוסדר גapable לקידום הישרדות התא בידול ולכן יכול להיות בעל חשיבות מרכזית לתיקון הפיתוח של רקמות ואפילו בפתוגנזה של המחלה. הגבלת המחקר של היתוך התא, הוא היעדר טכנולוגיה מתאימה 1) לזהות במדויק מוצרים היתוך ו 2) היתוך מוצרים לעקוב לאורך זמן. כאן אנו מציגים גישה חדשנית לטיפול הן המגבלות באמצעות אינדוקציה של פליטת אור על היתוך (איור 1):. פליטת אור ניתן לאתר עם ​​רגישות גבוהה in vivo 8-15 אנו מנצלים לבנות קידוד בלוציפראז גחלילית (Photinus pyralis) הגן ממוקם בסמוך קודון להפסיק מוקף רצפים LoxP. כאשר תאים להביע את הפתיל גן עם תאים המבטאים את חלבון recombinase Cre, אתרי LoxP הם ביקע את האות לעצור הוא נכרת ומאפשר שעתוק של בלוציפראז. בגלל האות inducible, שכיחות חיוביות שגויות אותות נמוך מאוד. בניגוד לשיטות הקיימות אשר מנצלים את Cre / מערכת LoxP 16, 17, יש לנו שולבו &quot;חי&quot; אות זיהוי ובכך להרשות בפעם הראשונה את ההזדמנות כדי לעקוב אחר קינטיקה של איחוי תאים in vivo. כדי להדגים את הגישה, עכברים בכל מקום בגוף להביע Cre recombinase שימש מקבלי בתאי גזע transfected עם לבנות להביע את הזרם בלוציפראז של קודון עצירה floxed. בתאי גזע הושתלו באמצעות הזרקה intramyocardial ואחרי ניתוח השתלת intravital תמונה נערך כדי לעקוב אחר נוכחות היתוך מוצרים הלב הרקמות הסובבות לאורך זמן. גישה זו יכולה להיות מותאם לנתח איחוי תאים בכל סוג רקמה בכל שלב של המחלה ופיתוח, או לתקן רקמות מבוגר.

שיטה כדי לעקוב אחר איחוי תא אורגניזמים חיים על פני זמן מתואר. הגישה מנצל Cre-<em&gt; LoxP</emרקומבינציה&gt; לגרום הביטוי בלוציפראז על איחוי תאים. האות זורח שנוצר ניתן להבחין יצורים חיים באמצעות מערכות הדמיה biophotonic עם רגישות של גילוי של ~ 1,000 תאים ברקמות היקפי.

Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo</em

היכולת של שני תאים או יותר מאותו סוג להתאחות נוצלה בקרב רב-תאיים (metazoans) לאורך האבולוציה כדי ליצור איברים מורכבים רבים, כולל...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות ולעקוב אחר אירועי היתוך תאים in vivo. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספקציה של גן לוסיפרז (luciferase) מושבת בתאי תורם. השלב השני של הפרוצדורה הוא העברת התאים שעברו טרנספקציה לרקמות של עכבר שעבר שינוי גנטי לביטוי קוסטטיבי של Cre recombinase.השלב השלישי הוא דימות לומנסנציה (luminescence) ברקמות של עכברי המקבלים, המעידה על אירועי היתוך תאים. לאחר מכן תבוצע אנליזה של עוצמות האות בהתאם לתנאי הניסוי. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות לוקליזציה ותנועה של תוצרי היתוך תאים בעכברים חיים, באמצעות זיהוי לומנסנציה הניתנת להשראה הקשורה להיתוך תאים.השיטה יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי ההתפתחות, ביולוגיה של תאי גזע וביולוגיה של הסרטן, כגון האם היתוך תאים מקדם תכנות של תאי גזע, או האם גרורות סרטניות נשענות על היתוך תאים. את הפרוצדורה ידגימו Anthony Springers, Nicholas Co ו-Brian Freeman, סטודנטים במעבדה שלנו, ו-gal queen song, מדענית שותפה במחלקה לרפואה. התחילו בביצוע trypsin לתאים עבור היתוך in vivo כאשר הם מגיעים לרמת התלכדות (confluency) של 70% עד 80%. במקרה זה נעשה שימוש בתאי גזע מזנכימליים; נטרלו את ה-trypsin באמצעות מצע alpha-MEM מלא ללא אנטיביוטיקה, וסובבו את התאים במערבב (spin down). שאבו בזהירות את העלייה (supernatant) ושעלקו מחדש את משקע התאים ב-1 mL של 1X PBS. לאחר ספירת התאים באמצעות המוציטומטר, העבירו 1.5 מיליון תאים לשפופרת צנטריפוגה והשקיעו אותם למשקע.לאחר שאיבה זהירה של supernatant Resus, השעו את המשקע ב-300 microliters של R buffer המכיל six micrograms של פלסמיד, בהתאם לפרוטוקול היצרן. הכניסו three milliliters של EBU לתוך פתח החיבור של האלקטרופורציה.לאחר מכן, העבר 100 µL של תמיסת הפלסמיד של התאים לקצה פיפט של neon. מקם את קצה הפיפט בתוך מכשיר האלקטרופורציה ובצע אלקטרופורציה לתאים.כעת העבירו את התאים הללו למבחנה קונית של 15 milliliter המכילה 9.7 milliliters של alpha MEM, מצע מלא. חזרו על תהליך האלקטרופורציה פעמיים כדי לקבל סה"כ 300 microliters של תאים שעברו אלקטרופורציה, כאשר כולם מאוגדים במצע ה-alpha MEM המלא. לאחר מכן, הוסיפו את התאים לבקבוק T 1 75 המכיל 10 milliliters נוספים של alpha MEM מלא.החליפו את המצע 24 שעות לאחר הטרנספקציה; הישרדות התאים לאחר אלקטרופורציה היא כ-30%, מה שמניב כחצי מיליון תאים חיוניים לכל בקבוק. לאחר יומיים או שלושה, התאים יגיעו ל-70 עד 80% התלכדות (confluency). לאחר מכן, העבירו וספרו את התאים רגע לפני ההזרקה. Resus.שעו את התאים ב-alpha MEM מלא בריכוז של 1 מיליון תאים ל-50 µL מדיום, והזריקו אותם בהקדם האפשרי כדי למזער את מוות התאים. נוהל זה משתמש בעכברים שהונדסו להבטא Cre recombinase באופן רחב (ubiquitously), לאחר הרדמת עכבר באמצעות isoflurane לפני תחילת הפעולה. ודאו כי העכבר נמצא במישור הרדמה כירורגי באמצעות בדיקת כאב.כעת הסר את הפרווה מאזור החזה באמצעות מכונת גילוח או מסיר שיער כימי. לאחר מכן, הכן את העכבר לניתוח על ידי החדרת קטטר בכיול 18, והנחתו על מכשיר הנשמה לעכברים ומעל פד חימום. כעת בצע תורקוטומיה באמצעות חתך צדי לרוחב המרווח הבין-צלעי הרביעי.השיגו זווית ראייה ברורה של הלב. כופפו את קצהו של מחט בכילייב 28 המחוברת למזרק של 1 מיליליטר לזווית של כמעט 90 מעלות. מלאו את המזרק ב-50 µL מהתאים שהוכנו, כולל מעט אוויר נוסף כדי שניתן יהיה לדחוף את כל נפח התאים מהמחט.כעת בצע 2 הזרקות תוך-שריריות של 25 microliter של תרחיף התאים שעברו טרנספקציה אל החלל הקדמי של החדר השמאלי. חשוב לוודא שהזרקת התאים מתבצעת לתוך הרקמה. ניתן לאשש זאת על ידי התבוננות בהתרחבות הרקמה בזמן ביצוע ההזרקה לאחר ההזרקות.השתמשו בתפרים נספגים, כגון תפרי Vicryl, לסגירת הצלעות ושכבות השריר. השלימו את הניתוח על ידי סגירת העור באמצעות nylon או משי במידה 4-0. בעת ביצוע הניתוח וההזרקה, פעלו במהירות, שכן ההצלחה תלויה במשך הזמן הקצר של הליך זה.כעת אפשרו לעכבר להתאושש מההרדמה על פלטת חימום, ובצעו את הוצאת התבנור (extubation) כאשר העכבר משתעל או מפגין פעילות רפלקסיבית. עבור הביקורות, יש להזריק לקרם קרח מצע alpha MEM שאינו מכיל תאים שעברו טרנספקציה, ולעכברים מסוג wild type יש להזריק את התאים שעברו טרנספקציה. הרדימו את העכברים המיועדים לדימות באמצעות 4% isof fluorine.הכינו את העכברים באמצעות הזרקה תוصفית (intraperitoneal) של D Lucifer. הניחו כל עכבר שהורדם וטוען בלוסיפראז במצב שכיבה על הגב (supine). בתיבת הדימוי, ניתן לדמיין מספר עכברים בו-זמנית, כולל עכבר בקרה שקיבל הזרקת דמה (sham injection).באמצעות מסכת גז, שמרו על הרדמתם באמצעות 1% עד 2% isoflurane. מקמו את תיבת ההדמיה תחת המיקרוסקופ ופתחו חבילת תוכנה זמינה מסחרית לניהול ההדמיה. הכינו את התוכנה על ידי הגדרת זמן החשיפה המתאים תחילה.בשלב הבא, הגדירו את צורת האזור להדמיה עבור עכבר אחד והשתמשו באותה צורת הדמיה עבור כל שאר העכברים המודמיינים. לאחר מכן, הגדירו את גובה הנבדק ל-4.5 centimeters. רכשו אות עוצמת לומניסנציה התואם לעכבר או לעכברים שנמצאים בתוך שדה הראייה.לאחר מכן, שמרו את קובץ התמונה ללא שינויים. עבדו את התמונות כדי להסיר את אות הרקע המתאים לערכי העוצמה של עכבר הביקורת; רמות הלומניסנציה שמעל הרקע תואמות לתאים מאוחדים בתוך בעל החיים. מצאנו כי תוכנת הקוד הפתוח ImageJ היא אמינה וניתנת להתאמה בקלות לצורך עיבוד תמונות לאחר הצילום.לביצוע ניתוח זה, קריטי ביותר שהתמונות המתקבלות מתוכנת ה-Xeno gen ייוצאו כקבצי T. ניתן לבצע ניתוח עוצמה באמצעות תוכנות לניתוח תמונות הזמינות מסחרית או כקוד פתוח. בדרך כלל, נבחר אזור עניין (region of interest) כדי להשוות נתוני עוצמה בין בעלי חיים ובין ניסויים, וזאת כדי לקבוע את רגישות מערכת ההדמיה.שורת תאים המבטאת לוציפראז באופן קוסטיטיבי הוזרקה לשריר הלב של עכברי C 57 black six בריכוזים משתנים. שישה שעות לאחר מכן, בוצעו לעכברים בדיקות דימות לאיתור אות לומינסנציה. אות זו זוהה בשניים מתוך שישה עכברים שהוזרקו להם 1000 תאים, ובכל ששת בעלי החיים שהוזרקו להם 10,000 תאים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי הדרך לזיהוי ומעקב אחר תוצרי היתוך תאים in vivo באמצעות גילוי לומנסנציה הניתנת להשראה.

a-cre-lox-p-recombination-approach-for-detection-cell-fusion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון הזה אנחנו מדגימים electrofusion יעילה של...

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

פתחנו assay איחוי תאים שמכמת אירועי איחוי המלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז.

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

אינטראקציות חלבון-חלבון מוצגות בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטרית על ידי שילוב של השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) עם מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-אקטיבי (PALM). מתואר כאן השימוש ב-BiFC-PALM להדמיית אינטראקציות Ras-Raf בתאי U2OS להמחשת אשכולות ודיפוזיה בקנה מידה ננומטרי של קומפלקסים בודדים של Ras-Raf.

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

פונקציות תא-אוטונומי של גנים במוח יכולים להילמד על ידי גרימת הפסד או רווח של פונקציה באוכלוסיות דלילה של תאים. כאן, אנו מתארים בתוך הרחם אלקטרופורציה לספק Cre recombinase לאוכלוסיות דליל לפתח נוירונים בקליפת המוח עם הגנים floxed לגרום לאובדן פונקציה בתוך vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

מטרת פרוטוקול זה היא לנתיך שני סוגי תאים שונים כדי ליצור תאים היברידיים. ניתוח מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של תאים התמזגו משמש כדי לעקוב אחר התא של המקור של אורגלים הסלולר. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לחקור כיצד המבנה התאי והפונקציה מגיבים להפרעות באיחוי התאים.

תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא טכניקת הדמיה לאיתור אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים. כאן מוצג פרוטוקול FRET כדי לחקור את הקשר של אנזימים משני היסטון עם גורמי שעתוק המגייסים אותם למקדמי היעד לוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים ברקמות צמחים.

חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק in vivo על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

למדו לזהות ולעקוב אחר אירועי Fusion Cell בחיים באמצעות מערכת Cre-LoxP וזיהוי לומינסנציה. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תוצרי Fusion Cell בעכברים חיים.

Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo

גלה סרטונים נוספים