מסלול אישור דיסקברי מטבולית ודרך ¹³ C-תיוג של חומצות אמינו Proteinogenic

מטרת פרוטוקול זה היא ללמוד על מטבוליזם חיידקי באמצעות ניתוח מטבולי באמצעות פחמן 13. ראשית, גדלים מיקרואורגניזמים בנוכחות סובסטרטים של פחמן מסומן, אשר נספגים בחלבונים המיקרוביאליים. לאחר מכן קוצרים את המיקרואורגניזמים, ואת חומצות האמינו מפיקים, ממיסים (הידרוליזה) ומבצעים להם נגזרת (דרבטיזציה).

הדגימות מוכנסות לכרומטוגרף גזים ולספקטרומטר מסות (GCMS). באמצעות מעקב אחר נתיבי המעבר של האטומים בין מטבוליטים ברשת הביוכימית, ניתן לקבוע את המסלולים המטבוליים התפקודיים שבהם נעזר המיקרוב. אני ברט בורלה.

השיטה שאנו מציגים כאן יכולה לשמש כהשלמה לטרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה לקביעת המסלולים המטבוליים במיקרובים. השתמשנו בטכניקה זו כדי לחקור מיקרובים פוטוסינתטיים כגון ציאנובקטריה לצורך בדיקת ניצול פחמן מיטרוטרופי או הטרוטרופי. בסרטון זה, נשתמש ב-ANOTHE 5 1 1 42 כזן מודל כדי להדגים את השימוש בסובסטראטים של פחמן מסומן לגילוי תפקודים אנזימטיים חדשים.

את הפרוצדורה ידגימו אני, li Yu ו-Chu Yang Fang. התחילו את הפרוצדורה על ידי גידול של חיידקי cyana thesei במצע ללא סימון. כאשר החיידקים מגיעים לשלב צמיחה לוגריתמי בינוני, ניתן חיסון של 3% מהנפח לתוך המצע המסומן ב-carbon 13.

לאחר מכן, כדי למנוע הכנסה של פחמן לא מסומן מהתת-תרבית הראשונית של האינוקולום לאותו מצע מסומן בשלב גידול לוגריתמי בינוני. כאשר חיידקי ה-Cy Thesei המסומנים בפחמן 13 מגיעים לשלב גידול לוגריתמי בינוני, אסוף 10 milliliters באמצעות סנטריפוגה. השהה מחדש את המשקע ב-1.5 milliliters של חומצה כלורידית בריכוז six molar והעבר אותו למבחנה שקופה מזכוכית עם מכסה הברגה עבור כרומטוגרפיה גזית או vials GC.

סגרו את המבחנות בעזרת פקקים והניחו אותן בתנור בטמפרטורה של 100 °C למשך 24 שעות כדי להפיל הידרוליזה של חלבוני הביומסה לחומצות אמינו. הידרוליזה של כדוריות ביומסה מניבה 16 מתוך 20 חומצות האמינו הנפוצות. לאחר ההידרוליזה, העבירו את תמיסת חומצות האמינו למבובות מיקרו-צנטריפוגה בנפח של 2 mL ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-20,000 G למשך חמש דקות. לאחר ההידרוליזה, העבירו את תמיסת חומצות האמינו למבובות מיקרו-צנטריפוגה בנפח של 2 mL ואז סבבו בצנטריפוגה ב-20,000 G למשך חמש דקות כדי להשקיע חלקיקים מוצקים.

לאחר הצנטריפוגה, העבירו את העיליונות לבקבוקוני GC חדשים כדי להסיר חלקיקים מוצקים מתמיסת ההידרוליזה, כך שלא יחדרו לעמודת ה-GC. לאחר מכן, חומצות האמינו עוברות נגזרת כדי להפוך אותן לנשאיות. להפרדה באמצעות כרומטוגרפיה גזית, המיסו את הדגימות המיובשות עם 150 µL של tetrahydrofuran, THF ו-150 µL של N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide.

הדגרימו את כל הדגימות עם Reagent Acetamide, T-B-D-M-S Derivitization בתנור בטמפרטורה של 65 עד 80 °C למשך שעה אחת. ערבבו את הדגימות מדי פעם באמצעות Vortex כדי להבטיח שהמטבוליטים בבקבוק מומסים. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך 10 דקות, ולאחר מכן העבירו את הסופרנאט לבקבוק GC חדשים.

העלומת הנוזל (supernatant) צריכה להיות תמיסה צהובהה וצלולה. טמפרטורות ה-GC הן כדלקמן: השהייה ב-150 °C למשך שתי דקות, ולאחר מכן העלייה בשיעור של 3 °C לדקה עד להגעה ל-280 °C.

העלה את הטמפרטורה ב-20 °C לדקה עד ל-300 °C, ולאחר מכן החזק אותה למשך חמש דקות. עבור עמודת GC באורך 30 מטרים, הגדר את השהיית הממיס (solvent delay) לכ-חמש דקות ואת טווח יחס המסה למטען בין 60 ל-500. נתח את הדגימות באמצעות GCMS תוך שימוש ביחס פיצול (split ratio) של 1:5 או 1:10, נפח הזרקה של 1 µL וגז נשיאה הליום בקצב של 1.2 mL לדקה בהתאם לתוכנית הריצה.

נתחו את נתוני ה-GCMS באמצעות Microsoft Excel. זמן השהייה ב-GC ושיאי יחס המסה למטען הייחודיים לכל חומצת אמינו מוצגים באיור זה. חומצות אמינו נגזרות של T-B-D-M-S מופרדות בדרך כלל בבירור על ידי MS לשני מקטעים טעונים: מקטע M minus 57, המכיל את חומצת האמינו השלמה, ומקטע M minus 1 59, שחסרה בו קבוצת האלפא-קרבוקסיל של חומצת האמינו עבור ליוצין ואיסוליוצין.

השיא M מינוס 57 חפף שיאי מסה אחרים של פרגמנטים. ניתן להשתמש ב-N מינוס 15 כדי לנתח את סימון חומאות האמינו כולו. כמו כן, הקבוצה F 3 0 2 מזוהה לעיתים קרובות ברוב חומצות האמינו, והיא מכילה רק את קבוצת האלפא-קרבוקסיל הראשונה ואת הפחמנים השניים בשלד חומצת האמינו.

עם זאת, מכיוון שלשיא מסה (Ms.Peak) זה יש לעיתים קרובות יחסי רעש לאות גבוהים, F 3 0 2 אינו מומלץ לאנליזה כמותית של שטפי מטבוליים. נגזרת של חומצות אמינו או מטבוליטים מרכזיים מחדירה כמויות משמעותיות של איזוטופים מסומנים באופן טבעי, כולל carbon 13, oxygen 18, silicon 29 ו-silicon 30. ניתן לתקן את רעש המדידה הנובע מאיזוטופים טבעיים בספקטרום או באיזוטופ המסה הגולמי באמצעות תוכנה שפורסמה.

נתוני הסימון האיזוטופי הסופיים מדווחים כחלקי מסה. לדוגמה, M zero, M1, M two, M three, ו-M four, המייצגים מקטעים המכילים מאפס עד ארבעה פחמני carbon 13 המסומנים ב-cyana. זן 5 1 1 2 אינו מכיל את האנזים three anine ammonia lyase, המקטליז את ההמרה של three anine ל-two keto butyrate במסלול הסינתזה הטיפוסי של isle.

לפיכך, כדי לפענח את מסלול ה-isle באורגניזם זה, *Cyana thesei* 5 1 1 42 גודל במצע ASP two עם 54 מילימולר גליצרול ונאלח באמצעות GC-MS כפי שמתואר בסרטון זה וכפי שמוצג כאן. *Cyana thesei* 5 1 1 4 2 משתמש בגליצרול המסומן בעמדה השנייה כמקור הפחמן העיקרי, והבחנו כי לתריונין ולאלנין, שהקדמון שלהם הוא פירובט, יש פחמן מסומן אחד, בעוד שאיסולוצין סומן בשלושה פחמנים. לפיכך, הסינתזה ב-*Cyana thesei* 5 1 1 4 2 אינה יכולה להיגזר ממסלול התריונין המשמש את מרבית האורגניזמים. מאידך, ללוצין ולאיסולוצין יש דפוסי סימון זהים בהתבסס על הפרגמנט M מינוס 15 והפרגמנט M מינוס 159.

לדוגמה, האיזוטופ או הנתונים מ-N מינוס 15 המכילים חומצות אמינו שאינן מפוצלות הראו סימון זהה עבור לואיזין ואיסולואיזין. לפיכך, לואיזין ואיסולואיזין חייבים להיות מסונתזים מאותם קדמונים, פירובט ואצטיל-CoA. תצפית זו עקבית עם מעבר הפחמן המסומן במסלול הציטרה-מלאט עבור סינתזת איסולואיזין.

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את חילוף החומרים של מגוון רחב של מיקרובים, ולאחר שליטה בביצועיה, ניתן להשלים אותה מההתחלה ועד לסיום בתוך כשבוע.