Name: יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: למד כיצד לכמת פעילות דה-מתילאז ליזין באמצעות שיטת MassSQUIRM עם ספקטרומטריית מס MALDI ומתילציה איזוטופית. שיטה זו משפרת את הדיוק במדידת שינויים במתילציה ליזין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים UAMS Proteomics מתקן לתמיכה ספקטרומטריה. המימון לפרויקט זה סופק על ידי NIH מענקים P20RR015569, P20RR016460 ו R01DA025755.

פרוטוקול זה הוא שונה מן בלייר ואחרים. 6. 1. LSD1 demethylation Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרך האחרון של μL 20, לשלב 125 LSD1 רקומביננטי ng עם 0.25 di-methyl מיקרוגרם היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין) במאגר demethylase (50 מ&quot;מ טריס-Cl-pH 8.5, 50 מ&quot;מ KCl, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 5% גליצרול). בנוסף, לבצע בקרת לבד הפפטיד עם האנזים לא. השליטה היא על סעיף 3 ואין צורך מתילציה רדוקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף את הפפטידים, להוסיף 8 פורוס μL 20 R2 חרוזים מיקרון למדגם כל להתסיס במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להכין חרוזים פורוס על ידי השעיית 1 נפח של חרוזים עם נפח של 1 מתנול, ולאחר מכן להוסיף 10 כרכים של חומצה פורמית 5% / 0.2% TFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצב 2 ג 18 ZipTips ידי aspirating 20 μL של TFA 0.1% אל קצה ודוחף אותו חזרה עם pipettor. לעשות את זה פעמיים עם T 0.1%FA, ארבע פעמים עם אצטוניטריל 70% / TFA 0.1% ו ארבע פעמים שוב עם TFA 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען שתי דוגמאות (מלאה התגובה demethylase) על ה-C 18 ZipTips מותנה pipetting slurry חרוז מאחורי שרף C 18 ב ZipTips ודוחף את עוצמת הקול דרך עם pipettor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ZipTips פעמיים עם 20 μL של TFA 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute ב μL 40 אצטוניטריל של 70% / 0.1% TFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize כל eluant לחלוטין עם concentrator SpeedVac. </li></ol> 2. רדוקטיבי מתילציה חלק זה של הפרוטוקול הוא שונה מן בלייר et al. ו Rayment et al. 6,7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב להשעות את התגובה demethylase ב μL 100 של המאגר 50 מ&quot;מ פוספט, pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתגובה demethylase, להוסיף 8 μL של 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​borane dimethylamine. Borane dimethylamine הוא מומס חיץ 50 מ&quot;מ פוספט, pH 7.4, לתת 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון המניות.זה צריך להיות טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתגובה demethylase, להוסיף 16 μL של פורמלדהיד 250 מ&quot;מ deuterated. פורמלדהיד deuterated 250 mm הוא הוכן על ידי דילול מניות של H 2 0. זה צריך להיות טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2, 2.3 &amp; 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות ~~~HEAD=NNS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם demethylase, להוסיף 12.5 μL של 1M טריס, pH 7.4 כדי להרוות את התגובה מתילציה רדוקטיבי. </li></ol> 3. MALDI המוניים ספקטרומטריית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פורוס R2 20 חרוזים מיקרון לתגובה demethylase, ולאסוף על ZipTips כמתואר צעדים 1.3-1.6. </li></ol> הערה: Re-להשעות את השליטה μL 100 מתוך חוצץ 50 מ&quot;מ פוספט, pH 7.4 ולטפל כמו המדגם השני החל שלב 3.1. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute מלאה דוגמאות התגובה demethylase מ ZipTips את לצלחת מדגם MALDI באמצעות 2 μL של 33% להרוות2,5-D dihydroxybenzoic חומצה. להכין 33% חומצה 2,5-dihydroxybenzoic, להפוך את פתרון רווי של חומצה 2,5-dihydroxybenzoic ב אצטוניטריל 70% / 0.1% TFA ואז לדלל 33% רווי אצטוניטריל 70% / 0.1% TFA. אפשר דגימות eluted לייבוש להתגבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ספקטרום באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-prOTOF PerkinElmerSciex המונית או זמינים ברזולוציה גבוהה MALDI ספקטרומטר מסה 8,9,10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את ספקטרום ולחלץ האזורים השיא PerkinElmerSciex באמצעות תוכנת TOFworks או תוכנה המסופקים על ידי היצרן ספקטרומטר מסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת את תוצרי התגובה של 2 MS עם מערכת המונית זמין spectrometric מתן יכולות טנדם המוניים spectrometric. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לפצות על חפיפה איזוטופים שנוצרו באמצעות פורמלדהיד כבד (איור 1 ב), לקבוע את אזור השיא (א) יחס של 13 C 2 ו - 13 C 4 איזוטופים relativדואר לשיא monoisotopic למדגם שליטה, שלא עבר מתילציה רדוקטיבי (איור 2 א). EQ 1: 13C2 / 12C = R 1 EQ 2: 13C4 / 12C = R 2 זה ייתן לך את היחס של פפטיד הקיים במדינות אלו איזוטופי (R &amp; R 1 2) ספציפית להתנסות שלך ספקטרומטר מסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש R &amp; R 1 2 ערכים הנוסחאות הבאות לכימות הסכום היחסי של הפפטיד הקיימים במצב כל שינוי במדגם התגובה demethylase (איור 2 ב): EQ 3: H3K4me2 = 1 EQ 4: H3K4me = 2 - R 1 (1) EQ 5: H3K4 = 3 - R 2 (1) - [R 1 (2 - R 1 (1))] </li></ol> 5. נציג תוצאות שימוש LSD1, אנו מראים את היעילות של MassSQUIRM לכימותליזין demethylation. כפי שתואר בסעיף טקסט פרוטוקול, ביצענו assay demethylase עם ng 125 של LSD1 ו 0.25 di-methyl מיקרוגרם היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין). שליטה ודוגמאות התגובה demethylase היו נתונים מתילציה רדוקטיבי ו ספקטרומטריית MALDI המונית. תגובת פקד לא עבר מתילציה רדוקטיבי הראה את המעטפה איזוטופי אופייני פפטיד זה ובתנאי אזורים השיא של משוואות 1 ו -2 (איור 2 א). הספקטרום המונית לתגובה demethylase בתנאי באזורים שיא עבור משוואות 3-5 (איור 2 ב). שימוש באזורים שיא השליטה והתגובה demethylase, קבענו כי LSD1 demethylated פפטיד לתת את תוצרי התגובה הבאים: 33.7% di-methyl Lys4, 42.3% מונו מתיל Lys4, ו -24% בלתי מפוגל ליס 4. עיין בלייר ואחרים. ניתוח מלא של הפעילות LSD1 demethylase כמו גם מחקרים מעכב 6. שים לב משתנים משתנים כגון אנזימים, זמן תגובהריכוז ריכוז המצע תאפשר ניתוח מעמיק של פעילות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה MassSQUIRM. (א) פפטיד N-מסוף מ היסטון H3 מוצג בתור בלתי (ירוק), מונו (אדום), או di-(כחול) מפוגל על ​​ליזין 4. וריאציה בהרכב הכימי של הפפטיד כל מוביל יינון ההפרש ביצוע מורכבת כימות. (ב) מתילציה Reductive ממיר את כל שאריות ליזין למצב di-methyl הגורמת פפטידים כדי ליינן את כל דומה. השימוש פורמלדהיד כבד בתגובה מתילציה רדוקטיבי מאפשר שימור הזהות של מתילציה המקורי. חוגים פתוחים מצביעים מתילציה אור בעוד בחוגים סגורים עולה מתילציה כבדה. השתנה מן בלייר et al. 2011 6. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> Figur2 ה. MassSQUIRM ניתן לכמת פפטידים מפוגל דיפרנציאלי. (א) DI-מפוגל סינתטי היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין) נותח באמצעות ספקטרומטר מסה יחסי שיא ביחס לשיא monoisotopic היו כאמור R 1 ו R 2 במשוואות 1 ו -2. (ב) פפטיד סינטטי באותו הודגר עם 125 LSD1 נג ב חיץ demethylase עבור שעתיים על 37 ° C. דוגמאות היו נתונים אז MassSQUIRM ניתוח. אוכלוסייה מעורבת של פסגות חופפים מייצג שלושה מצבי מתילציה שונים כפי שניתן לראות באיור 1 ב. באזורים שתחת פסגות monoisotopic היו כאמור 1, 2, ו 3. אזורי שיא שימשו משוואות 3-5. חוגים פתוחים מצביעים מתילציה אור בעוד בחוגים סגורים עולה מתילציה כבדה. השתנה מן בלייר ואחרים. 2011 6.

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1%3A+a+molecular+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li>
<li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li>
<li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li>
<li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

MassSQUIRM היא שיטה זולה כמותית לניתוח מקיף של פעילותו של demethylases ליזין המעורבים מונו ו מתילציה-di. MassSQUIRM מציע quantitation לא רק של המוצר התגובה אלא גם את התשומות. Assay זה יכול לשמש ככלי רב עוצמה בחקר מנגנון demethylases היסטון LSD1 אחרים. זה יהיה גם שימושי לסיווג אנזימים רבים שהתגלו לאחרונה demethylase ליזין כגון PHF8 ויכול לשמש methyltransferase אנזימים מסוימים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-ביוטין פפטיד </td><td> מוכן בתוך הבית </td><td> אף אחד </td></tr><tr><td> פורוס R2 20 חרוזים מיקרון </td><td> יישומי Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic חומצה (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> אצטוניטריל </td><td> דיג </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-dihydroxybenzoic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borane dimethylamine </td><td> סיגמא </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> כבד isotopically ד 2-פורמלדהיד </td><td> קיימברידג&#39; איזוטופ מעבדות </tד&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> טריס </td><td> דיג </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> דיג </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> דיג </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> G33 </td></tr><tr><td> חומצה פורמית </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> דיג </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-phosphate </td><td> דיג </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac מרוכז </td><td> מלומד </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF ספקטרומטר מסה ו TOFworks תוכנה </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> אף אחד </td></tr></tbody></table>

יישום masssquirm עבור מדידות כמותיות של פעילות demethylase ליזין

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

לאחרונה, הרגולטורים אפיגנטים המשנים התגלו כשחקנים מרכזיים מחלות רבות ושונות 1-3. כתוצאה מכך, אנזימים אלה הם מטרות הממשלה ללימודי מולקולה קטנה ועל פיתוח 4 תרופות. הרגולטורים אפיגנטים המשנים רבים יש רק לאחרונה התגלה, והם עדיין בתהליך של להיות מסווג. בין אנזימים אלה הם demethylases ליזין אשר הסרת קבוצות מתיל מ lysines על ההיסטונים וחלבונים אחרים. בשל אופיו של הרומן המעמד הזה של אנזימים, מבחני כמה פותחו כדי ללמוד על פעילותם. זה היה מחסום הסיווג והן במחקר קצב העברת נתונים גבוה של demethylases היסטון. נכון לעכשיו, מבחני demethylase מעט מאוד קיים. אלה אכן קיימים נוטים להיות איכותית בטבע ולא ניתן להבחין בו זמנית בין מדינות שונות מתילציה ליזין (האו&quot;ם, מונו, די ו-Tri-). ספקטרומטריית מסה משמש בדרך כלל כדי לקבוע פעילות demethylase אבל הנוכחי מבחני ספקטרומטריה לעשותלא לענות אם פפטידים מפוגל דיפרנציאלי ליינן אחרת. יינון ההפרש של פפטידים מפוגל עושה השוואה בין מדינות מתילציה קשה ובוודאי לא כמותית (איור 1 א). לכן מבחני כניסה אינן מותאמות ניתוח מקיף של פעילות demethylase. כאן אנו מתארים שיטה הנקראת MassSQUIRM (quantitation ספקטרומטריה באמצעות מתילציה רדוקטיבי איזוטופי) המבוסס על מתילציה רדוקטיבי של קבוצות האמין עם פורמלדהיד deuterated לכפות lysines כל להיות DI-מפוגל, ולכן מה שהופך אותם למעשה המין כימי ולכן ליינן אותו (1B איור). ההבדל הכימי רק לאחר מתילציה רדוקטיבי הוא מימן דאוטריום, אשר אינו משפיע על יעילות MALDI יינון. Assay MassSQUIRM הוא ספציפי עבור תוצרי התגובה demethylase עם lysines האו&quot;ם, מונו או di-מפוגל. Assay גם לגבי methyltransferases ליזין נותן SAלי תוצרי התגובה. כאן, אנו משתמשים בשילוב של כימיה מתילציה רדוקטיבי ו ספקטרומטריית MALDI המונית כדי למדוד את הפעילות של LSD1, demethylase ליזין מסוגלת להסיר DI-וחד-methyl קבוצות, על מצע פפטיד סינתטי 5. Assay זה פשוט נוח בקלות למעבדה כל גישה ספקטרומטר מסה MALDI במעבדה או באמצעות מתקן proteomics. Assay יש ~ 8 פי טווח דינמי והוא ניתן להרחבה בקלות לעצב צלחת 5.

אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

לאחרונה התגלה כי רגולטורים אפיגנטיים הם שחקני מפתח במחלות שונות רבות 1-3. כתוצאה מכך, אנזימים אלו מהווים מטרות מרכזיות למולקולות קטנות...

פרוטוקול ה-mass squirm נועד לכמת את הפעילות של ליזין-דמתילאז באמצעות מתילציה איזוטופית ומספקטרומטריית מסות MALDI. ראשית, בצע תגובות דמתילציה המזורזות על ידי אנזים על פפטידים המכילים שאריות ליזין מתילאטיות. לאחר מכן, בצע מתילציה כימית של תוצרי הפפטידים מתגובת הדמתילאז באמצעות פורמלדהיד דאוטרי, כדי להפיק פפטידים מתילאטיים באופן אחיד המיוננים באותה צורה על ידי MALDI. המשך לכימות של כל מין פפטיד באמצעות מספקטרומטריית מסות MALDI תוך התחשבות בחפיפה איזוטופית. כדי לזהות כמויות יחסיות של פפטידים לא-מתילאטיים, מונו-מתילאטיים, די-מתילאטיים וטרי-מתילאטיים, תוצאות ה-mass squirm קובעות את הכמויות היחסיות של כל תוצר של תגובת הדמתילאז על בסיס שינויים במסה.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספקטרומטריית מסות שגרתית, הוא שציון המסות (mass score) לוקח בחשבון הבדלים ביוןזציה בין פפטידים עם רמות מתילציה שונות. הרעיון לגישה זו עלה לראשונה כאשר פיתחנו שיטה למדידת רמות אצטילציה של היסטונים באמצעות אנהידריד אצטי כבד איזוטופית. האתגר בטכניקה זו הוא הפקת נתוני שטח שיא, שעלולה להיות מורכבת בשל חפיפה של מעטפות איזוטופיות של פפטידים.עבור תגובת הדמתילאז, ערבבו 125 nanograms של אנזים recombinant lysine specific demethylase one עם 0.25 micrograms של פפטיד biotinylated dimethyl hisone H three בנפח סופי של 20 microliters של באפר דמתילאז. הכינו בנוסף דגימת ביקורת המכילה 0.25 micrograms פפטיד ללא האנזים LSD one. דגרו את מבחנות התגובה והביקורת למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C. כדי להכין את חרוזי R2 בעאיון של 20 micron, ערבבו נפחים שווים של חרוזים ומתנול.לאחר מכן, הוסיפו 10 נפחים של TFA formic acid, הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של חרוזי נקבוביות (porous beads) לכל דגימה וערבבו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. במקביל, הכינו שני C 18 zip tips. בצעו פיפטינג פעמיים עם 20 µL של 0.1%TFA, ארבע פעמים עם 70% aceto nitrile 0.1%TFA, וארבע פעמים נוספות עם 0.1%TFA.לאחר מכן, טענו את שתי הדגימות אל ה-zip tips שעברו התנייה. בעזרת פיפט, דחפו את הנפח דרך שרף ה-C 18. חזרו על הפעולה עד שכל הנפח של שתי הדגימות נדחף דרך ה-zip tips.לאחר מכן, שטפו את ה-zip tips פעמיים עם 20 µL של 0.1% TFA, ואלוטו את הדגימות לתוך 40 µL של elution buffer. המשיכו לייבש את ה-eent לחלוטין באמצעות speed vac concentrator. ראשית, השביו את הדגימה ב-100 µL של 50 mM phosphate buffer pH 7.4. לאחר מכן, הוסיפו 8 µL של bore dimethyl amine ו-16 µL של derated formaldehyde.דגרו בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים. חזרו על תהליך המתילציה הרדוקטיבית על ידי הוספה של dimethyl amine ו-formaldehyde דויטרי, ודגרו למשך שעתיים. בפעם השלישית, הוסיפו dimethyl amine ודגרו בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 שעות.עצרו את התגובה באמצעות 12.5 µL של Tris בריכוז 1 M, pH 7.4. ייבשו את הדגימות לחלוטין באמצעות SpeedVac. לאחר מכן, השביו את דגימות הביקורת ואת דגימות ה-demethylase ב-100 µL של phosphate buffer בריכוז 50 mM, pH 7.4.כעת הוסיפו שמונה µL של חרוזי נקבוביות לדגימות הביקורת ולדגימות התגובה עם הדמתיליז, ואספו אותן באמצעות zip tips כפי שהודגם קודם לכן. בצעו אלוציה בנפחים של שני µL על גבי פלטת דגימות MALDI והניחו להן להתייבש בטמפרטורת החדר עד להיווצרות גבישים. המשיכו לניתוח הדגימות באמצעות ספקטרומטריית מסות.פתח את קובצי הספקטרומטריה בתוכנת העבודה וייצא אותם לתוכנת M over Z. לאחר מכן, אמת את תוצרי התגובה באמצעות ספקטרומטריית מסות בטנדם. ראשית, קבע את יחס שטח הפסגה של איזוטופי carbon 13 C two ו-carbon 13 C four ביחס לפסגה המוני-איזוטופית עבור דגימת הביקורת.השתמשו ביחסים מחושבים אלו כדי לכמת את הכמות היחסית של הפפטיד בכל מודיפיקציה. מצב דגימת תגובת הדמתילאז. ניתן להשתמש ביעילות באנזים LSD אחד לכימות המסה של דמתיליזציה של ליזין.מכיוון שתגובת הביקורת אינה עוברת מתילציה רדוקטיבית, היא מעידה על המעטפה האיזוטופית הטיפוסית עבור פפטיד זה. שטחי הפסגות המתקבלים קובעים את יחסי הרקע של הפפטיד הקיים ב-carbon 13 C two וב-carbon 13 C four. מצבים איזוטופיים, שטחי פסגות מספקטרום המסות עבור תגובת הביקורת, מאפשרים כימות של הכמות היחסית של הפפטיד הקיים בכל מצב מודיפיקציה. בתגובת הדמתילאז, שטחי הפסגות מתגובות ביקורת ותגובות דמתילאז אלו קובעים 33.7%dimethyl lysine 4 42 0.3%monomethyl lysine four ו-24%unmethylated lysine four.גישה זו של ספקטרומטריית מסות רחבה (mass squam) מספקת תובנות מרכזיות בתחום האפיגנטיקה של ההיסטונים, כגון האופן שבו דמתילציה של שאריות ליזין בהיסטונים תורמת למחלות שונות. בעוד שבדיקת מתילציה זו יושמה למחקר של דמתילאזים, ניתן להשתמש בה גם למחקר של מתיל-טרנספראזים.

application-masssquirm-for-quantitative-measurements-lysine

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הפעילות של decarboxylase ועין מתנהלת ליזין מנוטר על ידי מגיבים המצע L-ליזין לבין המוצר קדברין עם חומצה 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-לטופס adducts כי יש מסיסות ההפרש ב טולואן.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

מתוארות שתי שיטות להקצאת אותות התהודה המגנטית הגרעינית של α ו-ε-dimethylamine של ליזין N-terminal 13C-methylated. שיטה אחת משתמשת בסלקטיביות הנגרמת על ידי pH של תגובת המתילציה הרדוקטיבית, והשנייה משתמשת באמינופפטידאז כדי להסיר באופן סלקטיבי את הליזין הטרמינלי N.

שיטות לזיהוי תהודת ה-NMR של 13C-dimethyl N-terminal אמין על חלבונים שעברו מתילציה רדוקטיבית

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

ניתן להשתמש במערכי פפטידים המסונתזים בשיטת SPOT כדי לנתח את ספציפיות הסובסטרט של חלבון ליזין מתילטרנספראזות (PKMTs) ולהגדיר את ספקטרום הסובסטרט של PKMTs כדי להבין את תפקידם הביולוגי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לסנתז מערכי פפטידים, לבצע מתילציה שלהם עם PKMTs ולנתח את התוצאות.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

מוצג פרוטוקול לסינתזה של פפטואידים בעלי פונקציונליות קטיונית מעורבת באותו רצף (מונומרים מסוג ליזין וארגינין). מתוארת גם בדיקה עוקבת של תרכובות אלה נגד Leishmania mexicana, הטפילים הפרוטוזואיים הגורמים ללישמניאזיס עורית.

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

כאן, אנו מציגים כימות לא משוחדת של חלבון ספציפי לאתר acetylation ו/או succinylation תפוסה (סטויכיומטריה) של פרוטאום כולו באמצעות ניתוח רציומטרי של שינויים אנדוגני שינויים שהוכנסו לאחר כמותיים acylation כימי באמצעות anhydrides התווית על-ידי איזוטופ יציב. בשילוב עם ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים רגישים, מתקבלים באתר מדויק תפוסת מדידות.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד KDM1A מטרת האירוסין בתוך תא אנושי או בעלי חיים, רקמות או דגימות דם שטופלו עם KDM1A מעכבי. הפרוטוקול משתמש תיוג כימית של האנזים KDM1A חינם וקוונפיקציה ישירה של הכיבוש היעד באמצעות החיסונית מבוססי כימופי מבוסס והוא יכול לשמש במחקרים פרה-קליניים וקליניים.

מדידה ישירה של התחייבות KDM1A יעד באמצעות החיסונית מבוססי כימוציל

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

מחקר זה קבע שיטה המשתמשת בהרחבת הקוד הגנטי כדי לשלב בהצלחה את לקטיל-ליזין (Klac) באתרים ספציפיים של האנולאז-1 (hENO1) והסופרפולקציה GFP (sfGFP) באשריכיה קולי ותאי יונקים.

לקטילציה ליזין ספציפית לאתר באמצעות התרחבות קוד גנטי ב-E. coli ובתאים יונקים

למד כיצד לכמת פעילות דה-מתילאז ליזין באמצעות שיטת MassSQUIRM עם ספקטרומטריית מס MALDI ומתילציה איזוטופית. שיטה זו משפרת את הדיוק במדידת שינויים במתילציה ליזין.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

גלה סרטונים נוספים