יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

פרוטוקול Mass Squirm נועד לכמת את פעילות הליזין דמתילאז באמצעות מתילציה איזוטופית וספקטרומטריית מסה מאלדי לבצע תחילה תגובות דה-מתילציה מזורזות של אנזימים על פפטידים המכילים ליזין שעבר מתילציה. לאחר מכן, שאריות מתילציה כימית של תוצרי הפפטיד של תגובת הדמתילאז עם פורמלדהיד דוטראט כדי לייצר פפטידים מתילציה אחידה המייננים באותו אופן על ידי מאלדי ממשיכים לכמת כל מין פפטיד עם ספקטרומטריה מרובה למסה ולהסביר חפיפה איזוטופית. על מנת לזהות כמויות יחסיות של פפטידים שעברו מתילציה של un mono dye ו-trimm, תוצאות ה-Mass Squirm קובעות כמויות יחסיות של כל תוצר תגובת דמתילאז על סמך שינויים במסה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ספקטרומטריית מסה עובש שגרתית הוא שציון המסה מסביר את ההבדלים ביינון בין פפטידים שעברו מתילציה שונה. הרעיון לגישה זו עלה לנו לראשונה כאשר פיתחנו שיטה למדידת רמות אצטילציה של היסטון באמצעות אנהידריד אצטי כבד איזוטופי. האתגר בטכניקה זו הוא חילוץ נתוני שטח שיא, שיכולים להיות מסובכים על ידי חפיפה של מעטפות איזוטופיות פפטיד.

עבור תגובת הדמתילאז שילבה 125 ננוגרם של דמתילאז ספציפי ליזין רקומביננטי אנזים אחד עם 0.25 מיקרוגרם של ביוטיניל דימתיל היסון H שלושה פפטידים בנפח סופי של 20 מיקרוליטר דמתילאז מאגר. כמו כן, הכינו דגימת ביקורת המכילה 0.25 מיקרוגרם פפטיד ללא ה-LSD, אנזים אחד דגרו על צינורות התגובה והבקרה למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הכנת R שני חרוזים נקבוביים של 20 מיקרון מערבבים נפחים שווים של חרוזים ומתנול.

לאחר מכן מוסיפים 10 נפחים של חומצה פורמית TFA, מוסיפים שמונה מיקרוליטרים של חרוזים נקבוביים לכל דגימה ומערבבים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, מצבו שני קצות רוכסן C 18. פיפטינג פעמיים עם 20 מיקרוליטר של 0.1% TFA ארבע פעמים עם 70% אצטו ניטריל 0.1% TFA, וארבע פעמים שוב עם 0.1% TFA.

לאחר מכן, טען את שתי הדגימות על קצות הרוכסן הממוזגים. בעזרת צינור, דחף את הנפח דרך שרף C 18. חזור על הפעולה עד שהנפח הכולל של שתי הדגימות נדחף דרך קצות הרוכסן.

לאחר מכן שטפו את קצות הרוכסן פעמיים עם 20 מיקרוליטר של 0.1% TFA דגימות אלוט במאגר אשליות של 40 מיקרוליטר המשיכו להתייבש לחלוטין עם רכז ואקום מהירות. ראשית השעו מחדש את הדגימה ב-100 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי מאגר פוספט pH 7.4. לאחר מכן מוסיפים שמונה מיקרוליטר של דימתיל אמין קדח ו -16 מיקרוליטר פורמלדהיד מופחת.

דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. חזור על המתילציה הרדוקטיבית על ידי הוספת דימתיל לאמין משעמם ופורמלדהיד דוטראט ודגירה למשך שעתיים. בפעם השלישית, מוסיפים דימתיל לאמין משעמם ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 שעות.

להרוות את התגובה עם 12.5 מיקרוליטר של טריס טוחנת אחת. pH 7.4 ממשיך לייבוש מלא עם רכז ואקום מהיר. ראשית Resus, השעו את דגימות הבקרה ותגובת הדמתילאז ב-100 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי מאגר פוספט pH 7.4.

כעת הוסף שמונה חרוזים נקבוביים של מיקרוליטר לדגימות התגובה של הבקרה והדמתילאז ואסוף על קצות הרוכסן כפי שהוצג קודם לכן. התחמק בשני נפחי מיקרוליטר על צלחת דגימה של MALDI ואפשר להתייבש בטמפרטורת החדר עד להתגבשות. המשך לנתח דגימות לפי ספקטרומטריית מסה.

פתח את קבצי הספקטרו לתוכנת עבודה וייצא לתוכנת M over Z. אמת עוד יותר את תוצרי התגובה על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם. ראשית, קבע את יחס שטח השיא של איזוטופים של פחמן 13 C שניים ופחמן 13 C ארבעה ביחס לשיא האיזוטופי המונו עבור דגימת הבקרה.

השתמש ביחסים מחושבים אלה כדי לכמת את הכמות היחסית של פפטיד הקיים בכל שינוי. מצב דגימת תגובת הדמתילאז. ניתן להשתמש באנזים LSD אחד ביעילות בכימות המוני של דה-מתילציה של ליזין.

מכיוון שתגובת הבקרה אינה עוברת מתילציה רדוקטיבית, היא מציינת את המעטפת האיזוטופית האופיינית לפפטיד זה אזורי שיא המתקבלים קובעים את יחסי הרקע של הפפטיד הקיים בפחמן 13 C שתיים ופחמן 13 C ארבע. מצבים איזוטופיים, אזורי שיא מספקטרום המסה לתגובת הבקרה מאפשרים לכמת את הכמות היחסית של פפטיד הקיים בכל מצב שינוי. בתגובת הדמתילאז, אזורי השיא מתגובות בקרה ודמתילאז אלה קובעים 33.7% דימתיל ליזין 4 42 0.3% מונומתיל ליזין ארבע ו-24% ליזין ללא מתילציה ארבע.

גישת סקוואם מסה זו מציעה תובנות מפתח בתחום האפיגנטיקה של היסטון, כגון כיצד דה-מתילציה של שאריות ליזין היסטון תורמת למחלות שונות. בעוד שבדיקת מתילציה זו יושמה לחקר דמתילאזות, ניתן להשתמש בה גם לחקר מתיל טרנספראזות.