שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:
18 במאי 2012
לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות הקשורות לשעבר vivo Electroporation של פלסמידים שיתוף להביע RNA מעכבות (RNAi) ו-GFP בקליפת המוח העוברי murine. פרוטוקול זה הוא מקובל בחקר היבטים שונים של neurodevelopment כגון neurogenesis, העברה עצבית ו המורפוגנזה העצבית כולל דנדריט ו תוצאה האקסון.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע הערכה מהירה של תפקוד גנים בפיתוח קליפת המוח (cerebral cortex) באמצעות פרוסות אורגנוטיפיות. דבר זה מושג על ידי הכנסת פלסמידים המבטאים RNA מעכב ומסמן GFP אל קליפת המוח של עכבר. מופעלים פולסים חשמליים קצרים על המוח, המאפשרים ל-DNA הפלסמידי לבצע טרנספקציה לתאי הפרוגניטור הנוירונליים.
בשלב הבא, המוחות מבודדים, מוטמעים ונחתכים כדי להפיק פרוסות אורגנוטיפיות שיכולות לעבור מורפוגנזה נוירונלית ex vivo. ניתן לסרוק את הפרוסות האורגנוטיפיות כדי לאתר תתי-אוכלוסיות של נוירונים קורטיקליים עם פגמים נדידיים או מורפולוגיים על ידי תצפית ישירה בתאים המסומנים ב-GFP. שלום, ברוכים הבאים למעבדה שלי באוניברסיטת בראון במחלקה לביולוגיה מולקולרית. היום, ד"ר ליזה ושני סטודנטים, קט זר ומארק סבה, ידגימו את טכניקת האלקטרופורציה ex vivo ואת תרבית הפרוסות האורגנוטיפיות, שהיא טכניקה שימושית מאוד למחקרי התפתחות עצבית.
שיטה זו יכולה לסייע במענה לשאלות מפתח בהיבטים שונים של התפתחות נוירולוגית, כולל נוירוגנזה, נדידה נוירונלית ומורפוגנזה נוירונלית. מכיוון שניתוח זה מבוצע בסביבה המדמה מקרוב את סביבת ה-IBU, הוא מהווה חלופה זולה ומהירה ליצירת בעלי חיים טרנסגניים או בעלי נוק-אאוט עבור גנים שתפקידם אינו ידוע. לבסוף, בהשוואה לטכנולוגיית אלקטרופורציה in vivo, הצלחת ניסויי אלקטרופורציה אלו אינה תלויה בניתוחים מיומנים או בפיתוח מיומנויות מורכבות, וניתן לבצע אותם בזמן הדרכה קצר יותר ובדרגת מיומנות נמוכה יותר.
לאחר ביצוע הרדמה והריגה של עכברה נקבה הרייה, הוצא את העוברים באמצעות דיסקציה אל תוך תמיסת HBSS מלאה וקרה (בקרח), תוך שמירה עליהם בתוך שקיות השליה האינדיבידואליות שלהם. לאחר מכן, בתוך תמיסת ה-HBSS הקרה, שחרר עובר מהשקית וגזור את ראשו לאחר החוליה הראשונה לצורך הזרקה; הנח את הראש על פיסת נייר פראפורם מעל צלחת פטרי תוך שימוש במזרק Hamilton בהתאמה אישית. הזרק 6 עד 8 µL של תערובת DNA fast green דרך החדר השלישי.
משם, התערובת תמלא את שני החדרים הצדיים בבועות הקורטקליות (cortical vesicles). לצורך אלקטרופורציה, נעשה שימוש באלקטרודות פלטינה מסוג BTX tweezer. מקמו את האלקטרודה החיובית לכיוון צד הקורטקס שבו תבוצע האלקטרופורציה.
לדוגמה, עבור קליפת המוח הגבית (dorsal cortex), יש להניח את האלקטרודה בחלקו העליון של הראש. כדי להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה, יש תמיד לכוון את ריכוז ה-DNA ל-1 µg/µL ולהשתמש ב-DNA שהבודד בשיטת Maxi prep. במידת הצורך, השתמשו בערכה נטולת אנדוטוקסינים (endotoxin free kit) לניקוי ה-DNA לאחר האלקטרופורציה.
יש להקפיא את הראש על קרח למשך חמש דקות לפחות לפני הניתוח. חשוב מאוד להשתמש בכמות הנכונה של פולסים וזרם חשמלי בעת ביצוע האלקטרופורציה כדי למנוע נזק למוחות עובריים צעירים. לאחר האלקטרופורציה, הרקמה הופכת שבירה מאוד.
חשוב לבצע את הנתיחות בזהירות רבה, כיוון שהעור והגולגולת עלולים למשוך את קרומי המוח של השקיקים הקורטיקליים, דבר שעלול לפגוע בשקיקים אלה בעת הוצאתם מהגולגולת. לאחר חמש דקות, הוצא את המוח בתוך HBSS קר, החל מביצוע חתך קטן בצידו של הראש וקילוף העור מצדי הראש.
בשלב הבא, בעזרת פינצטה עדינה, קלפו בעדינות את ה-pia מהמוח. הוציאו את המוח השלם מהגולגולת. בסיום, השאירו את המוח ב-HBSS קר בקרח והכינו את הרקמה להטמעה.
התחילו למלא את התבניות ב-3% low melting point Agros. הניחו את התבניות על קרח כדי שה-agros יתגבש קרוב לתחתית התבנית. ראשית, ודאו שהמוחות נשארים נתמכים וממורכזים.
כעת, בעזרת פינצטה עדינה, הוציאו בעדינות מוח מתוך ה-HBSS, ספגו עודפי בופר בעזרת נייר סופג (kim wipe) או נייר סינון, והניחו את המוח בתוך ה-low melting point Agros. לאחר מכן, השתמשו בקצה של טיפ פפיטה כדי לסובב את המוח בתוך התבנית במטרה למקסם את המגע בין ה-agros לרקמה. לאחר העברת כל המוחות, מקמו כל מוח באותו כיוון ועומק בקירוב בתוך התבנית שלו.
ה-aros יתמצקו תוך כחמש דקות. לכן, עבדו במהירות. אפשרו ל-aros להתמצק לחלוטין על ידי אינקובציה של חמש דקות נוספות על קרח.
יש לחתוך את שאריות ה-aros לפני קיבוע הבלוקים. לאחר מכן, הצמידו את בלוקי ה-agros זה לזה באמצעות דבק פלסטי בעל קיבוע מהיר, כאשר כל מוח בערימה צריך להיות ממוצב כך שהבצביבים הריחניים (olfactory bulbs) פונים כלפי מעלה. לאחר הצמדת הבלוקים, גזמו את ה-aros כדי להבטיח שכל מוח ייחתך על ידי ה-vibrato.
לאחר מכן, טבול אותם מיד ב-HBSS קר מאוד. כדי לחתוך את הבלוקים, הגדר את מהירות הויברטום למהירות נמוכה, כחצי מהמהירות המקסימלית, והגדר את תדר רעידת הלהב להגדרה הגבוהה ביותר. לאחר מכן, הכן פרוסות קורונליות בעובי של 250 micron, השג את הפרוסות באמצעות שפכטל דק ועקום, והעבר אותן לבארות רקמה בעזרת מברשת עדינה או פינצטה.
אם הרקמה נופלת מה-agros, המשמעות היא שהמגע בין הרקמה ל-agros לא נוצר באופן מספיק בתוך מנדף לתרביות רקמה; במקרה זה, הכינו פלטת 6 בארות עם 1.8 milliliters של מצע לתרבית פרוסות בכל בארה, והניחו בכל אחת מהן תבניות organotypic inserts מצופות laminin ו-polylysine. הוסיפו 500 microliters של מצע לתרבית פרוסות לחלק העליון של תבניות ה-organotypic slice inserts. לאחר מכן, העבירו עד חמש פרוסות לכל תבנית.
בשלב הבא, הסירו עודפי מצע מהחלק העליון של הפרוסות כדי להבטיח שהפרוסות ישמרו על המורפולוגיה שלהן ככל האפשר ויהיה בהן מינימום מוות של תאים. חשוב לשמור על ממשק נוזל-אוויר תקין ולוודא שהפרוסות אינן צפות במצע. לבסוף, דגרו את הפרוסות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח.
יש להחליף מחצית מנפח המצע תחת הממברנה בכל יום שני. הפרוסות לא צריכות לצוף על המצע. ניתן להבחין בנוירונים המבטאים את המבנים שעברו אלקטרופורציה כבר שמונה שעות לאחר האלקטרופורציה. לאחר מספר ימי התרבית הרצויים, יש לקבע את הפרוסות בממברנה לצורך אנליזה.
שטפו כל השתלה טיפיקית אורגנית ב-PBS חם למשך חמש דקות. בצעו שלושה שטיפות PBS בסך הכל, ולאחר מכן קבעו את הרקמה עם 4% paraform aldehyde למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע, ניתן לנתח את הרקמות באמצעות סממנים תאיים או פשוט לצבוע אותן בצבע hooks. לאחר שעה, שטפו את הפרוסות בשלושה שטיפות של 10 דקות ב-1X PBS.
לאחר מכן, חדירו את הפרוסות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתמיסת סרום עיזים 10% ב-1X PBS תוך ניעור עדין. לאחר מכן, צבעו את הרקמות ב-hooks למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך ניעור עדין. הסירו את הצבע באמצעות שלושה שטיפות של 10 דקות בכל אחת ב-1X PBS תוך ניעור עדין בזמן ההמתנה.
הניחו שקופיות זכוכית מטופלות (frosted) בתוך תא מים בעומק מספיק כדי להטביע את הרקמות לאחר הנחתן על השקופיות. לצורך קיבוע הפרוסות, ראשית, חתכו את הממברנה באמצעות סכין נישבת.
שנית, בעזרת פינצטה עדינה, העבירו עד חמישה פרוסות קשורות לממברנה לכל שקף טבול במים. שלישית, הסירו עודפי מים מכל שקף. רביעית, טפטפו טיפה של תמיסת קיבוע (floor mount solution) על כל פרוסה של המוח.
ולבסוף, הניחו בעדינות זכוכית כיסוי מעל הפרוסות והסילו בועות אוויר. הפרוסות מוכנות כעת למיקרוסקופיה, בהתאם לכמות ה-DNA שעברה אלקטרופורציה ולשלב העוברי. נמצא כי יעילות הטרנספקציה משתנה בעת האלקטרופורציה.
שמונה שעות לאחר טרנספקציה עם P silencer, תאי וקטור GFP החלו לבטא GFP. במהלך תקופת תרבית ממושכת יותר, התאים עוברים רצף נורמלי של אירועים נוירוגניים הכוללים פרוליפרציה, נדידה ודיפרנציאציה נוירונלית מוקדמת. פרוסות אלו שמרו על המורפולוגיה שלהן במשך חמישה ימים, בתנאי שממשק האוויר של המדיום נשמר היטב במהלך ביצוע פרוצדורה זו.
חשוב לבצע את כל הניסוי, מרגע ההמתה של בעל החיים ועד לרגע הנחת הפרוסות בתוך התבתי הממברנה, בתוך פחות משעתיים, וזאת כדי למזער את מוות התאים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע פעולות נוספות, כגון הוספת גורמים אקסוגניים לתרבית האורגנוטיפית, כדי לענות על שאלות כגון: מהו תפקידם של גורמי גדילה שונים או סוכנים פרמקולוגיים במנגנוני התפתחות עצבית שונים?
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה להערכת תפקוד גנים בפיתוח קליפת המוח באמצעות אלקטרופורציה ex vivo. באמצעות שימוש בפלסמידים המבטאים ביחד RNA מעכב ו-GFP, חוקרים יכולים לבחון תהליכי התפתחות עצבית כגון נוירוגנזה ונדידת נוירונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- התפתחות נוירולוגית
- גנטיקה
רקע
- קליפת המוח חיונית לתפקודים מוחיים שונים.
- הבנת תפקוד גנים חיונית להשגת תובנות לגבי התפתחות מערכת העצבים.
- טכניקות ex vivo מאפשרות מחקר מפורט של התנהגות נוירונלית.
- אלקטרופורציה היא שיטה המשמשת להחדרת DNA לתאים.
מטרת המחקר
- להערכה מהירה של תפקוד גנים בפיתוח קליפת המוח (cerebral cortex).
- לבחינת נוירוגנזה, נדידה נוירונלית ומורפוגנזה.
- לשימוש בחתכים אורגנוטיפיים לצורך תצפית על שינויים נוירונליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אלקטרופורציה ex vivo של פלסמידים בקליפת המוח העוברית של עכבר.
- החלת פרצי חשמל קצרים להגברת התעתוק (transfection).
- ה diseccion וקיבוע של מוחות ליצירת פרוסות אורגנוטיפיות.
- תצפית על תאים המסומנים ב-GFP לזיהוי פגמים נוירונליים.
תוצאות עיקריות
- טרנספקציה מוצלחת של תאי אב עצביים באמצעות פלסמידים.
- זיהוי של תתי-אוכלוסיות של נוירונים קורטיקליים עם פגמים.
- הדגמה של התועלת בטכניקות ex vivo בחקר ההתפתחות העצבית.
- אישור חזותי של מורפוגנזה עצבית באמצעות סימון GFP.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהירה לחקר תפקוד גנים.
- אלקטרופורציה ex vivo היא יעילה למחקר התפתחותי-עצבי.
- התובנות שניתן להפיק עשויות לתרום להבנת ההתפתחות הקורטיקלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אלקטרופורציה מהירה של RNAi ex vivo בקורטקס המוחי של עוברי עכברים מאפשרת בחינה תפקודית של גנים מועמדים המעורבים במורפוגנזה ובנדידה עצבית. גישה זו מספקת חלופה ניתנת להרחבה ובעלת עלות נמוכה ליצירת מודלים טרנסגניים או knockout, ובכך מאיצה את שלבי הגילוי המוקדמים ואת התיקוף של מטרות במחקר התפתחותי-עצבי. יכולת ניתוח הפסיפס (mosaic analysis) שלה תומכת בביטחון חיזוי בהערכת תפקוד הגנים, ומסייעת בתיעדוף הפורטפוליו ובקידום מבוסס ניהול סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר סריקה תפקודית מהירה של גנים מועמדים בהקשר רקמתי קרוב לפיזיולוגי.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת תפקידי הגנים במורפוגנזה ובנדידה של נוירונים.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת מטרות עבור הפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
- מאפשר ניתוח פסיפס (mosaic analysis) להבחנה בין השפעות אוטונומיות של תאים לבין תגובות רקמתיות רחבות יותר.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות פרוסות אורגנוטיפיות שעברו תיקוף לצורך תהליכי סריקה פנוטיפיים בהמשך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור באמצעות סימון GFP של אוכלוסיות נוירונליות שעברו טרנספקציה.
- מאפשר סטנדרטיזציה ונתיב הרחבה (scalability) של הבדיקה לצורך מחקרי תפקוד גנים.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות knockdown של גנים על מורפולוגיה נוירונלית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם מנגנונים נוירו-התפתחותיים הרלוונטיים למחלה על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה.
- מספק רצף מגילוי גנים ועד לתיקוף פרה-קליני בסביבות רקמה מורכבות.
- מפחית את ההסתמכות על מודלים של חיות שלמות להערכה פונקציונלית ראשונית.
- מציע הפחתת סיכונים מנגנונית עבור גנים שתפקידם הקורטיקלי אינו ידוע.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת אלקטרופורציה ל-RNAi ex vivo זו מתאימה לממשק שבין השלבים המוקדמים של הגילוי לזיהוי מועמדים פוטנציאליים (lead identification), ובכך היא מגשרת בין מחקרי תפקוד גנים in vitro לבין תיקוף in vivo. היא מייעלת את בדיקת ההשערות ותומכת באיטרציות מהירות בקווי פיתוח של מטרות נוירו-התפתחותיות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בחינה מבוססת-השערה של תפקוד גנים במורפוגנזה ובנדידה של נוירונים.
- סריקה: מספקת פרוסות אורגנוטיפיות מוכנות לבדיקה עם תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- אנליטיקה: תומכת במדידה ישירה של פנוטיפים מורפולוגיים ונדידה בנוירונים המסומנים ב-GFP.
- מחקר תרגומי: שומרת על ההקשר הרקמתי לצורך התאמה לתהליכים נוירו-התפתחותיים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה רב-פעמית להערכה מהירה של תפקוד גנים עבור מועמדים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תפקוד של גנים התפתחותיים-עצביים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה לצורך ניתוח השתקת גנים (gene knockdown).
- ערך אסטרטגי: מאיץ קבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת מחקר (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת ההסתמכות על מודלים טרנסגניים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מטרות התפתחותיות-עצביות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של מוח עוברי ובתרביות של פרוסות אורגנוטיפיות.
- נדרשת גישה לציוד אלקטרופורציה ולמיקרוסקופיית פלואורסצנציה לזיהוי GFP.
- נדרש תיקנון קפדני של ריכוז ה-DNA ושל פרמטרי האלקטרופורציה לצורך שחזור התוצאות.
- ניתן להתאים את השיטה למבני גנים ולשלבים עובריים שונים, אך שבירות הרקמה ותזמון הפעולה הם קריטיים.
- השיטה מוגבלת לחלונות התפתחותיים מוקדמים לאחר הלידה וייתכן שלא תתעד פנוטיפים ארוכי טווח.
