שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית: Ex vivo RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine
18 במאי 2012
לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות הקשורות לשעבר vivo Electroporation של פלסמידים שיתוף להביע RNA מעכבות (RNAi) ו-GFP בקליפת המוח העוברי murine. פרוטוקול זה הוא מקובל בחקר היבטים שונים של neurodevelopment כגון neurogenesis, העברה עצבית ו המורפוגנזה העצבית כולל דנדריט ו תוצאה האקסון.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע הערכה מהירה של תפקוד הגנים בהתפתחות קליפת המוח באמצעות פרוסות אורגנוטיפיות. זה מושג על ידי החדרת פלסמידים, קוקס, ביטוי ומעכב RNA וסמן GFP לקליפת המוח המורנית. התפרצויות חשמליות קצרות מוחלות על המוח, ומאפשרות ל-DNA הפלסמיד להעביר את תאי האב העצביים.
לאחר מכן, המוחות מנותחים, מוטמעים ומחתכים כדי לייצר פרוסות אורגנוטיפיות שיכולות לעבור מורפוגנזה עצבית ex vivo. ניתן לחפש את הפרוסות האורגנוטיפיות אחר תת-אוכלוסיות של נוירונים בקליפת המוח עם פגמים נודדים או מורפולוגיים על ידי התבוננות ישירה בתאים המסומנים ב-GFP. היי, ברוכים הבאים למעבדה שלי באוניברסיטת בראון במחלקה לביולוגיה מולקולרית היום, ד"ר ליזה ושני סטודנטים, קאט זר ומארק סבה ידגימו את טכניקת האלקטרופורציה ex vivo ואת תרבית הפרוסות האורגנוטיפית, שהיא טכניקה שימושית מאוד למחקרים נוירו-התפתחותיים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהיבטים שונים של התפתחות נוירולוגית, כולל נוירוגנזה, נדידה עצבית ומורפוגנזה עצבית. מכיוון שניתוח זה נעשה בקירוב כמעט של סביבת ה-IBU, הוא מספק אלטרנטיבה זולה ומהירה ליצירת בעלי חיים טרנסגניים או נוקאאוט לגנים בעלי תפקוד לא ידוע. לבסוף, בהשוואה לטכנולוגיית פעולה אלקטרו in vivo, ההצלחה של ניסויי פעולה אלקטרו vivo אלה אינה תלויה בניתוח מיומן, פיתוח מיומנויות, וניתן לבצע אותם עם זמן הכשרה קצר יותר ומיומנות.
לאחר המתת חסד של עכברה בהריון, נתחו את העוברים לקור כקרח, השלימו את HBSS, ושמרו אותם בשקי השליה האישיים שלהם. לאחר מכן בתמיסת HBSS הקרה, שחררו עובר מהשק וחתכו את ראשו לאחר החוליה הראשונה להזרקה, הניחו את הראש על פיסת נייר פרפורמית על גבי צלחת פטרי באמצעות מזרק המילטון בהתאמה אישית. הזריק שישה עד שמונה מיקרוליטרים של תערובת ירוקה מהירה של DNA דרך החדר השלישי.
משם, התערובת תמלא את שני החדרים הצדדיים בשלפוחיות קליפת המוח. לצורך אלקטרופורציה, נעשה שימוש באלקטרודות פלטינה בפינצטה BTX. הנח את האלקטרודה החיובית לכיוון הצד של קליפת המוח שתעבור אלקטרופורציה.
לדוגמא, האלקטרודה צריכה להיות על גבי הראש עבור קליפת המוח הגבית. ליעילות טרנספקציה גבוהה, התאם תמיד את ריכוז ה-DNA למיקרוגרם אחד למיקרוליטר והשתמש ב-DNA מבודד מהכנה של Maxi. במידת הצורך, השתמש בערכה נטולת אנדוטוקסין כדי לטהר את ה-DNA לאחר האלקטרופורציה.
דגרו את הראש על קרח לפחות חמש דקות לפני שתנתחו אותו. חשוב מאוד להשתמש בכמות הנכונה של פולסים חשמליים וזרם בעת ביצוע האלקטרופורציה כדי להימנע מפגיעה במוח העוברי הצעיר יותר. לאחר האלקטרופורציה, הרקמה הופכת לשברירית מאוד.
חשוב לבצע את הנתיחות בזהירות רבה מכיוון שהעור ובית הספר יכולים למשוך את קרומי המוח של שלפוחיות קליפת המוח, וזה עלול לפגוע בשלפוחיות קליפת המוח בעת הוצאתן מהגולגולת. לאחר חמש דקות, נתחו את המוח בקור. HBSS מתחילים בביצוע חתך קטן בצד הראש וקילוף העור מצידי הראש.
לאחר מכן, בעזרת מלקחיים עדינים, מקלפים בעדינות את הפיה מהמוח. הסר את המוח השלם מהגולגולת. בסיום, שמרו על המוח ב-HBSS קר כקרח והתכוננו להטמיע את הרקמה.
התחל למלא את התבניות בנקודת התכה נמוכה של 3%. אגרוס. מניחים את התבניות על קרח כך שהאגרוס יתמצק ליד תחתית התבנית. ראשית, להבטיח שהמוחות יישארו נתמכים וממורכזים.
עכשיו עם מלקחיים עדינים, הסר בעדינות מוח מ-HBSS, ספוג עודף חיץ עם מגבון קים או נייר פילטר, והכניס את המוח לנקודת ההיתוך הנמוכה. אגרוס. לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה כדי לסובב את המוח בתוך התבנית כדי למקסם את המגע בין אגרוס לרקמה. כאשר כל המוחות מועברים, מקם כל מוח בערך באותו כיוון ועומק בתוך התבנית שלו.
הארוס יתמצק תוך כחמש דקות. אז עבוד מהר. אפשר לארוס להתמצק לחלוטין על ידי דגירה של חמש דקות נוספות על קרח.
חתוך עודפי ארוס לפני הרכבת הבלוקים. לאחר מכן חבר את בלוקי האגרוס זה לזה באמצעות דבק פלסטי הדבקה מהירה, כל מוח בערימה צריך להיות ממוקם עם נורות הריח שלו כלפי מעלה. לאחר חיבור הקוביות, חתוך את ה-aros כדי להבטיח שכל מוח ייחתך על ידי הוויברטו.
ואז טבלו אותם מיד ב-HBSS קר כקרח. כדי לפרוס את הבלוקים, הגדר את מהירות הוויברטוס למהירות נמוכה, כמחצית מהמקסימום, והגדר את תדר רטט הלהב להגדרה הגבוהה ביותר. לאחר מכן צור פרוסות עטרה בעובי 250 מיקרון, אחזר פרוסות באמצעות מרית עדינה כפופה והעביר אותן לבארות רקמות בעזרת מברשת עדינה או מלקחיים.
אם הרקמה נופלת מהאגרוס, מגע האגרוס של הרקמה לא נוצר מספיק במכסה המנוע של תרבית רקמות, הכינו צלחת שש בארות עם 1.8 מיליליטר של מצע תרבית פרוסות לבאר, והניחו בכל אחד מהם קוד תוספות אורגנוטיפיות של ליזין פוליטי למינין. ובכן הוסף 500 מיקרוליטר של מדיית תרבית פרוסות לחלק העליון של תוספות הפרוסות האורגנוטיפיות. לאחר מכן העבירו עד חמש פרוסות לכל תוספת.
לאחר מכן, הסר את כל המדיה העודפת מהחלק העליון של הפרוסות כדי להבטיח שהפרוסות ישמרו על המורפולוגיה שלהן ככל האפשר ובעלות מוות תאים מינימלי. חשוב לשמור על ממשק אוויר נוזלי בריא והפרוסות לא צפות במדיה. לבסוף, דגרו את הפרוסות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה.
החלף מחצית מנפח המדיה מתחת לממברנה כל יומיים. הפרוסות לא צריכות להיות צפות על נוירוני המדיה המבטאים מבנים אלקטרופורטיים ניתן לדמיין כבר שמונה שעות לאחר אלקטרופורציה לאחר ימי התרבות הרצויים. תקן את הפרוסות בקרום לניתוח.
שטפו כל תוספת אורגנית טיפוסית עם PBS חם למשך חמש דקות. בצע שלוש שטיפות PBS בסך הכל, ולאחר מכן תקן את הרקמה עם 4% אלדהיד פרפורם למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע ניתן לנתח את הרקמות בעזרת סמנים סלולריים או פשוט להכתים אותן בכתם ווים לאחר שעה יש לשטוף את הפרוסות בשלוש שטיפות של 10 דקות ב- XPBS אחד.
לאחר מכן חדיר את הפרוסות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתמיסת סרום עיזים של 10% ב-XPBS אחד עם ניעור עדין. לאחר מכן מכתימים את הרקמות עם ווים למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. הסר את הכתם בשלוש שטיפות של 10 דקות ב-XPBS אחד עם ניעור עדין בזמן ההמתנה.
הנח מגלשות זכוכית חלבית בתא מים עמוק מספיק כדי לרחוץ את הרקמות לאחר הנחתן על המגלשות. כדי להרכיב את הפרוסות. ראשית, חותכים את הממברנה בעזרת אזמל.
שנית, בעזרת מלקחיים עדינים, העבירו עד חמש פרוסות קשורות בקרום לכל מגלשה שקועה במים. שלישית, הסר עודפי מים מכל מגלשה. רביעית, מרחו טיפה של תמיסת הרכבה על הרצפה על כל פרוסת מוח.
ולבסוף, הניחו בעדינות החלקת כיסוי על גבי הפרוסות והסירו את כל בועות האוויר. לאחר מכן הפרוסות מוכנות למיקרוסקופיה בהתאם לכמות ה-DNA האלקטרופוטית והשלב העוברי. באלקטרופורציה, יעילות הטרנספקציה נמצאה משתנה.
שמונה שעות לאחר טרנספקציה עם משתיק P, תאי וקטור GFP החלו לבטא GFP. במהלך תקופת תרבות ארוכה יותר, תאים עוברים רצף נורמלי של אירועים נוירוגניים כולל התפשטות, נדידה והתמיינות עצבית מוקדמת. פרוסות אלה שמרו על המורפולוגיה שלהן במשך חמישה ימים, בתנאי שממשק האוויר של המדיה היה מתוחזק היטב תוך כדי ניסיון הליך זה.
חשוב לערוך את הניסוי כולו מרגע המתת החסד של בעל החיים ועד לרגע הנחת הפרוסות בתוספות הממברנה תוך פחות משעתיים כדי למזער את מוות התאים לאחר הליך זה. ניתן לבצע הוספה אחרת של גורמים אקסוגניים לליזה האורגנוטיפית כדי לענות על שאלות כמו, מה תפקידם של גורמי גדילה שונים או גורמים פרמקולוגיים במנגנונים הנוירו-התפתחותיים השונים?
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה להערכת תפקוד הגנים בהתפתחות קליפת המוח באמצעות אלקטרופורציה ex vivo. על ידי שימוש בפלסמידים המבטאים RNA מעכב ו-GFP, חוקרים יכולים לחקור תהליכים התפתחותיים עצביים כמו נוירוגנזה והגירה עצבית.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- התפתחות עצבית
- גנטיקה
רקע
- קליפת המוח חיונית לתפקודי מוח שונים.
- הבנת תפקוד הגנים חיונית להבנת התפתחות עצבית.
- טכניקות ex vivo מאפשרות מחקר מפורט של התנהגות עצבית.
- אלקטרופורציה היא שיטה המשמשת להכנסת DNA לתאים.
מטרת המחקר
- להעריך במהירות את תפקוד הגנים בהתפתחות קליפת המוח.
- לחקור נוירוגנזה, הגירה עצבית ומורפוגנזה.
- להשתמש בפרוסות אורגנוטיפיות לצפייה בשינויים עצביים.
שיטות ששימשו
- אלקטרופורציה ex vivo של פלסמידים בקליפת המוח העוברית של עכבר.
- יישום של פרצי חשמל קצרים כדי להקל על הטרנספקציה.
- ניתוח והטמעה של מוחות ליצירת פרוסות אורגנוטיפיות.
- תצפית על תאים מסומני GFP כדי לזהות פגמים עצביים.
תוצאות עיקריות
- טרנספקציה מוצלחת של תאי מבשרים עצביים עם פלסמידים.
- זיהוי של תת-אוכלוסיות נוירונים קליפתיים עם פגמים.
- הוכחת התועלת של טכניקות ex vivo במחקר התפתחות עצבית.
- אימות חזותי של מורפוגנזה עצבית באמצעות סימון GFP.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהירה לחקר תפקוד הגנים.
- אלקטרופורציה ex vivo יעילה למחקר התפתחות עצבית.
- התובנות שהושגו יכולות לסייע בהבנת ההתפתחות הקליפתית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Rapid ex vivo RNAi electroporation in embryonic murine cerebral cortex enables functional interrogation of gene candidates implicated in neuronal morphogenesis and migration. This approach provides a scalable, low-cost alternative to generating transgenic or knockout models, accelerating early discovery and target validation in neurodevelopmental research. Its mosaic analysis capability supports predictive confidence in gene function assessment, informing portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid functional screening of candidate genes in a near-physiological tissue context.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in neuronal morphogenesis and migration.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental disorders.
- Allows mosaic analysis to distinguish cell-autonomous effects from broader tissue responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic slice systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP labeling of transfected neuronal populations.
- Enables assay standardization and scalability for gene function studies.
- Supports reliable evaluation of gene knockdown effects on neuronal morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neurodevelopmental mechanisms by preserving tissue architecture.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical validation in complex tissue environments.
- Reduces reliance on whole-animal models for initial functional assessment.
- Offers mechanistic de-risking for genes of unknown cortical function.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo RNAi electroporation method fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging in vitro gene function studies and in vivo validation. It streamlines hypothesis testing and supports rapid iteration in neurodevelopmental target pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of gene function in neuronal morphogenesis and migration.
- Screening: Provides assay-ready organotypic slices with quantitative, reproducible outputs.
- Analytics: Supports direct measurement of morphological and migratory phenotypes in GFP-labeled neurons.
- Translational Research: Maintains tissue context for alignment with disease-relevant neurodevelopmental processes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function assessment across multiple candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for gene knockdown analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing reliance on transgenic models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection and organotypic slice culture.
- Needs access to electroporation equipment and fluorescence microscopy for GFP detection.
- Demands careful standardization of DNA concentration and electroporation parameters for reproducibility.
- Adaptable to various gene constructs and embryonic stages, but tissue fragility and timing are critical.
- Limited to early postnatal developmental windows and may not capture long-term phenotypes.
