הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר את הפעילות העצבית על ידי הדמיית סידן במקביל לתצפית על התנהגות האכילה. זה מושג על ידי החדרת זבוב תחילה למנגנון הזבובים. לאחר מכן, ראש הזבוב מנותח כדי לחשוף את המוח.

המנגנון של הזבוב עם הזבוב המנותח ממוקם לאחר מכן על במת המיקרוסקופ. השלב האחרון של ההליך הוא גירוי של פרו בואה עם פתיל סוכר. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הפעלה של נוירון מזוהה באמצעות הדמיית סידן בקורלציה להרחבת פרובוס באמצעות צילום וידאו של התנהגות.

הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כשחשבתי על עיניים של בירות מכות השוחות על פני המים. לנו הבירות יש עיניים מפוצלות ויכולות לראות מעל ומתחת לפני המים. נקודה מסובכת בניסוי שלי היא שהמוח וה-SCU קרובים זה לזה, אבל אם הם מופרדים יפה כמו העיניים של הבירות, אנחנו יכולים לשמור על ה-SCU יבשים בזמן שהמוח חשוף בלוויין.

את זה הכנתי מחיצה פשוטה מאוד ממש מעל ה-SCUs כדי להפריד את הפנים היבשות ממקום הרוחב, לעצב פלטפורמה מהמכסה של צלחת בז 35 מילימטר על ידי המסת הדופן וגילופה ליצירת זווית ועובי מתאימים. קדחו חור בפלטפורמה כדי לקבל את ראש הזבוב, כך שחלקי הפה ייחשפו בחופשיות לחלק החיצוני של החדר. חותכים את הקצה של קצה איש פיפטה רחב מספיק כדי לקבל את גוף הזבוב, ואז מדביקים את הקצה לפלטפורמה.

לאחר רעב, מבוגר טס במשך 24 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. להרדים את הזבוב על ידי הנחתו בצינור פלסטיק של 15 מיליליטר, בעמידה על קרח באמצעות מלקחיים. הכניסו זבוב לתא הזבובים ודחפו בעדינות את הזבוב פנימה עד שהוא לא מסוגל לזוז.

אטום את החלקים הסובבים של החרטום הפרוקסימלי או הבמה לקצה הפנימי של החור על ידי מריחת כמות קטנה של דבק ריפוי קל על הצדדים ומעל הבמה, באמצעות ריסים או כלי דומה כדי לפזר בזהירות את הדבק. מרחו גם את הדבק מבפנים של הזבובים על החלל שבין החלק הגבי של הראש לקצה הפנימי של החור. לבסוף, רפאו את הדבק עם התאורה החלשה ביותר של אור כחול המספיקה לריפוי כדי למנוע נזק לזבוב.

כדי לייצב את ראש הזבוב ולחשוף את החלק הגחוני של ה-SOG, חבר חוט כדי להחזיק את הבמה מורם חלקית. כשהזבוב במקומו, מלאו את פני הפלטפורמה במי מלח ללא סוכרוז. פתח את קפסולת הראש כדי לחשוף את ה-SOG באמצעות להב טונגסטן ומלקחיים עם קצוות מחודדים שאנו מכנים מלקחיים מושחזים.

רוכסנים מספריים. זוהי הדגמה של רוכסנים מספריים, חותכים סיב ממגבון קים לשם השוואה. זה מבוצע תחילה עם מספריים קשתית בשדה הראייה, ואז מול סרגל מדורג מילימטר אחד.

ראשית, בעזרת להב הטונגסטן, בצע חתך דרך הקצה האחורי. לאחר מכן חותכים את הצד ואת הקצוות הקדמיים בעזרת המלקחיים המחודדים. הרם את חתיכת הציפורן החתוכה עם המלקחיים והסר אותה.

חתוך את האנטנות ועצבי האנטנה באמצעות המלקחיים. לאחר מכן הסר באופן סלקטיבי שקי אוויר בין ה-SOG לציפורן על מנת לייצב את המוח ולמנוע חפצי תנועה. לאחר מכן, חותכים את הוושט בקצה לכיוון הלוע ובסוף נכנסים ל-SOG על מנת להסיר את הקשר בין הלוע למוח.

לאחר מכן לאחר זיהוי ומשיכת שריר 16, נתק את כל קנה הנשימה המחבר בין המוח לציפורן. הנח את הזבובים על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב, ועבור לעדשת הטבילה במים להדמיה. לאחר מכן קח קטע אופטי בודד בארבעה הרץ עם זמן חשיפה של 122 מילישניות באמצעות לייזר עירור של 491 ננומטר המתמקד באזור העניין.

השתמש במחט מזרק עם פתיל קטן של יפנית. האם היא הייתה נייר שבלט מהקצה כדי להציע סוכרוז לזבוב? שחרר טיפה קטנה של תמיסת סוכרוז על הפתיל, ולאחר מכן שאב אותה עם מזרק המחובר למחט דרך צינור גמיש באמצעות מניפולטור ג'ויסטיק כדי להחזיק את המחט.

מרחו את פתיל הנייר הספוג על קצה הבדיקות, אך רק לרגע. כדי למנוע שובע. עקוב אחר תגובת הרחבת PROBUS או התנהגות PER באמצעות מצלמת CCD המחוברת למיקרוסקופ דיסקציה במקביל להדמיית סידן, והקפד לאסוף את הנתונים תוך שעה מרגע הדיסקציה.

מוצגת כאן תגובת הרחבה טיפוסית של Prob Bois לגירוי עם WIC המכיל סוכרוז של 100 מילי-מולארי. תמיסה מימית שצולמה באמצעות לייזר 491 ננומטר עבור פלואורסצנטיות G CAMP. הדמיית סידן בו זמנית במהלך התנהגות תגובת הארכת פרוזה המוצגת כאן תחילה לפני ואחרי גירוי מאפשרת הדמיה של תגובות GAMP 3.0 המושרות על ידי סוכרוז בנוירון המוטורי עבור מד זווית שריר הבמה.

בכוכב המצב כימות של תגובת GAMP 3.0 המושרה על ידי סוכרוז מראה כי הנוירונים המוטוריים מגיבים לגירוי סוכרוז על ידי עלייה חדה בקרינה, ואחריה שלב שיקום של מספר שניות לקו הבסיס. הפלטפורמה מאפשרת שיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה או אופטוגנטית או פסיכוגנטית, או הפעלה כימית לנוירונים או הדמיית מעבדה TimeLapse של מבנים מסומנים ב-GFP על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מתאם בין פלסטיות סינפטית לזיכרון.