Name: הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: למדו לעקוב אחרי פעילות נוירונים ב-Drosophila melanogaster בעת התנהגות אכילה באמצעות הדמיית סידן. השיטה מאפשרת לקשר בין הפעלה עצבית לתגובת האכלה בזבובי פירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אני מודה ל ווטנבה, M Gorczyca וחברים אחרים במעבדה Yoshihara להערות שימושיים דיונים. אני מודה סקוט ק &#39;ול&#39; Looger למניות זבובים, S Yokoyama להפגין ניסויים, Shinya Iguchi לעזרה טכנית, נובוקו Yoshihara על מידע מהותי. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי מענקי בריאות הנפש MH85958, וקרן Worcester ל שלי

1. לבנות את הזבובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את הפלטפורמה ממכסה של צלחת 35 מ&quot;מ פלקון ידי המסת דפנות וגילוף זה כדי ליצור זווית בעובי המתאים (איור 1 א &#39;, איור 2). לקדוח חור במצע לקבל את ראש זבוב (איור 1 א, ב), כך את איברי הפה חשופים באופן חופשי לחלק החיצוני של חדר (איור 1 א). חותכים את הקצה של קצה Pipetman, עם גודל התאמת זבוב כדי לצפות. הדבק קצה לפלטפורמה כפי שמוצג באיור 1 א כדי להשלים את הזבובים (איור 2). </li></ol> 2. הכנת טוס לצורך השגחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרעיב את הזבוב הבוגר במשך 24 שעות במהירות של 25 ° C לפני הניסוי, על ידי הצבתו בתוך בקבוקון עם מגבת נייר רטוב בלבד, אם רעב הוא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבוב ידי הצבתו בתוך צינור פלסטיק 15 מ&quot;ל עומד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, הכנס זבוב לתוך תא שלזבובים, בעדינות זבוב עד שהוא לא מסוגל לזוז. לאחר מכן, להוסיף תוסף כדי לשמור על זבוב. (איור 1 א, ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החלקים שמסביב של חוטם הפרוקסימלית (הבמה) עד לקצה הפנימי של החור, למרוח כמות קטנה של דבק אור ריפוי (Tetric EvoFlow) לצדדים ומעל דוכן מבחוץ (חצים באיור 3). כמו כן, החל את הדבק מבפנים הזבובים לחלל בין החלק הגבי של הראש לקצה הפנימי של החור (1B איור). כדי לאפשר במה לנוע בחופשיות, יש להיזהר כדי למנוע כל דבק מגע הבמה באמצעות עפעף (או משהו דומה) כדי להפיץ את הדבק. לבסוף, לרפא את הדבק עם התאורה החלשה של אור כחול מספיק לרפא כדי למנוע נזק זבוב מחום יתר. הסר את תקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוט כדי להחזיק את הבמה מבוטלת חלקית (חץ איור 3) עשוי להיות מועסק על מנת לייצב את זבוב &quot;של ראש על ידי הימנעות בליטה של חלק בלוע כדי SOG ולחשוף את החלק הגחוני של SOG, במיוחד עבור מסופי הדמיה presynaptic של נוירונים Gr5a 8, אשר מכוסים על ידי חלק של הלוע, כאשר חוטם הוא חזר בו באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את פני השטח של פלטפורמה עם המכילים סוכר ללא מלח (מ&quot;מ): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4.5, CaCl 2, 1.5, ו-HEPES NaOH, 5 עם pH של 7.1 10. זה מלוחים סוכרוז ללא יש tonicity דומים לאלה של נפוץ בשימוש סוכרוז המכיל salines כגון HL3.1 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את הראש הקפסולה באמצעות סכין טונגסטן מלקחיים עם עצות כמו מספריים מחודדים, שהוא מכשיר מחוייט ועוצב במקור על ידי ד&quot;ר Kageyuki Yamaoka, יפן, אל הסרטון לציפורן ואת קנה הנשימה לחשוף SOG (איור 4). קצה הגחון של לציפורן הראש נחתך כמו הגחון ככל האפשר ואילו חתך בקצה הגב לא היה קריטי. ראשית, חתך דרךבקצה האחורי באמצעות סכין טונגסטן. לאחר מכן, לחתוך בצד את הקצוות הקדמי באמצעות מלקחיים מחודדים. פיסת העור המת חתך יש הרים עם מלקחיים את הסיר. העצבים אנטנות מחושים יש לגזור על ידי מלקחיים מחודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע חפצים התנועה במהלך ההקלטות, המוח חייב להיות מיוצב באמצעות הסרת חלקים מסוימים של זבוב. ראשית, להסיר באופן סלקטיבי שקי אוויר בין SOG ו לציפורן. חותכים את הוושט בסוף לכיוון הלוע ובסוף נכנס SOG להסיר את הקשר בין הלוע ואת המוח. אחר כך שולף שריר 16 12, ולבסוף, לנתק את כל קנה הנשימה חיבור המוח לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבענו הזבובים שלנו על הבמה של מיקרוסקופ אולימפוס BX51WI מחובר למערכת מסתובב הדיסק confocal מיקרוסקופ (Improvision ב PerkinElmer) (איור 5). טבילה במים העדשה, למשל 40X/0.8 NA, היה שקוע לאמבטיה (איור 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + הדמיה של המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + הדמיה באמצעות GCaMP3.0 1, 9 בוצעה באמצעות שיטת שהוקמה על ידי מרלה et al. 8 (איור 6). באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב confocal (Improvision), לקחת חלק אופטי יחיד 4Hz עם זמן חשיפה של 122ms באמצעות 491nm לייזר עירור, תוך התמקדות על האזור של עניין (גוף התא של הנוירון המוטורי, או interneuron או מסופי presynaptic של עצב סנסורי התעורר אצלם) עם תוכנת מהירות, ver. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. מגרה את חוטם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate 100mm סוכרוז בתמיסה מימית לתוך מחט המזרק עם פתיל קטן (היא עשויה מנייר washi יפנית, ראו טבלה של חומרים כימיים מסוימים) בולט מקצה (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוק טיפה קטנה של תמיסת סוכרוז על הפתיל, אם כן, לשאוב אותו, מיד beforדואר יישום הפתיל נייר ספוג washi אל קצה חוטם את. הפתיל נייר washi צריך להיות מיושם רק לרגע, כדי למנוע שובע (איור 8). מעקב אחר תגובת הרחבה חוטם (PER) התנהגות באמצעות מצלמת CCD מחובר מיקרוסקופ לנתיחה (איור 5) בו זמנית עם Ca 2 + הדמיה. נתונים יש להביא בתוך שעה לאחר תחילת לנתיחה, כי התגובה PER לא נשמר יותר משעה בתנאים אלה. </li></ol> 5. נציג תוצאות הנוירונים המוטוריים של מד הזווית הבמה, זוג השרירים העיקריים האחראים על הרמת דוכן להארכת חוטם, דווחו להראות התגובות לגירויים חזקים מתוקים 13. איור 9 מראה של CA 2 + אותות דרך GCaMP3.0 1, 9 לידי ביטוי גל 4 הנהג, E49 13, מגוף התא של הנוירון המוטורי. כפי שניתן לראות בסרטון, robuרחוב PER נצפתה בתיאום עם עלייה Ca 2 + האות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של המוח פליי חיים הדמיה Electrophysiology שלב (זבובים). , הזבובים בנוי כך הזווית של הקיר מאפשר ראש זבוב לצאת ישר. שלושה קטעים של חוטם זבובים הם בצבעים, במה הוא מגנטה. זבוב מוכנס לתוך החדר עם מלקחיים, וחתיכת לחתוך מסוף עצה Pipetman הוא פקוק לתוך האחורי של החדר כדי לחסום את זבוב לברוח. ב &#39;חור משועמם כדי להתאים את ראשו של זבוב. הפערים שנותרו סגורים עם דבק אור ריפוי כמצוין כדי להבטיח שאין נזילות. אחרי דבק ריפא, עצה Pipetman כמו תקע מוסר. מלח הוא שפך לתוך את הזבובים האלה כי פני השטח של המוח מכוסה לחלוטין. יש להבטיח כי אין דליפה מלוחיםלאינג אל הקצה הקדמי של הראש זבוב. אזור מוצל מוקף בקו מקווקו בלוח ב &#39;מראה את החלק שיש גזור החוצה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> איור 2. תצלום של הזבובים. הקיר בצורת חצי סהר של דבק (מאקדח דבק) נעשה כדי לשלוט על זרימת תמיסת מלח במהלך זלוף, וכדי להפחית את כמות מלוחים בשימוש. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> איור 3. תצוגה חזיתית של זבוב רכוב הזבובים. תמונה זו מראה כיצד זבוב מוגדר הזבובים, ואיך דבק אור ריפוי מוחל סביב ראשו של זבוב (חיצים) כדי ליצור חותם מלוחים הוכחה. אם כל ההדלפות מלוחים ועד החדק של זבוב, אז הניסוי ייכשל. חוט (ראשי חץ) קשור בשלב זה לקיים את חוטם במצב, כך שזה לא retrac לחלוטין<html> טד. אחרת זה היה לחסום את החלק הגחוני יותר SOG ולגרום חפצים ותנועה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> באיור 4. העליונה לאור את הזבובים זבוב גזור. תמונה זו מראה SOG חשיפה של הסרת העור המת הבאה לטוס. הוושט, שריר 16 ו tracheae מחובר למוח, כמו גם נבחרות אוויר שקי גם הוסר כדי למנוע מהם להפריע את המוח, מה שעלול להוביל את החפצים אותות סידן. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> איור 5. מכשיר ניטור. מנגנון זה מורכב מ מיקרוסקופ אולימפוס BX51WI מחובר למערכת מסתובב הדיסק confocal מיקרוסקופ (Improvision), וצד רכוב Nikon SMZ800 מיקרוסקופ. התקנה זו מאפשרת הדמיה חי של פעילות המוח במהלך PER התנהגות. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; איור 6. תמונות להצגה הצדדית של הזבובים. שכבה דקה של תמיסת מלח דחוקה בין עדשת מים לטבילה 40X ו זבוב. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> איור 7. סכמטי להכנת פתיל נייר washi. יפני דקיק-washi הנייר הוא קלף יפני מסורתי שהוא דק מאוד חלקה (Haibara, יפן). הוא גם חזק מאוד והוא יכול לשמור על כמות גדולה של נוזלים. נייר washi יש לחתוך טרפז עם ממדים ספציפיים מאוד, 0.3 מ&quot;מ ו 0.7 מ&quot;מ רוחב, ו - 4-5 מ&quot;מ באורך (א). זה טרפז מוכנס לתוך קצה מחט המזרק G 23 מהצד 0.7 מ&quot;מ ניתן התייצב דרך הכניסה של סיכה חרק, אשר כפופות לצורה-V (ב). ג, נייר הופך washi החשיפה הבאה שקוףלנוזל, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור ניסוי זה. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> איור 8. גירוי של חוטם על לזבובים בעלי הפתיל-washi. הפתיל נייר washi בקצה של מחט המזרק מוחל לרגע באמצעות מניפולטור ג&#39;ויסטיק ביד אחת. המחט מחוברת דרך צינור גמיש כדי ההזרקה מניפולציות עם זאת, עבור aspirating ופריקה פתרון סוכרוז. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> איור 9. נציג תוצאות. ולדירה, התנהגות רשמה באמצעות מצלמת CCD מותקנת סטראו. צפיות הקדמי של זבוב מורעבת עם כ חוטם ארוך (חיצים) לפני גירוי, על גירוי, ואחרי גירוי עם הפתיל המכילה 100 סוכרוז mM מימית פתרון (ראש חץ). תאורה נעשה על ידי לייזר 491 ננומטר שימושעבור GCaMP פלואורסצנטי. ב, סוכרוז הנגרמת GCaMP 3.0 תגובה הנוירון המוטורי של מד הזווית של שריר דוכן במצב הרעבה. הפאנל העליון, לפני גירוי, הפאנל התחתון, מיד לאחר הגירוי. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. ג, כימות בתגובה סוכרוז הנגרמת 3.0 GCaMP. הנוירון המוטורי מגיב לגירוי סוכרוז על ידי גידול חד של הקרינה ואחריו שלב החזרת מספר שניות עד לקו הבסיס.

<ol><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li>
<li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li>
<li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li>
<li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDethier%2C+VG+%22Hungry+Fly%22">Hungry Fly</a>. , Harvard University Press. (1976).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+Extension+Response+%28PER%29+Assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li>
<li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. M, D. emerecm , John Wiley & Sons. 420-534 (1950).</li>
<li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li>
<li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; אין לי מה לחשוף.</p

הזבובים מאפשר הקלטה בו זמנית של Ca 2 + האותות והתנהגות למשק. גם עם המוח נחשף להתנהגות מלוחים PER רגיל נצפתה. באמצעות פתיל יפני דקיק-washi במקום הפתיל Kimwipe שימוש method7 נימי המקורי מאפשר התנהגות PER לשחזור מאוד יציבה מונעת את הצורך להיות מיומנים בקבלת ובחירת הפתיל Kimwipe טוב. העצות הניסוי האמור לעיל אפשר לנו בהצלחה למנוע הפרות סדר על ידי תנועה של חוטם, שמוביל הקלטה יציבה מאוד של Ca 2 + אותות עם רעש נמוך. מדי פעם, הסרת הרקמה לא היה די כדי לחשוף תאים או לדכא את התנועה כראוי, מה שמוביל לתוצאות עניים. עם זאת, ברגע שהיינו מיומן, יותר מ 80% של ההכנות הניב תוצאות טובות. מתודולוגיה זו היא לא רק Ca 2 + הדמיה, אבל יכול גם להיות מותאם הדמיה כל חי תוך שמירה על PER התנהגות. לדוגמה, אנו יכולים לגשת לכל תא באמצעותהשימוש אלקטרודות ישירות להקליט פעילות. בשילוב עם מיקרוסקופ שני הפוטונים עירור, אנו מסוגלים לבצע זמן לשגות הדמיה של מבנה סינפטי, מה שיכול להיות קשור לשינויים התנהגותיים. לכן, שיטה זו של הדמיה מוחית עם תצפית התנהגותית היא לא רק ערך לנתיחה פונקציונלי של הרשת העצבית, אך יכול לשמש ככלי רב עוצמה, כדי לקשר בין 14 הפלסטיות הסינפטית את המנגנונים מאחורי הזיכרון.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ציוד / מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar vivadent </td><td> M04115 </td><td> אור ריפוי דבק </td></tr><tr><td> BX51WI מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> BX51WI </td><td> עם עדשת 40X (NA 0.8) טבילה במים המטרה </td></tr><tr><td> ספינינג מערכת confocal דיסק מיקרוסקופ </td><td> Improvision ב PerkinElmer </td><td></td><td> עם לייזר 491 ננומטר </td></tr><tr><td> סטראו </td><td> ניקון </td><td> SMZ-800 </td><td> מחוברת זרוע הנדנדה. צפה סטריאו עדיין זמינה עם הקלטת וידאו </td></tr><tr><td> יפני דקיק-washi נייר </td><td> Haibara, יפן </td><td></td><td> סוג מיוחד של נייר יפני מסורתי </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> הדמיה מקור </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 פיקסלים SONY CCD </td></tr><tr><td> ג&#39;ויסטיק מניפולטור </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

כדי לחקור רשתות נוירונים מבחינת תפקידם בהתנהגות, עלינו לנתח כיצד נוירונים פועלים כאשר כל דפוס התנהגות נוצרת. לפיכך, הקלטות בו זמנית של הפעילות העצבית התנהגות חיוניים, כדי לקשר בין פעילות המוח להתנהגות. עבור ניתוחים התנהגות כאלה, זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מאפשרת לנו לשלב אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית כגון GCaMP 1, כדי לפקח על הפעילות העצבית, ולהשתמש מניפולציות גנטיות מתוחכמות עבור טכניקות optogenetic או thermogenetic באופן ספציפי הפעל זיהו נוירונים 2-5. השימוש בטכניקה thermogenetic הוביל אותנו למצוא נוירונים קריטיים עבור התנהגות האכלה (המבול et al., תחת גרסה). כחלק העיקרי של התנהגות האכילה, בוגר תסיסנית מרחיב חוטם שלה להזנת 6 (בתגובה חוטם הארכה; PER), מגיב לגירוי מתוק מתאי החישה על חוטם שלה או טרסי. שיתוףmbining פרוטוקול PER 7 עם טכניקה סידן באמצעות הדמיה 8 GCaMP3.0 1, 9, הקמתי מערכת ניסיונית, שבה אנו יכולים לעקוב אחר פעילות של נוירונים במרכז האכלה - גנגליון suboesophageal (SOG), בו זמנית עם תצפית התנהגותית של חוטם את. אני עיצבו מנגנון (&quot;המוח פליי חיים הדמיה שלב Electrophysiology&quot;: &quot;זבובים&quot;) כדי להתאים למבוגרים תסיסנית, המאפשר חוטם שלה כדי לנוע בחופשיות תוך המוח שלה חשוף אמבטיה עבור Ca 2 + הדמיה דרך העדשה טבילה במים . הזבובים מתאים גם סוגים רבים של ניסויים חיים על המוח לעוף כמו הקלטה אלקטרו או זמן לשגות הדמיה של מורפולוגיה הסינפטי. כי את התוצאות של הדמיה חיה יכול להיות מתואמים ישירות עם התנהגות PER בו זמנית, מתודולוגיה זו יכולה לספק מערכת ניסיונית מצוינת ללמוד עיבוד מידע של רשתות נוירונים, ואיך זה גפעילות ellular מצמידים לתהליכים פלסטיק זיכרון.

זבוב הפירות,<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt;, חוטם שלה משתרע על האכלה, להגיב לגירוי סוכר חוטם שלה או שורש הרגל. אני שילבו תצפיות על התגובה הרחבה חוטם (PER) עם טכניקת הדמיה סידן, מאפשר לנו לפקח על הפעילות של הנוירונים במוח, בעת ובעונה אחת עם תצפית התנהגותית.

כדי לחקור רשתות נוירונליות במונחים של תפקודן בהתנהגות, עלינו לנתח כיצד פועלים הנוירונים כאשר נוצר כל דפוס התנהגותי. לפיכך, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנטר פעילות נוירונלית באמצעות דימוי סידן במקביל לתצפית על התנהגות הזנה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנסת זבוב למכשיר הזבובים. לאחר מכן, ראש הזבוב מנותח כדי לחשוף את המוח.לאחר מכן, מניחים את מערך הזבוב עם הזבוב המנותח עלבמת המיקרוסקופ. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא גירוי של ה-proboscis באמצעות פתיל סוכר. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הפעלה של נוירון מזוהה באמצעות דימות סידן, במתאם עם פריסת ה-proboscis שנמדדה באמצעות צילום וידאו של ההתנהגות.הרעיון לשיטה זו עלה בראשי לראשונה כאשר חשבתי על עיניהם של בובים פועמים השוחים על פני המים. לבובים יש עיניים מפוצלות והם יכולים לראות הן מעל פני המים והן מתחתיהם. נקודה מורכבת בניסוי שלי היא שהמוח וה-SCUs קרובים זה לזה, אך אם הם מופרדים כראוי, בדומה לעיניהם של הבובים, נוכל להשאיר את ה-SCUs יבשים בזמן שהמוח חשוף בלוויין.בשלב זה יצרתי מחיצה פשוטה מאוד ממש מעל ה-SCUs כדי להפריד בין הפנים היבש לבין מקום הרוחב. יש לעצב פלטפורמה ממכסה של כלי פלקון בנפח 35 מילימטר על ידי המסת הדופן הצדדית וגילופה כדי ליצור זווית ועובי מתאימים. קדחו חור בפלטפורמה לקבלת ראש הזבוב, כך שחלקי הפה יהיו חשופים בחופשיות לחלקו החיצוני של התא. חיתכו את קצהו של טיפ פקטור (pipette man tip) ברוחב שיהיה מספיק כדי לקבל את גוף הזבוב, ולאחר מכן הדביקו את הטיפ לפלטפורמה.לאחר הרעבת זבוב בוגר למשך 24 שעות בטמפרטורה של 25 °C, הרדמו על ידי העברתו באמצעות פינצטה לשפופרת פלסטיק של 15 ml המוצבת על קרח. הכניסו את הזבוב לתא הזבובים ודחפו אותו בעדינות פנימה עד אשר לא יוכל להזיז את עצמו.אטמו את החלקים המקיפים את ה-proximal proboscis או את ה-rostrum לקצה הפנימי של החור על ידי מריחת כמות קטנה של דבק לפתיה באור (light curing glue) לצדדים ומעל ה-rostrum, תוך שימוש בריסון או בכלי דומה כדי לפרוס את הדבק בזהירות. מרחו את הדבק גם מהחלק הפנימי של הזבובים אל החלל שבין החלק הגבי (dorsal) של הראש לבין הקצה הפנימי של החור. לבסוף, הקשחו את הדבק באמצעות ההארה החלשה ביותר של אור כחול המספיקה להקשחה, כדי למנוע נזק לזבוב.כדי לייצב את ראשו של הזבוב ולחשוף את החלק הוונטרלי של ה-SOG, הצמידו חוט שיחזיק את ה-rostrum במצב מורם חלקית. כאשר הזבוב מקובע במקומו, מלאו את פני הפלטפורמה בתמיסת סלין נטול סוכרוז. פתחו את קפסולת הראש כדי לחשוף את ה-SOG באמצעות להב טונגסטן ופינצטה בעלת קצוות מחודדים, אותה אנו מכנים "הפינצטה המחודדת".מספריים רפואיים (Scis zips). זוהי הדגמה של מספריים רפואיים, הגוזרים סיב ממגבון Kim לצורך השוואה. הפעולה מבוצעת תחילה עם מספרי איריס בשדה הראייה, ולאחר מכן מול סרגל מדורג של מילימטר אחד.ראשית, באמצעות להב טונגסטן, בצעו חתך דרך הקצה האחורי. לאחר מכן, חתכו דרך הדפנות הצדדיות והקצה הקדמי באמצעות פינצטה מחודדת. הרימו את פיסת העור (cuticle) החתוכה עם הפינצטה והסירו אותה.גזרו את המחושים ואת עצבי המחושים באמצעות הפינצטה. לאחר מכן, הסירו באופן סלקטיבי את כיסי האוויר שבין ה-SOG לבין הקוטיקולה (cuticle) כדי לייצב את המוח ולמנוע ארטיפקטים של תנועה. בשלב הבא, גזרו את הוושט בקצה הפונה לכיוון הלוע ובקצה הנכנס ל-SOG, כדי להסיר את הקשר בין הלוע לבין המוח.לאחר זיהוי והוצאה של שריר 16,נתקו כל קנה נשימה המחבר בין המוח לבין הקוטיקולה. הניחו את הזבובים על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקאלי מסוג spinning disc, ועברו לעדשת טבילה במים לצורך הדמיה. לאחר מכן, בצעו חיתוך אופטי בודד בתדר של 4 hertz עם זמן חשיפה של 122 milliseconds, תוך שימוש בלייזר עירור ב-491 nanometer תוך התמקדות באזור העניין.השתמשו במחט של מזרק עם פתיל קטן של נייר יפני הבולט מהקצה כדי להגיש סוכרוז לזבוב. פלטו טיפה קטנה של תמיסת סוכרוז על הפתיל, ולאחר מכן שאבו אותה באמצעות מזריק המחובר למחט דרך צינור גמיש, תוך שימוש במניפולטור עם ג'ויסטיק להחזקת המחט.הנח את פתיל נייר הספיגה המושרה על קצה ה-probus, אך לדקה בלבד, וזאת כדי למנוע רוויה. עקוב אחר תגובת ההארכה של ה-PROBUS או אחר התנהגות ה-PER באמצעות מצלמת CCD המחוברת למיקרוסקופ דיסקציה בו-זמנית עם דימות סידן, והקפד לאסוף את הנתונים בתוך שעה אחת מהדיסקציה.מוצגת כאן תגובת התארכות טיפוסית של prob Bois לגירוי באמצעות WIC המכיל 100 millimolar סוכרוז. הפתרון המימי צולם באמצעות לייזר של 491 nanometer עבור פלואורסצנציית G CAMP. דימוי סימולטני של סידן במהלך התנהגות תגובת ההתארכות של prosa, המוצג כאן תחילה לפני ואז אחרי הגירוי, מאפשר ויזואליזציה של תגובות GAMP 3.0 המושרות על ידי סוכרוז בנוירון המוטורי של שריר הפרוטראקטור של ה-rostrum.בשלב של כימות מצב הכוכב, תגובת ה-GAMP 3.0 המושרה על ידי סוכרוז מראה כי נוירוני המוטורה מגיבים לגירוי סוכרוז בעלייה חדה בفلואורסצנציה, ולאחריה שלב התאוששות של מספר שניות חזרה לקו הבסיס. פלטפורמת הזבובים מאפשרת שימוש בשיטות אחרות כגון אלקטרופיזיולוגיה, אופטוגנטיקה, פסיכוגנטיקה, או הפעלה כימית של נוירונים, או דימויי TimeLapse במעבדה של מבנים המסומנים ב-GFP, על מנת לענות על שאלות נוספות כגון הקשר בין פלסטיות סינפטית לבין זיכרון.

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

סרטון זה מתאר הדמיית סידן in vivo בנוירונים דרוזופילה באמצעות GCaMP. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לתעד שינויים בפלואורסצנטיות GCaMP מנוירונים בגוף פטריות במהלך ניסוי מיזוג ריח.

דרוזופילה אין ויוו דימות סידן: שיטה לדימות פונקציונלי של פעילות עצבית

סרטון זה מציג את המושגים מאחורי דימות סידן וכולל פרוטוקול לדוגמה להדמיית הילוך מהיר של תולעים הכלולות בבארות אגרוז יצוקות.

הדמיית סידן: שיטה להמחשת פעילות עצבית ב- C. elegans חי

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית סידן בתאי עצב בודדים של Caenorhabditis elegans המתנהגים באמצעות חלבוני כתב פלואורסצנטיים מקודדים גנטית. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהדמיית תנועת תולעים ומדידת יחסי פלואורסצנטיות של כתב מתאי עצב כדי לקשר בין רמות הסידן התוך-תאיות לפעילות עצבית ושינויים התנהגותיים במהלך הטלת ביצים.

הדמיית סידן בתאי עצב בודדים המווסתת את התנהגות הטלת הביצים ב- Caenorhabditis elegans

סרטון זה מדגים שיטה להדמיית סידן in vivo באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בזבובים. הוא מתאר את השלבים להכנת הזבובים למיקרוסקופיה, ביצוע מיזוג חוש הריח, והדמיית זרימת סידן הנגרמת על ידי ריח.

ב Vivo הדמיית סידן באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בדרוזופילה מלנוגסטר

מקור: Ishimoto, H. et. al., הדמיית סידן ex vivo להמחשת תגובות המוח לאיתות אנדוקריני בדרוזופילה. J. Vis. exp. (2018)}{{}}} {{}}} סרטון זה מדגים הדמיית סידן למחקרDrosophila תגובות מוח לנוירופפטידים. נוירונים המבטאים אינדיקטור סידן פלואורסצנטי חושפים דינמיקת סידן תוך תאית ותגובות תפקודיות למולקולות איתות.

הדמיית סידן ex vivo לחקר תגובות המוח של דרוזופילה לנוירופפטידים

הקלטות ארוכות טווח תאיים בו זמנית משני neuropiles המוח שונה או שני קטעים אנטומיים שונים הוקמו בדבורי דבש. הקלטות אלה מאפשרות החקירה של היבטים זמניים של עיבוד עצבי על פני אזורים שונים במוח בנוירון הבודד, כמו גם ברמת ההרכב בבעלי חיים מתנהגים.

הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש

הרגליים הקדמיות והפרובוסקיס של דרוזופילה מכילים רפרטואר עשיר של נוירונים חושיים טעמיים. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בהדמיית סידן כדי למדוד תגובות פיזיולוגיות מנוירונים חושיים ברגל הקדמית וחוטם של זבובים חיים ביישום אקסוגני של פרומון טעם.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

למדו לעקוב אחרי פעילות נוירונים ב-Drosophila melanogaster בעת התנהגות אכילה באמצעות הדמיית סידן. השיטה מאפשרת לקשר בין הפעלה עצבית לתגובת האכלה בזבובי פירות.

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster

גלה סרטונים נוספים