הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster
26 באפריל 2012
זבוב הפירות, תסיסנית melanogaster, חוטם שלה משתרע על האכלה, להגיב לגירוי סוכר חוטם שלה או שורש הרגל. אני שילבו תצפיות על התגובה הרחבה חוטם (PER) עם טכניקת הדמיה סידן, מאפשר לנו לפקח על הפעילות של הנוירונים במוח, בעת ובעונה אחת עם תצפית התנהגותית.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנטר פעילות נוירונלית באמצעות דימוי סידן במקביל לתצפית על התנהגות הזנה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנסת זבוב למכשיר הזבובים. לאחר מכן, ראש הזבוב מנותח כדי לחשוף את המוח.
לאחר מכן, מניחים את מערך הזבוב עם הזבוב המנותח עלבמת המיקרוסקופ. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא גירוי של ה-proboscis באמצעות פתיל סוכר. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הפעלה של נוירון מזוהה באמצעות דימות סידן, במתאם עם פריסת ה-proboscis שנמדדה באמצעות צילום וידאו של ההתנהגות.
הרעיון לשיטה זו עלה בראשי לראשונה כאשר חשבתי על עיניהם של בובים פועמים השוחים על פני המים. לבובים יש עיניים מפוצלות והם יכולים לראות הן מעל פני המים והן מתחתיהם. נקודה מורכבת בניסוי שלי היא שהמוח וה-SCUs קרובים זה לזה, אך אם הם מופרדים כראוי, בדומה לעיניהם של הבובים, נוכל להשאיר את ה-SCUs יבשים בזמן שהמוח חשוף בלוויין.
בשלב זה יצרתי מחיצה פשוטה מאוד ממש מעל ה-SCUs כדי להפריד בין הפנים היבש לבין מקום הרוחב. יש לעצב פלטפורמה ממכסה של כלי פלקון בנפח 35 מילימטר על ידי המסת הדופן הצדדית וגילופה כדי ליצור זווית ועובי מתאימים. קדחו חור בפלטפורמה לקבלת ראש הזבוב, כך שחלקי הפה יהיו חשופים בחופשיות לחלקו החיצוני של התא. חיתכו את קצהו של טיפ פקטור (pipette man tip) ברוחב שיהיה מספיק כדי לקבל את גוף הזבוב, ולאחר מכן הדביקו את הטיפ לפלטפורמה.
לאחר הרעבת זבוב בוגר למשך 24 שעות בטמפרטורה של 25 °C, הרדמו על ידי העברתו באמצעות פינצטה לשפופרת פלסטיק של 15 ml המוצבת על קרח. הכניסו את הזבוב לתא הזבובים ודחפו אותו בעדינות פנימה עד אשר לא יוכל להזיז את עצמו.
אטמו את החלקים המקיפים את ה-proximal proboscis או את ה-rostrum לקצה הפנימי של החור על ידי מריחת כמות קטנה של דבק לפתיה באור (light curing glue) לצדדים ומעל ה-rostrum, תוך שימוש בריסון או בכלי דומה כדי לפרוס את הדבק בזהירות. מרחו את הדבק גם מהחלק הפנימי של הזבובים אל החלל שבין החלק הגבי (dorsal) של הראש לבין הקצה הפנימי של החור. לבסוף, הקשחו את הדבק באמצעות ההארה החלשה ביותר של אור כחול המספיקה להקשחה, כדי למנוע נזק לזבוב.
כדי לייצב את ראשו של הזבוב ולחשוף את החלק הוונטרלי של ה-SOG, הצמידו חוט שיחזיק את ה-rostrum במצב מורם חלקית. כאשר הזבוב מקובע במקומו, מלאו את פני הפלטפורמה בתמיסת סלין נטול סוכרוז. פתחו את קפסולת הראש כדי לחשוף את ה-SOG באמצעות להב טונגסטן ופינצטה בעלת קצוות מחודדים, אותה אנו מכנים "הפינצטה המחודדת".
מספריים רפואיים (Scis zips). זוהי הדגמה של מספריים רפואיים, הגוזרים סיב ממגבון Kim לצורך השוואה. הפעולה מבוצעת תחילה עם מספרי איריס בשדה הראייה, ולאחר מכן מול סרגל מדורג של מילימטר אחד.
ראשית, באמצעות להב טונגסטן, בצעו חתך דרך הקצה האחורי. לאחר מכן, חתכו דרך הדפנות הצדדיות והקצה הקדמי באמצעות פינצטה מחודדת. הרימו את פיסת העור (cuticle) החתוכה עם הפינצטה והסירו אותה.
גזרו את המחושים ואת עצבי המחושים באמצעות הפינצטה. לאחר מכן, הסירו באופן סלקטיבי את כיסי האוויר שבין ה-SOG לבין הקוטיקולה (cuticle) כדי לייצב את המוח ולמנוע ארטיפקטים של תנועה. בשלב הבא, גזרו את הוושט בקצה הפונה לכיוון הלוע ובקצה הנכנס ל-SOG, כדי להסיר את הקשר בין הלוע לבין המוח.
לאחר זיהוי והוצאה של שריר 16,נתקו כל קנה נשימה המחבר בין המוח לבין הקוטיקולה. הניחו את הזבובים על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקאלי מסוג spinning disc, ועברו לעדשת טבילה במים לצורך הדמיה. לאחר מכן, בצעו חיתוך אופטי בודד בתדר של 4 hertz עם זמן חשיפה של 122 milliseconds, תוך שימוש בלייזר עירור ב-491 nanometer תוך התמקדות באזור העניין.
השתמשו במחט של מזרק עם פתיל קטן של נייר יפני הבולט מהקצה כדי להגיש סוכרוז לזבוב. פלטו טיפה קטנה של תמיסת סוכרוז על הפתיל, ולאחר מכן שאבו אותה באמצעות מזריק המחובר למחט דרך צינור גמיש, תוך שימוש במניפולטור עם ג'ויסטיק להחזקת המחט.
הנח את פתיל נייר הספיגה המושרה על קצה ה-probus, אך לדקה בלבד, וזאת כדי למנוע רוויה. עקוב אחר תגובת ההארכה של ה-PROBUS או אחר התנהגות ה-PER באמצעות מצלמת CCD המחוברת למיקרוסקופ דיסקציה בו-זמנית עם דימות סידן, והקפד לאסוף את הנתונים בתוך שעה אחת מהדיסקציה.
מוצגת כאן תגובת התארכות טיפוסית של prob Bois לגירוי באמצעות WIC המכיל 100 millimolar סוכרוז. הפתרון המימי צולם באמצעות לייזר של 491 nanometer עבור פלואורסצנציית G CAMP. דימוי סימולטני של סידן במהלך התנהגות תגובת ההתארכות של prosa, המוצג כאן תחילה לפני ואז אחרי הגירוי, מאפשר ויזואליזציה של תגובות GAMP 3.0 המושרות על ידי סוכרוז בנוירון המוטורי של שריר הפרוטראקטור של ה-rostrum.
בשלב של כימות מצב הכוכב, תגובת ה-GAMP 3.0 המושרה על ידי סוכרוז מראה כי נוירוני המוטורה מגיבים לגירוי סוכרוז בעלייה חדה בفلואורסצנציה, ולאחריה שלב התאוששות של מספר שניות חזרה לקו הבסיס. פלטפורמת הזבובים מאפשרת שימוש בשיטות אחרות כגון אלקטרופיזיולוגיה, אופטוגנטיקה, פסיכוגנטיקה, או הפעלה כימית של נוירונים, או דימויי TimeLapse במעבדה של מבנים המסומנים ב-GFP, על מנת לענות על שאלות נוספות כגון הקשר בין פלסטיות סינפטית לבין זיכרון.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הפעילות העצבית של Drosophila melanogaster במהלך התנהגות האכילה באמצעות טכניקות של דימוי סידן. על ידי תצפית על התגובה של הושטת השפיר (PER) לגירויי סוכר, חוקרים יכולים להקרין בין הפעלה עצבית לבין תגובות התנהגותיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- דימות סידן
רקע
- Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל לחקר תפקוד עצבי.
- תגובת הרחבת החרטום (PER) היא התנהגות האכלה מתועדת היטב.
- דימוי סידן מאפשר תצפית בזמן אמת על פעילות עצבית.
- הבנת התגובות העצביות יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני האכלה.
מטרת המחקר
- לניטור פעילות עצבית במהלך התנהגות האכלה בזבובים.
- להקמת קורלציה בין הפעלה עצבית לבין תגובת הושטת החרטום (proboscis extension response).
- לפיתוח שיטה לתצפית התנהגותית ולדימות בו-זמנית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של הזבוב לחשיפת המוח.
- דימוי סידן באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי בעל דיסק מסתובב (spinning disc).
- גירוי של החרטום באמצעות תמיסת סוכר.
- הקלטת וידאו של ההתנהגות לצורך ניתוח תגובת פריסת החרטום (proboscis extension response).
תוצאות עיקריות
- דימויי סידן חשפו הפעלה עצבית בתגובה לגירויי סוכר.
- התנהגות של פריסת המזהב נוטרה בהצלחה במקביל לפעילות העצבית.
- התוצאות הראו עלייה חדה בפלואורסצנציה בנוירונים מוטוריים במהלך PER.
- השיטה מאפשרת חקירה נוספת של פלסטיות סינפטית וזיכרון.
מסקנות
- המחקר מציע גישה חדשנית לבדיקת פעילות עצבית בהתנהגות הזנה.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים העצביים העומדים בבסיס תגובות ההזנה.
- ניתן להתאים את השיטה לטכניקות ניסיוניות אחרות במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מתודולוגיה זו מאפשרת קורלציה ישירה בין פעילות עצבית לבין תוצרי התנהגות כמותיים במודל ניתן לטיפול גנטי, ובכך תומכת בתיקוף מטרה (target validation) באמצעות חקירה פונקציונלית של מעגלים עצביים. על ידי קישור דינמיקת איתותי סידן לתגובת פרישת תבלית (proboscis extension response)—מדד פנוטיפי מדיד—הגישה מספקת הפחתת סיכונים מכנית (mechanistic de-risking) עבור סריקת תרכובות נוירו-אקטיביות. היא מבססת מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר ויסות התנהגות ההאכלה, ומעניקה ביטחון ניבוי לגבי מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים בשלב מוקדם של תהליך הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות ניטור בזמן אמת של הפעלה עצבית בנוירונים מזוהים של מרכזי האכילה במהלך התנהגות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות דימות ותצפית התנהגותית בו-זמנית, ובכך מבהיר את מעורבותם של נתיבים ב-PER.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי מתאם בין מודולציה של המטרה לבין הפלט ההתנהגותי, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בבחירת מטרות עצביות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות (נוירונים מסוג SOG) לסריקת תרכובות בהמשך עם קריאות כמותיות של זרם סידן.
- שחזור: תיקנון מדידת פעילות נוירונלית באמצעות פלואורסצנציית GCaMP, המאפשר הערכה מהימנה של תרכובות לאורך ניסויים שונים.
- יכולת הרחבה (Scalability): תכנון הפלטפורמה (FLIES) מאפשר שימוש חוזר לאלקטרופיזיולוגיה, אופטוגנטיקה או דימות Time-lapse, ובכך תומך בשילוב של בדיקות רב-מודאליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדגים את ויסות התנהגות ההאכלה, תהליך שמור הרלוונטי לזיהוי מטרות לטיפול בהפרעות מטבוליות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי (פעילות עצבית) לוולידציה פרה-קלינית על ידי קישור פלסטיות סינפטית ותהליכי זיכרון לפלט התנהגותי.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות המשך (go/no-go) על ידי הדגמת הזיקה בין המטרה להתנהגות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של תוכניות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אפשור בחינה מונהית-השערות של רשתות נוירונליות, כאשר התוצאים מסייעים בזיהוי מובילים (leads) באמצעות קורלציה תפקודית בין המטרה להתנהגות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי ויזואליזציה של תגובות סידן המושרות על ידי סוכרוז בנוירונים מוטוריים במהלך PER.
- סריקה: מספק מערכות מוכנות לבדיקה עם מדידות כמותיות של פעילות נוירונלית בזמן אמת, התואמות לסריקת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר תוצרי קריאה מבוססי פלואורסצנציה ונתוני וידאו התנהגותיים המאפשרים ניתוח קורלציה בין הפעלה עצבית לבין עוצמת ה-PER.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות חקירת פלסטיות סינפטית ומנגנוני זיכרון העומדים בבסיס תגובות התנהגותיות מתמשכות.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמת FLIES משמשת כיכולת ניתנת לשימוש חוזר עבור דימוי מוח חי ביוזמות של נוירופרמקולוגיה, גנטיקה ומיפוי מעגלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות תצפית ישירה על הצימוד העצבי-התנהגותי במערכת נגישה גנטית.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות הכנת זבובים מקובעי-תנועה והגשת גירויים מבוקרת, תוך מזעור השונות.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי הפחתת אי-ודאות מכניסטית במעורבות של מטרות עצביות ובמודולציה של נתיבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם-סיכון של מטרות המדגימות קורלציה חזקה בין פעילות עצבית לבין פנוטיפים של התנהגות האכלה.
שיקולי יישום
- נדרש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, מיקרו-כירורגיה וטכניקות של דימות סידן למיקוד SOG.
- תלוי במיקרוסקופיה קונפוקלית מסוג spinning disc עם עדשת טבילה במים ועירור תואם GCaMP (491 nm).
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור הגשת הגירוי (פתיל סוכרוז) ודירוג התנהגותי (הקלטת וידאו של PER) כדי להבטיח עקביות של הנתונים.
- שיקולי התאמה כוללים שינוי של פלטפורמת FLIES עבור מטרות עצביות שונות או בדיקות התנהגותיות מעבר להרחבת החרטום (proboscis extension).
- מגבלות מעשיות כוללות הגבלות זמן של הדיסקציה (איסוף נתונים בתוך שעה אחת) וארטיפקטים אפשריים של תנועה למרות מאמצי הייצוב.
