בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ"א

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים כיצד להרכיב ולהשתמש בחיישן נזקי DNA בעל סימון כפול, המסמן שני סוגים עיקריים של שברים ב-DNA בחתכי רקמה. החיישן מורכב מאוליגונוקלאיד DNA 30-mer המסומן כפולה ב-ZI וב-Rumine, ומאנזים vaccinia topoisomerase I (או vac topo) המרכיב את עצמו. כאשר VAC topo נקשר ל-30-mer, פעולת המכונה מתחילה כאשר topo שוב ושוב מ 끊ה את האוליגונוקלאיד בקצה ה-3' של רצף הזיהוי, מה שמוביל ליחידה מופעלת של vac topo המסומנת ב-fitzy ולסיכת ראש (hairpin) חופשית המסומנת באמין.

בשל נוכחות קבוצת הידרוקסיל טרמינלית במיקום '3, היחידות הן בעלות זמן חיים קצר ומורכבות במהירות בחזרה למבנה המקורי, אשר לאחר מכן נשסע. בהיעדר שברים נוספים ב-DNA מחוץ למולקולה, שתי יחידות אלו נפרדות ומתחברות באופן רציף ומחזורי. כאשר החיישן המולקולרי מוחל על חיתוכי רקמה עם נזק ל-DNA, יחידת הגילוי המסומנת ב-Fitz נקשרת באופן סלקטיבי לשברים של DNA בעלי קצוות קהים עם הידרוקסיל במיקום '5.

יחידת הגילוי המסומנת ב-R domine תקשור למקטע קהה בעל פוספט בקצה חמישי. בנוכחות T four DNA Ligase, מתקבלות תוצאות המראות את נוכחותם והפיזור של שברים ב-DNA מסוג one ו-D'S two בתאים, על בסיס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לזיהוי HESIs, כגון tunnel, הוא שהיא ספציפית יותר ומספקת מידע נוסף על ידי סימון של שלבים אוטונומיים ופאגוציטיים של אפופטוזיס.

מנקודת מבט של ננו-טכנולוגיה, החיישן מדגים גישה מבוססת-ביולוגיה המתאימה מבנים וארכיטקטורות ביולוגיות ממשיות לבנייה של התקנים בקנה מידה מולקולרי שאינם רעילים. באופן כללי, אנשים שאינם מוצגים לשיטה זו עשויים להתקשות, מכיוון שהצלחתה תלויה בשימוש בהכנה פעילה מאוד של Toro SOM ובעיבוד נכון של החתכים כדי למנוע עיכול יתר על ידי proteinase K. יש להכין את חתכי הרקמה עבור הליך זה לפני הרכבת ההתקן המולקולרי. חתכים בעובי של חמישה עד שישה מיקרון שנגזרו מ-paraldehyde.

מומלץ להשתמש בבלוקי רקמה מקובעים בפרפין. הניחו את השקופית עם חיתוך הרקמה במעמד שקופיות והמיסו את השעווה בקסילן למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, העבירו לאמבט קסילן רענן למשך חמש דקות נוספות.

בצעו רהידרטציה לחתך על ידי העברת השקופית בריכוזי אתנול מדורגים: אתנול 96% פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם, אתנול 80% למשך חמש דקות, ולאחר מכן במים.

פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר הרטבה מחדש, עכל את הפרית בעזרת proteinase K. השתמש ב-100 µL של תמיסה בריכוז 50 µg/mL לכל פרית והדגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח. בהתאם לסוג הרקמה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמן העיכול, אך יש להיזהר ממסייכול יתר, שכן הוא גורם להיעלמות האות ולהרס הפרית כאשר העיכול מסתיים.

שטפו את השקופית במים מזוקקים פעמיים, למשך 10 דקות בכל פעם. מרחו 2%BSA לחסימה מוקדמת (pre blocking) והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתא לחות. במהלך זמן זה, הרכיבו את המכונה המולקולרית כפי שמוצג בהמשך סרטון זה.

כל הריאגנטים להרכבת המכונה המולקולרית מותאמים לנפח כולל של 25 microliters, אשר מספיק לגילוי בודד בחתך רקמה בגודל ממוצע. ניתן להגדיל את הנפח לפי הצורך בפסולת פלסטיק קטנה. ערבבו את הריאגנטים הבאים לפי הסדר הזה באמצעות מים מזוקקים.

15% polyethylene glycol 8,000 T ארבעה DNA Ligase buffer, אוליגונוקלאוטיד עם סימון כפול, vaccinia topoisomerase one ו-T ארבעה DNA Ligase ערבוב עדין באמצעות פיפטינג. המבנה המולקולרי יתרקב עצמית כמעט באופן מיידי בתמיסה זו וניתן להשתמש בו מיד בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל את הליך סימון השברים ב-DNA, שאבו את תמיסות החסימה המוקדמת מהשקופית.

העבירו 25 µL של תערובת התגובה המלאה לכל חלק. הניחו כיסוי זכוכית פלסטי מעל החלק והכניסו את השקופית לתא לח. הגנו מהאור על ידי עטיפת התא בנייר אלומיניום והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

למרות שניתן להבחין באותות של ליגז (ligase) ושל טופו (topo) לאחר דגירה של שעה אחת, במקרים רבים ניתן להגביר את אות הליגז באופן נוסף. כדי להגביר את האות, יש להחיל שוב את תערובת התגובה ללא vac topo ואוליגנוקלאוטיד 1, אך עם אוליגנוקלאוטיד 3 ו-T4 DNA Ligase, להניח כיסוי פלסטיק על החתך ולדגור בתא לח כדי למנוע התייבשות למשך 18 שעות. למחרת, בטמפרטורת החדר, יש לטבול בעדינות את השקופית בצורה אנכית בתוך כלי Coplan המכיל מים בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כיסוי הפלסטיק.

לאחר מכן, שטפו את הפריס במים מזוקקים שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. שטפו את הפריס בבופר סודיום ביקרבונט. שטיפה זה, המכיל תמיסה בסיסית, מגבירה את הפלואורסצנציה של Fitzy, הרגישה ל-pH ונחלשת באופן משמעותי ב-pH הנמוך משבעה.

לבסוף, כסו את החיתוך בתמיסת מניעת דהייה (anti fading solution) המכילה גם DPI לצורך ספירה וצביעת גרעינים, והנחו זכוכית כיסוי. החיתוכים מוכנים כעת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. באיור זה מוצג חיתוך רקמה של תימוס שעבר טיפול בדקסמתזון, שבו המכונה המולקולרית זיהתה שברים של DNA בעלי קצוות תמירים מסוג DNAs one ו-DNAs two באזורים הקורטיקליים של התימוס העוברים אפופטוזה; פלואורסצנציה ציטופלזמית ירוקה המצביעה על שברים מסוג DNA's two, ומקרופאגים קורטיקליים המפרקים חומר גרעיני של תאי תימוס אפופטוטיים.

אות זה מופק על ידי vac topo והוא ממוקם בליזוזומים של FGA עם DNA המכיל הידרוקסיל במיקום פריים חמישי. שברים של גדיל כפול עם פלואורסצנציה אדומה המציינת סוג אחד של שברים ב-DNA מסמנים גרעינים של תימocytes אפופטוטיים שלא נבלעו על ידי מקרופאגים. מספרים מאסיביים של תימocytes עוברים אפופטוזיס בו-זמנית.

מלווה ביצירה של חמישה שברים כפולים של רצפי פוספט ראשוניים (prime phosphate doublet strand breaks) המודגשים באמצעות סימון מבוסס ליגז. שברים אלו ממוקמים בפריפריה הגרעינית ויוצרים תבניות דמויות טבעת. כל גרעיני התאים מופיעים בכחול, המודגשים באמצעות צביעה נגדית ב-dpi.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעולם לא לאפשר לחתכים להתייבש בין הוספות של תמיסות שונות. כמו כן, יש לשמור את כל התכשירי האנזימטיים על קרח לפני הוספת החתכים, ולהגן על הגששים הפלואורסצנטיים מהאור במהלך תגובת הסימון לאחר פיתוחה. הטכניקה אפשרה ויזואליזציה של כל שלבי הפירוק של תאי heto.

חיישן זה מהווה דוגמה לגישת הננוטכנולוגיה הירוקה לתכנון של חלקיקים, גששים ומכונות בקנה מידה ננומטרי. גישה זו משלבת רכיבים מלאכותיים עם חלקים של מכונות מולקולריות המופיעים בטבע. המטרה היא לבטל את הרעילות ואת התגובתיות הביולוגית השלילית של חומרי ננו מפוזרים מאוד אלו.