בידוד הרחבת האדם multiforme Glioblastoma גידול תאים שימוש Assay Neurosphere

מטרת פרוטוקול זה היא בידוד והרחבה של תאי גידול גליובלסטומה מולטיפורמיס אנושיים באמצעות שימוש בשיטת הנוירוספירות (neurospheres). מטרה זו מושגת תחילה על ידי קיצוץ של רקמת הגידול שנאספה, לאחר מכן ביצוע דיסוציאציה מכנית, ולבסוף זריעת התאים שהתקבלו לגדילה בתרבית נוירוספירות. בסרטון זה, נראה כיצד לבודד ולהרחיב תאים דמויי גזע מרקמת גידול גליובלסטומה אנושית באמצעות שיטת תרבית הנוירוספירות.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם לתרבית תאים מגידולים מוחיים אחרים, כמו גם מגידולים מוצקים כגון שדיים, ערמונית, כבד וריאה. אוקיי, בואו נתחיל. לאחר קבלת רקמת גידול ה-GBM שהוסרה בניתוח, מסירים את המדיום.

שוטפים את הגידול שתיים או שלוש פעמים באמצעות PBS סטרילי כדי להסיר מזהמים כגון דם ושאריות תאים. לאחר השטיפה, מניחים את הגידול שנכרת בתוך צלחת פטרי סטרילית. ראשית, חותכים את הגידול לחלקים קטנים יותר, לאחר מכן מעבירים חלק מרקמת הגידול לצלחת פטרי נפרדת וקוצצים את הרקמה לחתיכות זעירות באמצעות סכין מנתחים מספר 10.

פעולה זו תגדיל את שטח הפנים הזמין לדיסוציאציה אנזימטית. הקיצוץ עשוי להימשך בין דקה לשלוש דקות, בהתאם לגודל הגידול. כעת, הוסיפו 3 עד 5 ml של trypsin שחומם מראש לרקמה המקצוצת והעבירו אותה למבחנה סטרילית של 15 ml מסוג falcon.

הנח את המבחנה בנפח 15 Ml באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 15 דקות. נער את המבחנה בכל חמש דקות. כדי להבטיח עיכול רקמות טוב יותר, הוסף נפח שווה של מעכב טריפסין (trypsin inhibitor) כדי לעצור את התגובה.

הפעלה של ה-Trypsin מובטחת על ידי פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים. סבב את התו сусפנזיה בצנטריפוגה ב-800 RRP M או 110 G למשך חמש דקות. הסר את הנוזל העליון, ולאחר מכן השהה מחדש את המשקע ב-One ml של מצע בסיסי לתאי גזע עצביים, תוך הצמדת קצה הפיפט לתחתית המבחנה.

בצעו פיפטור מעלה ומטה שלוש עד שבע פעמים כדי לפרק גושים עד לקבלת תרחיף חלבי; פיפטור יתר עלול להוביל למות תאים. הניחו מסנן של 40 מיקרון על מבחנה של 50 ml. כעת הוסיפו 10 עד 15 ml של מצע בסיסי (basal medium) לתרחיף התאים וערבבו בעדינות. העבירו את תרחיף התאים דרך מסנן ה-40 מיקרון כדי להסיר פסוליות וגושים שאינם קשורי תאים.

בצעו צנטריפוגה לתאים ושאבו את העלייה. השעיו את התאים ב-1 עד 2 mls של מצע גידול מלא. לאחר מכן, בצעו פיפטינג עדין למעלה ולמטה כדי להומוגנ את התגובה.

ערבבו 10 µL של תרחיף תאים ב-90 µL של Trypan blue. ערבבו את התרחיף היטב והעבירו 10 µL ל-hemo.Cytometer. בצעו ספירת תאים כפי שמוצג כאן.

דרוש תרחיף של תאים בודדים ללא גושים כדי להגיע לספירת תאים מדויקת. אין לכלול תאים החיוביים לצבע טריפאן כחול. בצע את הספירה בעת זריעת התאים לבקבוק T 80.

הוסיפו 20 ml של מצע גידול מלא לתאי גזע עצביים למבחנה של 50 ml. הוסיפו כמות מתאימה של תרחיף תאים כדי להגיע לצפיפות של 200, 000 תאים ל-ml. כעת הוסיפו EGF כדי להגיע לריכוז סופי של 20 nanogram ל-ml.

הוסיפו 0.2% heparin בריכוז של מיקרוליטר אחד ל-ml. לבסוף, הוסיפו BFGF כדי להגיע לריכוז סופי של 10 nanogram ל-ml. ערבבו את התאים במצע גידול מלא המועשר בגורמי גדילה.

לאחר מכן, העבירו את התרחיף לבקבוק T 80 מסומן. את הבקבוק העבירו לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך שבעה עד 10 ימים. לאחר שמונה ימים בתרבית, הספירות גדלות באופן מלא ומוכנות למעבר (passaging).

אספו את תכולת הבקראח והעבירו למבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 ml. סובבו את התאים ב-800 RPM למשך חמש דקות. שאבו את העילוי, ולאחר מכן השעיו את המשקע ב-1 ml של טריפסין שחומם מראש.

דגרו את התאים במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שתי דקות. הוסיפו כמות שווה של מעכב טריפסין וערבבו היטב כדי להבטיח הפעלה. לאחר מכן, השקיעו את התאים.

הסיר את הנוזל העליון (supernatant) וסספנד מחדש את התאים ב-1 ml של מצע גידול מלא, תוך פיפטור עדין למעלה ולמטה כדי להומוגניзировать את סספנד התאים. בצע ספירת תאים כפי שתואר קודם לכן, כדי לזרוע את התאים בבקבוק T 80 עם 20 ml של מצע גידול מלא בתוך מבחנה של 50 ml. הוסף כמות מתאימה של סספנד תאים כדי להגיע לצפיפות של 50,000 תאים ל-ml.

כעת הוסיפו גורמי גדילה הכוללים E-G-F-B-F-G-F, והפרין בריכוז שתואר קודם לכן. ערבבו בעדינות את תרחיף התאים שהתקבל, לאחר מכן העבירו את התרחיף ל-T 80 והניחו באינקובטור למשך שבעה עד 10 ימים. להלן דוגמה לתרבית GBM ראשונית.

לאחר ארבעה ימים בשלב זה, ניתן לראות שהתאים שגשגים והחלו להיווצר כספירות. בשלב זה לא אמורים להופיע מקבצים כדוריים גדולים של תאים. הופעתם תעיד על הכנה לא נכונה של הרקמה.

לאחר שהייה בתרבית של שבעה עד 10 ימים, נוצרו ספירות (spheres) בגדלים משתנים; כאשר הספירות הגיעו לקוטר ממוצע של 150 עד 200 מיקרון, הן מוכנות למעבר (passage). זוהי דוגמה למעבר של תרבית GBM לאחר שמונה ימים. שוב, ניתן לראות ספירות בגדלים שונים; ספירות בריאות מציגות דוקרנים מיקרוסקופיים להיקפן.

הכנת סספנסיות תאים בודדים היא שלב קריטי בכל תרבית של ספירות (spheres). אחרת, עלולות להופיע אגרגציות של תאים אפילו יום לאחר זריעת התאים. אגרגציות אלו עשויות להיחשב כספירות, אך יש לציין כי נדרש שבוע אחד לפחות כדי שתאים המיועדים לכך יגבשו ספירות אמיתיות.

כמות השאריות בתרביות של כדורי גידול ראשוניים משתנה בהתאם לגורמים רבים, כגון מקור הרקמה, מידת הדיוק שבה הוסר הרקמה וכן טכניקת עיבוד הרקמה. אנו מקווים שתמצאו סרטון זה מועיל ומאחלים לכם הצלחה בניסויים שלכם.