Name: בידוד הרחבת האדם multiforme Glioblastoma גידול תאים שימוש Assay Neurosphere (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למדו לבודד ולהרחיב תאי גזע מגידולי גליובלסטומה אנושיים באמצעות שיטת Neurosphere. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר ביולוגיית הגידול ופיתוח מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממרכז פלורידה לחקר גידול במוח; פרסטון א ג&#39;וניור וולס מרכז לטיפול גידול במוח.

1. אוסף של רקמות GBM ראשוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mutliforme גליובלסטומה (GBM) הגידול מתקבל חולה בסרטן ועל העוברים ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההסדרים חייב להיעשות עם צוות נוירוכירורגיה. הנוירוכירורג תעמיד את הגידול GBM resected בשפופרת בגודל המתאים המכיל בתאי גזע עצביים (NSC) בינוני הבסיס בתוספת אנטיביוטיקה 10-15% (Peniciline / Streptomycine). בינוני הקרה יש לספק לחדר הניתוח על ידי המעבדה. לחלופין, קר HEPES שנאגרו מדיום חיוני מינימום (שולי) או שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) עם ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה יכול לשמש גם למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת הגידול resected מועבר למעבדה על הקרח והניחו מתחת למכסה המנוע. </li></ol> 2. דיסוציאציה של הגידול הראשוני לתוך השעיה תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עודף בינוני המקורי / PBS יוסר הצינור הבז ואת המדגם הוא שטף 2-3 פעמים עם 5-10mאני המדיום PBS / NSC הבסיס להסיר דם ופסולת. PBS / בינוני מסירים את רקמת הגידול GBM מושם בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה היא לחתוך לחתיכות קטנות טחון עם להב מס &#39;10 אזמל לחתיכות קטנות כדי להגדיל את שטח הפנים של תהליך trypsinization. ממינסינג יכול לקחת 1-3 דקות, בהתאם לגודל של הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרקמה טחון הוא trypsinized ב 5 מ&quot;ל 3% של טרום חימם 0.05 טריפסין-EDTA במשך 10-15 דקות אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. פיפטה אלקטרוני משמש להעברת החלקים גידולים זעירים טריפסין לתוך צינור פלקון 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח שווה של מעכבי טריפסין סויה נוסף כדי לעצור את התגובה האנזימטית טריפסין לאחר תקופת דגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איון טריפסין מובטחת על ידי pipetting ההשעיה למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, ההשעיה היא pelleted על ידי centrifuging ב 800rpm (110g) של 5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant נמחקת ואת פיסות רקמה resuspended ב 1ml של סטרילית NSC baסאל בינוני. הגושים הם מנותקים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה (3-7 פעמים) עד ההשעיה חלק חלבי תא בודד מושגת. מספר צעדים pipetting ישירות תלוי בגודל של חלקיקים ברקמה טחון. ניתוק מכני ארוך נמרץ יש להימנע כיוון שהוא עלול לגרום למוות של תאים ירידה היווצרות כדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר בלתי ניתק חתיכות ופסולת, 10-15 מ&quot;ל של מדיום הבסיס מתווסף צינור לבין השעיה תא מסונן דרך מסננת 40 מיקרון תא לשפופרת 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים המסוננים centrifuged ב 800rpm (110g) של 5min. Supernatant נמחקת לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Pelletted הם resuspended אז 1-2ml של המדיום NSC המלא ל ספירת תאים. </li></ol> 3. ספירת ו ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μL ההשעיה התא מתווסף μL 90 של 0.04% Trypan כחול בצינור Eppendorf 1ml. הערה: שני תאים המתאימים dilutions עשוי לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב את ההשעיה. 10 μL של תאים / תערובת trypan כחול מועבר hemocytometer כדי לספור צפיפות התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם מצופה במדיום NSC מלאה (תערובת של המדיום NSC NSC הבסיס, תוספת ריבוי ביחס 9:01) בתוספת 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF ו 1μl/ml הפרין של 0.2% (2μg/ml) ב מתאים בתרבית רקמה כלי. 5, 20 ו - 40 מ&quot;ל של מדיום המשמש צלוחיות T25, T80 ו T175, בהתאמה. אנטיביוטיקה ניתן להוסיף בינוני בריכוז של 1:100 כדי להקטין סיכוי של זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוק ממוקם להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 4. Passaging והרחבת תחומי נגזר GBM: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הגיעו neurospheres גודל ממוצע של 150-200 מיקרומטר קוטר, התרבות מוכן תת. התוכן של כל בקבוק מוסר והושמו tiss בגודל המתאים סטריליתצינור ue תרבות, centrifuged על 800 סל&quot;ד (110 גרם) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant מוסר לבין גלולה היא resuspended ב 1 מ&quot;ל של 0.05% טריפסין-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג trypsinization אופטימלי, השעיה התא מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 2-3 דקות. כדי להפסיק את פעילות טריפסין נפח שווה של מעכבי טריפסין סויה מתווסף ההשעיה התא ההשעיה התא pipetted בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים התא centrifuged ב 800 סל&quot;ד (110g) עבור 5 דקות. ואז, supernatant היא להסיר את התאים הם resuspended ב 1 מ&quot;ל של מדיום המל&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים מבוצעת כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מצופה בריכוז של 4 תאים 5x10 / מ&quot;ל במדיום המל&quot;ל להשלים בתוספת גורמי גדילה מצופה המתאים רקמה בגודל כלי תרבות כפי שמתואר בחלק הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neurospheres משניות נוצרות בימים 7-10 כאשר מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס לחified חממה עם 5% CO 2. </li></ol> 5. נציג תוצאות: לאחר ציפוי תאים בודדים שנקטפו מן רקמת הגידול GBM, גידול גזע דמויי תאים להתרבות וליצור אשכולות קטנים של תאים מורכב של תאים כמה ימים 3-4 (ראו וידאו איור 1). כמו אשכולות אלה גדלים, הם רוכשים צורה כדורית יותר, כך לפי 7-8 ימים, תחומי השלב הנכון בהיר עם קוטר ממוצע של טופס מיקרון 150-200 (ראו וידאו איור 2). בהגדלה גבוהה, בתחומים בריא בדרך כלל להפגין microspikes בפריפריה שלהם. לאחר כדור גדול כמו באשכולות 1-2 ימים לאחר תחילת התרבות בשל קיומה של אי - ניתק גושים בבית binging של התרבות ואסור לטעות כמו בתחומים נכון. כמות פסולת בתרבות הגידול העיקרי בתחום משתנה בהתאם למקור הראשוני של רקמת והאם זה כולל את כל רקמת המוח שמסביב. הכנה נכונה טכניקות רקמהכולל ניתוק האנזימטית מכני, סינון הבאים של המדגם עם כמות מספקת של המדיום יכול לגרום פסולת פחות בתרבות. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. GBM ראשוני בתחום תרבות 4 ימים לאחר ציפוי. גידול גזע דמויי תאים להתרבות וליצור אשכולות קטנים של תאים 3-4 ימים. הגדלה מקורי: 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="איור 2" /> באיור 2. המעבר תרבות אחת GBM כדור 8 ימים לאחר ציפוי. הגדלה מקורי: 20x.

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כדי לבודד גזע עצביים ועל ובתאים של מבוגר נורמלי מוח עוברית 1, 2, 3, 4 ו הגידול גם גזע דמויי תאים של רקמות סרטן כגון 5 הריאות, הערמונית, 6, 7 השד והמוח 8, 9 assay neurosphere כבר שימוש תכוף כפי השיטה של ​​בחירה. שימוש assay זה פשוט לשחזור, אפשר ליצור מספר בלתי מוגבל של תאים מרקמת הגידול resected המראים מאפיינים דומים כמו תאים סומטיים גזע; multipotency vivo לשעבר, את היכולת ליצור גידולים חדשים על ההשתלה, עצמית והתחדשות. תאים אלה יוכלו לשמש כדי לחקור את סרטן בסיסי ביולוגיה של התא, כולל תא אל תא אינטראקציות, וכן, בידול הגירה, הפלישה מוות של תאים. בנוסף, הגידול מבודדים גזע דמויי תאים לספק כלי רב ערך כדי ללמוד כיצד ליצור גידולים, התקדמות, נסיגה וגם לפענח את המנגנונים הסלולר הנובעת שבסופו של דבר יכול לספק תובנות טיפוליותאפשרויות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC בינוני בסל (אדם) </td><td> בינוני </td><td> תא גזע טכנולוגיות </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC הפצת תוספי (אדם) </td><td> בינוני תוספת </td><td> תא גזע טכנולוגיות </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.05-EDTA טריפסין </td><td> מגיב </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * ממ </td><td> מגיב </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> מרכיב שולי </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> H4034 </td><td> מרכיב שולי </td></tr><tr><td> * מים מזוקקים </td><td> מגיב </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** אני DNase </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** מעכב טריפסין סויה </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> פן / סטרפטוקוקוס </td><td> מגיב </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> מס &#39;10 אזמל להב </td><td> כירורגי כלי </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי </td><td> תרבות ware </td><td> BD פלקון </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים קטנים </td><td> כירורגי כלים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> תא מסננת </td><td> כברה </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 צפחת </td><td> תרבות ware </td><td> Nalge נוnc הבינלאומי </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 צפחת </td><td> תרבות ware </td><td> Nalge Nunc הבינלאומי </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות מ&quot;ל </td><td> תרבות ware </td><td> BD פלקון </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 צינורות מ&quot;ל </td><td> תרבות ware </td><td> BD פלקון </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> גורם צמיחה </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> גורם צמיחה </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> הפרין </td><td> גורם צמיחה </td><td> סיגמא </td><td> H4784 </td><td> מחדש ב PBS </td></tr></tbody></table> * כדי להפוך את המכפלת, לערבב מנות 1x10L של ממ and160ml של HEPES 1M ולהביא את נפח L 8.75 באמצעות מים מזוקקים. הגדר את PH הסופי 7.4ד לאחסן אותו ב 4 ° C. ** כדי להכין פתרון מעכב טריפסין, קודם לעשות 10 מ&quot;ל של תמיסת אני DNase (100 מ&quot;ג DNase מומס 100 מ&quot;ל של שולי) ולאחר מכן להוסיף 0.14 גר &#39;של מעכבי טריפסין לפתרון DNase ולבסוף להפוך את עוצמת הקול עד 1 ליטר באמצעות שולי. שמור aliquots של המוצרים הסופיים למקפיא -20 מעלות צלזיוס.

בידוד הרחבת האדם multiforme glioblastoma גידול תאים שימוש assay neurosphere

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

גזע דמויי תאים היו מבודדים גידולים כגון, שד ריאות בערמונית, במעי הגס ואת המוח. הנושא הקריטי בכל גידולים אלה, במיוחד mutliforme גליובלסטומה (GBM), היא לזהות לבודד תאים סרטניים באוכלוסיה ייזום (ים) לחקור את תפקידם ביצירת התקדמות הגידול, והישנות. הגידול הבנת ייזום אוכלוסיות תאים יספקו רמזים למציאת גישות טיפוליות יעיל עבור גידולים אלה. Assay neurosphere (NSA) בשל הפשטות שלה reproducibility שימש שיטת הבחירה של בידוד התפשטות של רבים זה תאים סרטניים. פרוטוקול זה מדגים את שיטת התרבות neurosphere לבודד להרחיב גזע דמויי תאים כריתה כירורגית של הרקמה האנושית הגידול GBM. הנהלים כוללים העיכול הכימי הראשוני ניתוק מכני של רקמת הגידול, ולאחר מכן ציפוי ההשעיה וכתוצאה מכך תא בודד בתרבות NSA. לאחר 7-10 ימים, neurospheres העיקרי של 150-200 מיקרומטר בקוטר ניתן לצפות ומוכנים להמשך passaging והתרחבות.

זה פרוטוקול וידאו מדגים את הבידוד והרחבת גזע כמו תאים mutliforme resected בניתוח גליובלסטומה אדם (GBM) רקמת הגידול בשיטת neurosphere תרבות assay.

בידוד הרחבת האדם multiforme Glioblastoma גידול תאים שימוש Assay Neurosphere

תאים דמויי גזע בודדו בגידולים כגון שד, ריאה, מעי גס, ערמונית ומוח. סוגיה קריטית בכל הגידולים הללו, במיוחד ב...

מטרת פרוטוקול זה היא בידוד והרחבה של תאי גידול גליובלסטומה מולטיפורמיס אנושיים באמצעות שימוש בשיטת הנוירוספירות (neurospheres). מטרה זו מושגת תחילה על ידי קיצוץ של רקמת הגידול שנאספה, לאחר מכן ביצוע דיסוציאציה מכנית, ולבסוף זריעת התאים שהתקבלו לגדילה בתרבית נוירוספירות. בסרטון זה, נראה כיצד לבודד ולהרחיב תאים דמויי גזע מרקמת גידול גליובלסטומה אנושית באמצעות שיטת תרבית הנוירוספירות.ניתן להשתמש בשיטה זו גם לתרבית תאים מגידולים מוחיים אחרים, כמו גם מגידולים מוצקים כגון שדיים, ערמונית, כבד וריאה. אוקיי, בואו נתחיל. לאחר קבלת רקמת גידול ה-GBM שהוסרה בניתוח, מסירים את המדיום.שוטפים את הגידול שתיים או שלוש פעמים באמצעות PBS סטרילי כדי להסיר מזהמים כגון דם ושאריות תאים. לאחר השטיפה, מניחים את הגידול שנכרת בתוך צלחת פטרי סטרילית. ראשית, חותכים את הגידול לחלקים קטנים יותר, לאחר מכן מעבירים חלק מרקמת הגידול לצלחת פטרי נפרדת וקוצצים את הרקמה לחתיכות זעירות באמצעות סכין מנתחים מספר 10.פעולה זו תגדיל את שטח הפנים הזמין לדיסוציאציה אנזימטית. הקיצוץ עשוי להימשך בין דקה לשלוש דקות, בהתאם לגודל הגידול. כעת, הוסיפו 3 עד 5 ml של trypsin שחומם מראש לרקמה המקצוצת והעבירו אותה למבחנה סטרילית של 15 ml מסוג falcon.הנח את המבחנה בנפח 15 Ml באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 15 דקות. נער את המבחנה בכל חמש דקות. כדי להבטיח עיכול רקמות טוב יותר, הוסף נפח שווה של מעכב טריפסין (trypsin inhibitor) כדי לעצור את התגובה.הפעלה של ה-Trypsin מובטחת על ידי פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים. סבב את התו сусפנזיה בצנטריפוגה ב-800 RRP M או 110 G למשך חמש דקות. הסר את הנוזל העליון, ולאחר מכן השהה מחדש את המשקע ב-One ml של מצע בסיסי לתאי גזע עצביים, תוך הצמדת קצה הפיפט לתחתית המבחנה.בצעו פיפטור מעלה ומטה שלוש עד שבע פעמים כדי לפרק גושים עד לקבלת תרחיף חלבי; פיפטור יתר עלול להוביל למות תאים. הניחו מסנן של 40 מיקרון על מבחנה של 50 ml. כעת הוסיפו 10 עד 15 ml של מצע בסיסי (basal medium) לתרחיף התאים וערבבו בעדינות. העבירו את תרחיף התאים דרך מסנן ה-40 מיקרון כדי להסיר פסוליות וגושים שאינם קשורי תאים.בצעו צנטריפוגה לתאים ושאבו את העלייה. השעיו את התאים ב-1 עד 2 mls של מצע גידול מלא. לאחר מכן, בצעו פיפטינג עדין למעלה ולמטה כדי להומוגנ את התגובה.ערבבו 10 µL של תרחיף תאים ב-90 µL של Trypan blue. ערבבו את התרחיף היטב והעבירו 10 µL ל-hemo.Cytometer. בצעו ספירת תאים כפי שמוצג כאן.דרוש תרחיף של תאים בודדים ללא גושים כדי להגיע לספירת תאים מדויקת. אין לכלול תאים החיוביים לצבע טריפאן כחול. בצע את הספירה בעת זריעת התאים לבקבוק T 80.הוסיפו 20 ml של מצע גידול מלא לתאי גזע עצביים למבחנה של 50 ml. הוסיפו כמות מתאימה של תרחיף תאים כדי להגיע לצפיפות של 200, 000 תאים ל-ml. כעת הוסיפו EGF כדי להגיע לריכוז סופי של 20 nanogram ל-ml.הוסיפו 0.2% heparin בריכוז של מיקרוליטר אחד ל-ml. לבסוף, הוסיפו BFGF כדי להגיע לריכוז סופי של 10 nanogram ל-ml. ערבבו את התאים במצע גידול מלא המועשר בגורמי גדילה.לאחר מכן, העבירו את התרחיף לבקבוק T 80 מסומן. את הבקבוק העבירו לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך שבעה עד 10 ימים. לאחר שמונה ימים בתרבית, הספירות גדלות באופן מלא ומוכנות למעבר (passaging).אספו את תכולת הבקראח והעבירו למבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 ml. סובבו את התאים ב-800 RPM למשך חמש דקות. שאבו את העילוי, ולאחר מכן השעיו את המשקע ב-1 ml של טריפסין שחומם מראש.דגרו את התאים במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שתי דקות. הוסיפו כמות שווה של מעכב טריפסין וערבבו היטב כדי להבטיח הפעלה. לאחר מכן, השקיעו את התאים.הסיר את הנוזל העליון (supernatant) וסספנד מחדש את התאים ב-1 ml של מצע גידול מלא, תוך פיפטור עדין למעלה ולמטה כדי להומוגניзировать את סספנד התאים. בצע ספירת תאים כפי שתואר קודם לכן, כדי לזרוע את התאים בבקבוק T 80 עם 20 ml של מצע גידול מלא בתוך מבחנה של 50 ml. הוסף כמות מתאימה של סספנד תאים כדי להגיע לצפיפות של 50,000 תאים ל-ml.כעת הוסיפו גורמי גדילה הכוללים E-G-F-B-F-G-F, והפרין בריכוז שתואר קודם לכן. ערבבו בעדינות את תרחיף התאים שהתקבל, לאחר מכן העבירו את התרחיף ל-T 80 והניחו באינקובטור למשך שבעה עד 10 ימים. להלן דוגמה לתרבית GBM ראשונית.לאחר ארבעה ימים בשלב זה, ניתן לראות שהתאים שגשגים והחלו להיווצר כספירות. בשלב זה לא אמורים להופיע מקבצים כדוריים גדולים של תאים. הופעתם תעיד על הכנה לא נכונה של הרקמה.לאחר שהייה בתרבית של שבעה עד 10 ימים, נוצרו ספירות (spheres) בגדלים משתנים; כאשר הספירות הגיעו לקוטר ממוצע של 150 עד 200 מיקרון, הן מוכנות למעבר (passage). זוהי דוגמה למעבר של תרבית GBM לאחר שמונה ימים. שוב, ניתן לראות ספירות בגדלים שונים; ספירות בריאות מציגות דוקרנים מיקרוסקופיים להיקפן.הכנת סספנסיות תאים בודדים היא שלב קריטי בכל תרבית של ספירות (spheres). אחרת, עלולות להופיע אגרגציות של תאים אפילו יום לאחר זריעת התאים. אגרגציות אלו עשויות להיחשב כספירות, אך יש לציין כי נדרש שבוע אחד לפחות כדי שתאים המיועדים לכך יגבשו ספירות אמיתיות.כמות השאריות בתרביות של כדורי גידול ראשוניים משתנה בהתאם לגורמים רבים, כגון מקור הרקמה, מידת הדיוק שבה הוסר הרקמה וכן טכניקת עיבוד הרקמה. אנו מקווים שתמצאו סרטון זה מועיל ומאחלים לכם הצלחה בניסויים שלכם.

isolation-expansion-human-glioblastoma-multiforme-tumor-cells-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זה פרוטוקול וידאו מדגים את שיטת assay neurosphere ליצור ולהרחיב בתאי גזע עצביים מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

סרטון זה מדגים את בדיקת הפלישה של תאי גזע לגידולי מוח במבחנה (BTSC) כדי לקבוע את השפעת הטיפול התרופתי על יכולת הפלישה של BTSCs מהנוירוספרה באמצעות טכניקת הדמיה של תאים חיים.

בדיקת פלישה נוירוספרית של תאי גזע של גידול במוח (BTSC): בדיקת מבחנה לניתוח השפעת הטיפול התרופתי על פלישת BTSC מנוירוספרה

פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מימדית לאימונוציטוכימיה מתוארת.

אופטימיזציה של תרבית תאי גליומה בדרגה גבוהה מדגימות כירורגיות לשימוש במודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים ואימונוכימיה תלת-ממדית

כאן, אנו מתארים טכניקות הדמיה לחיות תאים למדוד באופן כמותי את ההעברה ואת הפלישה בתאי גזע המוח גידול גליובלסטומה לאורך זמן, תחת תנאים מרובים של הטיפול.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Neurospheres גדל כמו תרבויות 3D מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה glioma. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע אימונוהיסטוכימיה תוך שמירה על המבנה התלת-ממד של glioma neurospheres באמצעות הטבעה פרפין. שיטה זו מאפשרת אפיון glioma neurosphere מאפיינים כגון stemness ובידול עצבית.

הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

כאן אנו מציגים מערכת התרבות הvivo לשעבר מעורב מעורבת לחקר התא glioma האדם (hGC) הגירה בזמן אמת. מודל זה מספק את היכולת להתבונן באינטראקציות בין השמאל לבין האקטונים המייאלואידית והלא-מיאלואידית בתוך תא מחולק.

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

במאמר זה, אנו מתארים, בפרוטרוט, פרוטוקול עבור הדור של תרבויות נוירוספירה מתאי גזע העכבר הפוסט-לידתיים נגזר של נישות הראשי נוירוגניים העכבר. הנוירוספירות משמשות לזיהוי תאי גזע עצביים מרקמת מוח המאפשרים הערכה של מספרי תאים מקודמי. יתר על כן, אלה מבנים תלת-ממדיים יכול להיות מצופה בתנאים הדיפרנציאל, הענקת הנוירונים, oligodendrocytes הפוך ו astrocytes, המאפשר לימוד של הגורל התא.

בידוד והתרחבות של הנוירוספירות מפוסטנטאל (P1-3) העכבר גומחות נוירוגניים

לייזר לחיתוך מיקרו (LMD) היא טכניקה רגישה ומאוד לגילוי שניתן להשתמש בה כדי לחשוף מסלולים כי בתווך glioma טרוגניות ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב כדי לבודד אזורים נפרדים מרקמת glioma באמצעות LMD לייזר ואחריו ניתוח טרנססקריפט.

לכידת לייזר מיקרודיסקציה של גלימה Subregions עבור אפיון מרחבית ומולקולרית של טרוגניות Intrאטומוראלי, הנחלים, ופלישה

כאן, אנו מתארים שיטת פלישה קלה לשימוש עבור גלינובלסטומה. שיטת הפעולה הזאת מתאימה לתאים גלנובלסטומה כמו גזע. מאקרו של פיג'י לכימות קל של פלישה, הגירה והתפשטות מתואר גם כן.

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

אנו מציגים מודל נדידה תלת-ממדי של גליובלסטומה המשתמש בגליאומספירות מגנטיות שמקורן במטופלים שנוצרו מגידולים שאובחנו לאחרונה וחזרים. פלטפורמה זו מאפשרת המחשה של דינמיקת ההגירה הספציפית של מטופלים והערכת יעילות טיפולית. הבדיקה יכולה להיות מולטיפלקסית לאחר ההגירה כדי להעריך את מיקום החלבונים ודפוסי ביטוי.

בדיקת נדידת גליובלסטומה תלת-ממדית שכפולה עם מיקום ספרואידי מתווך ננו-חלקיקים מגנטיים בתנאים היפוקסיים

למדו לבודד ולהרחיב תאי גזע מגידולי גליובלסטומה אנושיים באמצעות שיטת Neurosphere. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר ביולוגיית הגידול ופיתוח מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

בידוד הרחבת האדם multiforme Glioblastoma גידול תאים שימוש Assay Neurosphere

גלה סרטונים נוספים