CYP2D6 מודל החיה: כיצד לגרום דלקת כבד אוטואימונית עכברים

זיהום של עכברים עם adenovirus להביע autoantigen אדם גדול ציטוכרום P450 2D6 (hCYP2D6) המוכרים על ידי סרה של חולים הסובלים מסוג 2 תוצאות אוטואימוניות הפטיטיס בצורה מתמשכת של מחלה אוטואימונית בתיווך הכבד המאופיינת סיסטיק נרחב צהבת, ואת הדור של CYP2D6 ספציפית התגובה החיסונית.

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא ליצור ולאמת מודל עכבר לדלקת כבד אוטואימונית, מחלת כבד אוטואימונית אנושית המאופיינת בדלקת כרונית של ממשק הכבד, הפטיטיס, היפר גמא גלובין וייצור נוגדנים עצמיים סימני היכר בעלי חיים נדבקים תחילה במבנה אדנו-וירוס המבטא את המחלה הגורם לאנטיגן האוטו-אנטיגן CYP 2D 6 לגרום לדלקת מקומית בתוך הכבד. לאחר מכן, לימפוציטים בכבד מבודדים על ידי זלוף כבד וצנטריפוגה בצפיפות דיפרנציאלית. בסופו של דבר, ניתן להעריך נזק לכבד וזיהוי תאי T ספציפיים לאנטיגן עצמי על ידי אימונוהיסטוכימיה וצביעה ציטוקינים תוך תאיים בהתאמה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שמודל הפטיטיס האוטואימוני שלנו מאופיין בדלקת כרונית של הכבד ובתגובה חיסונית ספציפית לאנטיגן אוטו-אנטיגן שכמעט זהה לזו שנצפתה בבני אדם הסובלים מדלקת כבד אוטואימונית מסוג 2. המודל שלנו יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות כבד אוטואימוניות, כגון כיצד מונע הרס הדרגתי של הכבד בחולים עם דלקת כבד אוטואימונית. בדרך כלל בשיטת בקבוקונים, אנו נאבקים בזיהום תוך ורידי ואיסוף דם דרך הסינוס הוורידי העיניים כמו גם זלוף של הכבד בזמן שהשוער לובש היטב זקוק לתרגול.

לאחר ההרדמה, החזק את העכבר בחלק האחורי של הצוואר והדק את העור הרפוי של הראש בעזרת האגודל והאצבע האמצעית. שימו לב כיצד במצב זה, העין בולטת מעט בגלל מתיחת העור הצמוד לעין. כעת הכניסו את המחט לתוך הקנתוס המדיאלי בצומת של אחד העפעפיים הקרובים ביותר לאף החיה, והזריקו לאט 100 מיקרוליטר מתמיסת הווירוס 80 2D 6.

לאחר מכן משוך מעט את המחט וסגור את העפעפיים. התחל במילוי מזרק של חמישה מיליליטר ב-PBS קר והצמדת מחט בגודל 27 למזרק. לאחר מכן, לאחר המתת חסד של העכבר, בצע חתך במספריים במרחק של כסנטימטר אחד מהרגליים האחוריות של החיה דרך שכבות העור והשרירים שנחתכו משני צידי החיה עם מספריים הפועלות עד הסרעפת.

וכאשר מגיעים לסרעפת, משכו את העור לאחור וחתכו את הסרעפת מהצלעות בעזרת מספריים ונתחו את הווריד הנבוב. בשלב זה של הדיסקציה, הזיזו את הקיבה והמעיים הצידה, חשיפת וריד הפורטל החדרת הכבד היא החלק המסובך ביותר בהליך, במיוחד כאשר הכבד מודלק כרוני או אפילו פיברוטי. העכבר די קטן, ולכן הוא זקוק ליד יציבה כדי לנקב את וריד הפורטל בצורה מדויקת.

יתר על כן, חשוב שה-PBS יוחל לאט, אחרת הרקמה עלולה להיפגע. הכנס את המחט שהוכנה קודם לכן לווריד הפורטל ולאחר מכן הפעל בעדינות לחץ על הבוכנה של המזרק כדי לאפשר ל-PBS לשטוף לאט את הדם מהכבד בסיום הזלוף. הסר את הכבד על ידי אחיזה בסרעפת עם זוג מלקחיים ושימוש במספריים כדי לחתוך את הסרעפת מהגוף.

לבסוף, העבירו את האיבר לצלחת פטרי והסירו את הסרעפת, כיס המרה וכל רקמה אחרת שעדיין מחוברת לכבד. שימו לב שהכבד מבעל החיים עם דלקת כבד אוטואימונית הוא פיברוטי והאונות הבודדות מאוחות. התחל במילוי צלחת פטרי ב -10 מיליליטר PPS טרי והנחתו על קרח.

מעבירים את הכבד המפוזר לתבשיל ובעזרת מספריים חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות. לאחר מכן, שפכו את הרקמה וה-PBS למסננת תאים של 70 מיקרומטר ובעזרת עלי זכוכית לחצו את חתיכות הכבד דרך המסננת. כעת שפכו בזהירות 10 מיליליטר של מאגר קולגנאז קר על חתיכות הרקמה, והמשיכו להשתמש בעלי לפי הצורך.

סובב את התאים ב-30 פעמים G למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי, והשאירו חמישה מילימטרים של נוזל מעל צנטריפוגת הגלולה בטמפרטורה של 650 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את כל שלושת המילימטרים האחרונים של הסופרנטנט.

השהה מחדש את הגלולה ב-20 מיליליטר של כל מאגר קריאה, ולאחר מכן לאחר סיבוב התאים ב-600 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, השליך את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה על ידי לחיצה על הצינור בדלקת כבד אוטואימונית מתמשכת המתפתחת לאחר זיהום אדנו-וירוס 2D 6 של עכברים מסוג בר במודל CYP 2D 6. הכבד מציג וככל הנראה השתנה מורפולוגיה כפי שניתן לראות כאן באיור הימני. בפרט, אונות הכבד מאוחות כפי שמצוין על ידי ראשי חץ שחורים וגושים היפרפגיים המסומנים על ידי חיצים שחורים מופיעים מפוזרים על פני כל הכבד ופיברוזיס קפסולרי מסיבי נראה לעין עם בקרה.

לאדנו-וירוס שאינו מבטא CYP 2D 6 אנושי אין השפעה על מורפולוגיה של הכבד כפי שניתן לראות באיור משמאל. חדירות תאיות נרחבות ומתמשכות נוספות מופיעות באזורים הפריפורטליים והפרנכימליים של הכבד של אדנו-וירוס 2D שישה עכברים נגועים אך לא אדנו-וירוס נגועים. שימו לב לחדירות המשמעותיות של תאים חד-גרעיניים הקיימים רק בשישה עכברים נגועים באדנו-וירוס 2D כפי שמצוין על ידי החצים השחורים הבודדים. הנה.

החצים המשולשים מצביעים על חדירות תאיות גדולות יותר בפרנכימת הכבד המגשרות על דרכי השער השכנות. באיור זה ניתן לראות כיצד פיברוזיס מתפתחת בעיקר באזור התת-קפסולרי עם כמה צרורות קולגן הבולטים לתוך הפרנכימה. שימו לב לשכבות המרובות של נטיית הקולגן מתחת לקפסולת הכבד כפי שמצוין על ידי החצים השחורים המשולשים עם כמה צרורות הבולטים לתוך הפרנכימה כפי שמצוין על ידי החצים הבודדים, כמו גם לנוכחות של אשכולות גדולים של תאים חודרים כפי שמצוין על ידי ראשי החצים השחורים.

מאפיין שלישי של דלקת כבד אוטואימונית מתמשכת באדנו-וירוס 2D שישה עכברים נגועים הוא הדור הדומיננטי של תאי CYP 2D אנושיים ביות כבד שש, CD 4 ו-CD 8 T ספציפיים כפי שניתן לראות בעלילות הנקודות המייצגות הללו של צביעת ציטוקינים תוך תאיים, גירוי בן לילה של לימפוציטים בכבד עם CD אימונודומיננטי ארבע או CD שמונה, CYP 2D אנושי שישה פפטידים מעורר CD ארבעה חיובי או CD שמונה ביטוי גמא אינטרפרון ספציפי לתאי T חיוביים בהתאמה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי הזלוף האופטימלי של הכבד הוא צעד קריטי על מנת למנוע זיהום של לימפוציטים בכבד על ידי תאי מונוקל דם היקפיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד של תאי סטרואידים ראשוניים בכבד על מנת לחקור את מצב ההפעלה ופוטנציאל הנדידה של תאי T לאחר התפתחותו.

מודל זה של בעלי חיים אמור לסלול את הדרך לחוקרים בתחום מחלות כבד אוטואימוניות לחקור את גורמי המפתח המניעים את הדלקת הכרונית של הכבד, ולהעריך טיפולים אפשריים לחולים.