פשוט וחזק In vivo ו במבחנה גישה ללימוד הרכבה וירוס

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור הרכבת נגיפים in vivo ו-in vitro. זאת על ידי ביטוי ראשוני של RNA של נגיף פסיפס פסיגון (bro mosaic virus) בחיידקים, וחשיפת תאי צמח אליהם באמצעות חדירה של אגרובקטריום (agro infiltration). לאחר מכן, מבודלים את הויריונים של ה-BMV מעלים שעברו חדירה.

לאחר מכן, מכינים תת-יחידות של חלבוני הקפסיד לצורך הרכבה in vitro. לבסוף, מרכיבים BMV Varians in vitro באמצעות חלבוני הקפסיד וצבע indocyanine green. בסופו של דבר, התוצאות מראות בנייה in vitro של bro mosaic varians באמצעות יצירת "רוחות אופטיות" (optical ghosts), שניתן לקבוע באמצעות בבדיקת בליעה ופליטה של פלואורסצנציה.

היום נדגים טכניקה המכונה סינון (filtration), וטכניקה זו שימושית להחדרת רכיבים ויראליים לצמחים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ביטול הצורך ביצירת תמלילי in vitro, ובמקביל, היא מחדירה מספר רכיבים לאותו תא, מה שמאפשר הדבקה מסונכרנת. העבודה שאנו מקדמים כעת היא שימוש ב-brome mosaic virus בשילוב עם כרומופור המאושר על ידי ה-FDA, cyanide green, כדי לייצר סוג חדש של ננו-חלקיק ליישומים ביו-רפואיים.

ובאופן ספציפי, כוונתנו היא להשתמש במבנים אלו, אותם אנו מכנים רפאי חוטי אופטיים או OBGs, עבור שיטות דימות אופטיות, כולל דימות פלואורסצנציה ודימות פוטואקוסטי, וכן ככלי לטיפול בלייזר. יישום קליני ספציפי שאנו מקדמים כעת הוא שימוש במבנים אלו לדימות של סרטן השחלה בשילוב עם הליכים תוך-ניתוחיים. הרעיון הוא שנוכל להעניק תפקוד (functionalize) למבנים אלו.

ה-OBG עם מוטיב התargeting הספציפי שיכול לזהות תאי גידול שיוריים, שבמקרה של סרטן השחלה עשויים להימצא במיוחד בתוך החלל הפריטוניאלי. מתוך צלחת של אגרובקטריום (agrobacterium) שהוכנה מראש ונושאת את RNA 1, 2 או 3 של נגיף הפסיפס החום (brown mosaic virus), בחר מושבה בודדת כדי להוסיף אותה ל-2 mL של מצע LB המכיל 50 µg/mL של קנמיצין (canmycin) ו-100 µg/mL של ריפמפיצין (rifampicin). דגרי את התרבית למשך יום אחד בטמפרטורה של 28 °C במנער אורביטלי במהירות של 250 RPM. למחרת, הזרק 1 mL מהתרבית לתוך 50 mL של מצע LB בבקבוק ארלנמאייר בנפח של 500 mL, ודגרי למשך 16 שעות בטמפרטורה של 28 °C במנער אורביטלי במהירות של 250 RPM. כאשר התרביות יגיעו לערך OD 600 של 1.0, העבר אותן למבחנות סטריליות בנפח של 30 mL וסבב אותן בצנטריפוגה למשך 10 דקות.

ב-5,000 RPM ובארבע מעלות צלזיוס המיסו את המשקעים ב-10 milliliters של 10 millimolar magnesium chloride וסבבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-5,000 RPM ובארבע מעלות צלזיוס. חזרו על שלב זה פעם אחת נוספת כדי להבטיח הסרה מלאה של האנטיביוטיקה. לאחר מכן, השעו את המשקעים ב-10 milliliters של בופר המכיל 10 millimolar MES ו-10 millimolar magnesium chloride.

מדדו את ה-OD 600 עבור כל תרבית והתאימו ל-OD 600 של 0.1 באמצעות 10 millimolar מגנזיום כלוריד ו-10 millimolar MES. לאחר מכן, ערבבו 10 milliliters מכל אחת משלוש תרביות ההיתליים בריכוז 0.1 OD 600. הוסיפו אצטופנון עד לריכוז סופי של 100 millimolar.

ערבבו בעדינות והשאירו את התערובת ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות. לאחר הדגירה, שאבו את התרבית למזרק של one milliliter ללא מחט. הזרקו את תרחיף התרבית לצד ה-abaxial של שניים עד שלושה עלים מפותחים היטב של N hamana, על ידי לחיצה עדינה של המזרק על מחצית משטח ה-abaxial של כל עלה.

יש לשמור את הצמחים שהוחדרו בחממה בטמפרטורה של 24 degrees Celsius למשך שלושה עד ארבעה ימים לפני קצירת העלים. לאחר טיהור ה-BMV Virions, הכינו ליטר אחד של 1x virus dissociation buffer. לאחר מכן, הכינו ממברנת דיאליזה.

בהתאם לשיטה של sambrook, etal, העבירו 5 עד 10 מיליגרם למילילטר של נגיף מטוהר לתוך שק דיאליזה והניחו את השק בתוך בקראח של 1x virus dissociation buffer. בצעו דיאליזה לנגיף למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4°C תוך כדי ערבוב.

אספו את התמיסה משק dialysis וסבבו בצנטריפוגה במהירות 30, 000 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לשקע חלקיקי וירוס שאינם קשורים. סבבו את העילאי בצנטריפוגה במהירות 30, 000 RPM למשך שלוש שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הכנת תמלילי RNA להרכבה מחדש לוויריון, ערבבו תתי-יחידות של חלבון הקפסיד ותמלילי RNA ביחס של אחת לחמש.

העבירו את התערובת לשקית דיאליזה ואטמו אותה כראוי כדי למנוע דליפות. לאחר הכנת ליטר אחד של RNA assembly buffer בריכוז 1X, בצעו דיאליזה לתערובת תגובת ההרכבה בבופר בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות. למחרת, הוציאו את התערובת משקית הדיאליזה והוסיפו 1.5 milliliters של RNA assembly buffer, ולאחר מכן צנטריגו שוב ב-30,000 RPM למשך שלוש שעות ב-4°C. לאחר מכן, הסירו את הסופרנאט ותלו את המשקע.

בשלב הבא, העריכו את ריכוז הוויריונים ב-OD 260 ננומטר. לאחר מכן, קבעו את ריכוז תתי-היחידות של חלבוני הקפסיד ב-OD 280 ננומטר או בשיטות אחרות, כגון Bradford Assay, כדי לקבוע את שלמותן של תתי-היחידות המופרדות של חלבון הקפסיד. בצעו SDS-PAGE בריכוז של 12% עד 15%, ולאחריו Western blotting. לבסוף, פעלו לפי הפרוטוקול הכתוב כדי להפיק "ghosts" ויראליים אופטיים או ov cheese.

מוצגת כאן תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) של BMV Varion שנצבע בצביעה שלילית וטוהר מצמחי end hamana שעברו חדירה אגרו-בקטריאלית (agro infiltration) עם תערובת של כל שלושת מבני ה-BMV מסוג הבר (wild type). תמונת ה-TEM זו מראה רפאיים ויראליים אופטיים המכילים אינדוציאנין ירוק ונצבעו בצביעה שלילית. כאן מוצגים ספקטרומי הבליעה והפלואורסצנציה של הרפאיים הוויראליים האופטיים לאחר שלב השליטה.

ניתן לבצע טכניקה זו בחמישה דקות לדגימה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של אופן כמיסה (encapsulation) של רכיבים ויראליים או לא-ויראליים בתוך תתי-יחידות של חלבון הקפסיד.