Name: בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים Elegans Caenorhabditis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למדו לבודד נוזלים תוך-תאיים מ-Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרו-הזרקה. שיטה זו מאפשרת ניתוח הרכב הנוזלים וחקר מסלולי שידור RNAi במערכת הדם הפסאודוצלומית של התולעת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להכיר את האופי השיתופי של האנטר המעבדה, ומודה להם על דיון וסיוע המועיל שעשה פיתוח של טכניקה זו אפשרית ומהנה. ברצוננו להודות לנייג&#39;ל דילייני וCaenorhabditis גנטיקת המרכז לתולעת וזני חיידקים. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות GM089795 מענק לCPH.

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li>
<li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li>
<li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li>
<li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mec-3%2C+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li>
<li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

יש לנו הצגנו שיטה חדשה המאפשרת בידוד והאפיון של נוזל חוץ תאי ממודל אורגניזם ג כאן elegans. הטכניקה מתחילה במניפולציה הגנטית או פיזית של תולעים תורמים להגדלת הנפח הכולל של נוזל חוץ התאי שלהם. אז נוזל חוץ תאי הוא מבודד בטכניקת microinjection שונה. התולעים הם רכובים על microinjection באמצעות רפידות agarose יבשות להחזיק את התולעים עדיין במהלך ההליך. הקובץ המצורף הפיזי למשטח משתמש בכוח desiccating של המשטח היבש hydrostatically להחזיק את התולעת במקום. זה מציג אתגר, כי ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; יום</strong</td&gt;<td<strong&gt; הכנת תולעת</strong</td&gt;<td<strong&gt; הכנת חומר</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 או לפני</td&gt;<td&gt; שמור על ניקיון, נזון היטב<em&gt; CLR-1 (e1745)</em&gt; ותולעי N2</td&gt;<td&gt; הפוך רפידות הזרקה, צלחות NGM, NGM + פחמימות / צלחות IPTG, מניות LB OP50</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; רצף את RNAi אוכל על LB + פחמימות</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; לחסן 3 מיליליטר לילה עם RNAi מזון</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&lt;העברת עוברים לRNAi צלחת</td&gt;<td&gt; זרעי RNAi צלחת</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; Shift תולעים עד 25 במשך 4 שעות</td&gt;<td&gt; הפוך צלחות assay</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&lt;העברת תולעים לנקות צלחות NGM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; ערפד העברה</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; שחזור נמען</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +1</td&gt;<td&gt; הסרת נמען העברה</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2</td&gt;<td&gt; צאצאי ציון</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; טבלה 1.</strong&gt; ציר זמן הכנת חומר.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; ציוד</strong</td&gt;<td<strong&gt; חברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוג</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picoliter לחץ Injector</td&gt;<td&gt; וורנר מכשירים</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Flaming / בראון micropipette פולר</td&gt;<td&gt; סאטר מכשירים</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; ריאגנטים</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; שמן מינרלים</td&gt;<td&gt; EM מדע</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50 שום ½ 1 מכסה זכוכית</td&gt;<td&gt; קורנינג</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE agarose</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ורוסיליקט זכוכית נימים</td&gt;<td&gt; Precisions מכשירי העולם</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פתרון Hypochlorite נתרן (5% כלור זמין)</td&gt;<td&gt; JT ייקר</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; ג elegans</em&gt; וזני חיידקים</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; CLR-1 (e1745) השני</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; Caenorhabditis גנטיקת המרכז (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; GLP-1</em&gt; RNAi וקטור<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<td&gt; מקור Bioscience (ספריית האכלת Ahringer)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; חבר-1</em&gt; RNAi וקטור<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; PHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Caenorhabditis גנטיקת המרכז (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; א coli</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; טבלה 2.</strong&gt; ריאגנטים וציוד ספציפיים.</p

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em&gt; elegans caenorhabditis</em

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

המודל גנטי הצייתן האורגניזם ג elegans ספק תובנה לתוך מספר עצום של שאלות ביולוגיות, מופעל על ידי זמן הדור הקצר שלו, קלויות גידול וגודל קטן. גודל קטן זה, אם כי, לא מרשה מספר גישות טכניות שנמצאו במערכות מודל אחרות. לדוגמה, עירויי דם במערכות יונקים וטכניקות השתלה בצמחים מאפשרים לשאול שאלות של הרכב דם ומערכת איתות. מערכת הדם של התולעת, pseudocoelom, יש לו עד לאחרונה היה בלתי אפשרי לבדיקה באופן ישיר. כדי לענות על שאלות של איתות אינטר ומערכת דם ההרכב ג חוקרי elegans הפכו באופן מסורתי לניתוח גנטי, הצלה ספציפית תא / רקמה, וניתוח פסיפס. טכניקות אלה מספקות אמצעים להסיק מה שקורה בין תאים, אך אינן ישימים באופן אוניברסלי בזיהוי ואפיון של מולקולות תאיות. כאן אנו מציגים neטכניקה שפותחה wly ישירות assay נוזל pseudocoelomic של ג elegans. הטכניקה מתחילה עם או מניפולציה גנטית או פיזית כדי להגדיל את נפח נוזל חוץ תאי. אחר כך את בעלי חי נתונים לטכניקת microinjection הפוך ערפדים באמצעות אסדת microinjection המאפשרת שליטה בלחץ איזון עדינה. לאחר הבידוד של נוזל חוץ תאי, הנוזל נאסף ניתן assayed על ידי העביר לבעלי חיים אחרים או באמצעים מולקולריים. כדי להדגים את היעילות של טכניקה זו אנו מציגים גישה מפורטת לassay דוגמה ספציפית של מולקולות איתות תאיות, dsRNA הארוך במהלך תגובת RNAi מערכתית. למרות אפיון של RNAi המערכתי הוא הוכחה לדוגמא עיקרון, אנו רואים בטכניקה זו כישים לענות על מגוון שאלות של קומפוזיציה ואיתות מערכת דם.

אורגניזם המודל<em&gt; ג elegans</em&gt; משתמש בנוזל pseudocoelomic כמערכת דם פסיבית. בדיקה ישירה של הנוזל הזה לא הייתה אפשרית בעבר. כאן אנו מציגים שיטה חדשנית לבדיקה ישירות חלל החוץ התאי, ולהשתמש באותות השתקה מערכתיים בתגובת RNAi כהוכחה לדוגמא עיקרון.

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

אורגניזם המודל C. elegans, הניתן למניפולציה גנטית, סיפק תובנות לגבי שורה רחבה של שאלות ביולוגיות, זאת הודות לזמן הדור הקצר שלו, ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד נוזל חוץ-תאי על מנת לענות על שאלות הנוגעות להרכבו ולתפקודו של הנוזל, כגון שאלות העוסקות באיתות RNAi. דבר זה מושג תחילה על ידי האכלת תולעים בחיידקים המבטאים DS RNA, מה שמוביל לפנוטיפ RNAi שניתן לניטור בקלות. לאחר מכן, התולעים נחשפות לזמן המאפשר את הפצת אותות השתיקה של ה-RNAi ברחבי הגוף.לאחר מכן, הנפח הכולל של הנוזל החוץ-תאי הזמין מוגדל. לבסוף, נעשה שימוש במחט למיקרו-הזרקה כדי להוציא את הנוזל החוץ-תאי ולהזריקו לתולעת שאינה חשופה ל-RNAi. בסופו של דבר, ניתן להוכיח את נוכחותם של אותות השתקה של RNAi באמצעות דירוג הצאצאים של התולעים המוזרקות.באמצעות שיטה זו, ניתן לנתח את הרכב הנוזל החוץ-תאי כדי לספק תובנות לא רק לגבי RNAi סיסטמי, אלא גם לגבי מגוון מסלולי איתות בין-תאיים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את הטכניקה יתקשו בביצועה בשל המהירות הנדרשת בעבודה. כדי להכין תולעי תורם באמצעות clear one E 1745, יש לבצע מריחה של חיידקים המבטאים DS RNA לקבלת מושבות בודדות על פלטות LB plus CARIL; לצורך הדגמה זו נעשה שימוש ב-PAL one DS RNA producing bacteria.דגרו את הצלחות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, בחרו מושבה בודדת כדי להוסיף אותה לתרבית לילה של 3 mL ב-LB מועשר ב-carbenicillin. העבירו באמצעות פיפטה 15 µL מתרבית הלילה אל צלחות NGM בקוטר 35 mm, המועשרות ב-25

vampiric-isolation-of-extracellular-fluid-from-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון וידאו זה מתאר שיטה לניתוק תולעים שלמות לתרחיף חד-תאי המתאים ל-FACS או משקעים חיסוניים של תאים שלמים.

דיסוציאציה של תא בודד של Caenorhabditis elegans: שיטה לבודד תאים חיים

מקור: פטרסן, ק. ואחרים, בידוד ואפיון המיקרוביום הטבעי של הנמטודה המודל Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של מיני חיידקים הקשורים ל-Caenorhabditis elegans. פירוק מבוסס חרוזים של C. elegans, ואחריו גידול סלקטיבי, מאפשר בידוד של זנים מיקרוביאליים מגוונים לניתוח נוסף.

בידוד וגידול חיידקים קשורים ל-Caenorhabditis elegans

סרטון זה מדגים את הבידוד של נוירונים המסומנים באופן פלואורסצנטי מ- Caenorhabditis elegans. תרחיף תאים מתקבל מתולעים טרנסגניות שהונדסו לבטא טרנסממברנה שלפוחית פלואורסצנטית המאוחה על ידי חלבון בנוירונים כולינרגיים. תאי העצב המסומנים באופן פלואורסצנטי מבודדים לאחר מכן באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ונשמרים בתרבית.

בידוד תאי עצב מ- Caenorhabditis elegans באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד פשוט של קבוצות מסוימות של תאים עצביים חיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק מקווי האלגניים של הקווים. שיטה זו מאפשרת מגוון של מחקרים vivo ex התמקדו נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים עבור לטווח קצר יותר culturing.

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

מאמר זה מציג שיטות ליצירה, טיהור ובדיקת כימות של שלפוחיות. Caenorhabditis...

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

מוצג כאן תיאור של הבידוד הישיר והמהיר יחסית של דנ"א גנומי של Caenorhabditis elegans מבעל חיים אחד או כמה בעלי חיים באמצעות ערכת רקמה זמינה מסחרית. הכנת ה-gDNA המתקבלת היא תבנית מתאימה ל-PCR.

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

למדו לבודד נוזלים תוך-תאיים מ-Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרו-הזרקה. שיטה זו מאפשרת ניתוח הרכב הנוזלים וחקר מסלולי שידור RNAi במערכת הדם הפסאודוצלומית של התולעת.

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים

גלה סרטונים נוספים