אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ככלי למדמיינים מולקולות Microinjected והיעדים האיקריוטים תת סלולריים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להכניס מולקולות קטנות או חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית לציטופלזמה של תא יונק מתורבת, ולצפות בשינויים המורפולוגיים המושרים מרזולוציה של מיקרומטר לרזולוציה רב-ננומטרית. זה מושג תחילה על ידי תרבית תאי יונקים על פתקי כיסוי זכוכית מרושתים והזרקת מיקרו שלהם עם מולקולה קטנה או חלבון מעניין. לאחר מכן, התאים מקובעים בפורמלדהיד ונצפים ומצולמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

לאחר מכן התאים מקובעים עם גלוטרלדהיד, נחתכים, מוכתמים ומצולמים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. לבסוף, תמונות שצולמו במהלך מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרונים משולבות ומיושרות. בסופו של דבר, המתאם בין התמונות הללו מאפשר לחוקר לצלם הפרעות ברזולוציה גבוהה הנגרמות על ידי המולקולה הקטנה או החלבון המעניין.

היי, אני ד"ר אוון רדיק במעבדה של ד"ר ניל אלטו במחלקה למיקרוביולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן בדאלאס. היום אני הולך לדבר איתכם על הליך M Clem או מיקרוסקופ האור והאלקטרונים המתאם של מיקרו-הזרקה. היתרון העיקרי של הליך זה על פני טכניקות עצמאיות כמו מיקרו-הזרקה או מיקרוסקופיה, הוא שכאן הם מבוצעים בתיאום ונעזרים בשימוש בהחלקת כיסוי זכוכית מרושתת.

החלקת הכיסוי המרושתת הזו היא שמאפשרת לחוקרים לחזור לאותו תא במהלך חלקים שונים של הפרוטוקול. בנוסף, טכניקה זו מעניקה לחוקר את היכולת לצפות בשינויים ארכיטקטוניים תת-תאיים ממגוון רחב של מולקולות קטנות או חלבונים מעניינים הניתנים להזרקה, ולעשות זאת מרזולוציה מיקרומטרית לרזולוציה רב-ננומטרית. כדי להתכונן להזרקת מיקרו, תאים של תרבית כגון כליה רגילה של חולדה או תאי סרטן צוואר הרחם אימורטליים על זכוכית חרוטה בתמונה, תלושי כיסוי מודבקים שתי צלחות תאים חיים דוגרים על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

בהתאם לציר הזמן הניסיוני שיש להשתמש בו, התאם את שטף התאים. צלחת מתכנסת מלאה תקשה מאוד על זיהוי תאים מוזרקים מיקרו במיקרוסקופ האלקטרונים. לכן, תאי זרע כמו שהם מגיעים לכ-50% שטף משותף ביום ניסוי קצר וכ-25% שטף co.

ביום של ניסוי ארוך יותר, הכן DNA חלבוני עם תווית פלואורסצנטית או מולקולות קטנות במאגר המתאים לנפח סופי של 50 מיקרוליטר. בהתאם ל-Fluor ofor לבחירה, הוסף צבע מעקב כגון אדום טקסס או כחול מפל. הוסף ריכוז של 0.5 עד מיליגרם אחד למיליליטר.

מסננים את התמיסה דרך פילטר צנטריפוגלי של 0.22 מיקרון. לאחר משיכת מחטי מיקרו-הזרקה באמצעות הנחיות היצרן, פיפטה בזהירות למיקרוליטרים של תמיסה לתוך הקצה האחורי של מחט. טען את המחט לזרוע המיקרו-מניפולטור של מכשיר מיקרו-הזרקה מסחרי המחובר למיקרוסקופ הפוך.

מניחים צלחת של תאים מתורבתים למחזיק הכלים של המיקרוסקופ ההפוך. מצא תאים הגדלים בתוך רשת חרוטה בתמונה ורשום את המזהה האלפאנומרי של הרשתות. זה ישמש בכל השלבים הבאים.

חשוב לבחור תאים למיקרו-הזרקה המודבקים קרוב למרכז החלקת הכיסוי, ולהימנע מאלה הקרובים לפריפריה. זה חשוב מכיוון שהוא יבטיח העברה יעילה של התאים המעניינים שלך למרכז שרף ה-epon המשמש מאוחר יותר למיקרוסקופ אלקטרונים ידני, הורד ידנית את זרוע ההזרקה מעל החלקת הכיסוי והשתמש במניפולטור המיקרו כדי להוריד את המחט עד שהקצה נוגע בעדינות במשטח התאים. מיקרו מזריקים כל תא שני בתוך הרשת הנבחרת לתאים הגדלים בכ-50% שטף Co צפו לכ-80 תאים לכל רשת של 600 מיקרומטר רבוע, מה שייתן N של כ-30 עד 40 תאים ניסיוניים ומבוקרים.

לאחר ההזרקה, הכניסו את המנה בחזרה לחממה למשך זמן רצוי לביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השליכו את מצע הגידול וקבעו את התאים עם פורמלדהיד ב- PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. החלף את הקיבוע ב-XPBS אחד.

לאחר מכן תעד את סידור התאים על ידי צילום חמש עד 10 תמונות שדה בהיר של הרשת שנבחרה בהגדלה נמוכה וגבוהה. כדי לזהות את התאים המיקרו המוזרקים, צלם תמונות פלואורסצנטיות באורכי גל העירור והפליטה של עין הצבע בהזרקה אינרטית. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, אסוף זאק של תמונות של תאים מוזרקים מיקרו בהגדלה גבוהה בתוך אותה רשת שצולמה בעבר.

יש צורך בהגדלה גבוהה על מנת לתאם תמונות פלואורסצנטיות עם מבנים תת-תאיים שיזוהו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. לאחר הדמיה קונפוקלית, השתמש בנוזל להסרת החלקת כיסוי כדי להפריד את החלקת הכיסוי מהצלחת ולהניח אותה עם צד התא כלפי מעלה בצלחת תרבית טרייה המכילה XPBS אחד. המשך לעיבוד למיקרוסקופ אלקטרונים.

יש לעקוב אחר פרוטוקולי EM סטנדרטיים. כדי לתקן כתם ולייבש את הדגימות, הכינו שרף אפון והניחו את צד תא ההחלקה של הכיסוי כלפי מטה על גבי צינור מלא בשרף עידן. הניחו לשרף להתפלמר בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

כדי להסיר את הכיסוי להחליק משרף האפון. טבלו אותו במהירות בחנקן נוזלי. הלם הטמפרטורה מ-60 מעלות צלזיוס למינוס 196 מעלות צלזיוס.

מסיר את החלקת הכיסוי מצינור השרף. המתן חמש עד 10 דקות, ולאחר מכן החזר את הצינור, שכעת נקי מהחלקת הכיסוי. תחת היקף ניתוח, בדוק את פני השרף כדי לאתר את הרשת המעניינת.

בעזרת סכין גילוח או אזמל סטרילי, חתוך את בלוק ה-epon כך שרק הרשת המעניינת תהיה בקודקוד הבלוק עם חתך אולטרה מיקרוטון חלקים טוריים של הבלוק הגזוז השתמש באצטט משתנה וציטראט עופרת כדי להבדיל את החלקים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. העבר את התאים הרצויים במיקרוסקופ האלקטרונים באמצעות המיקום היחסי של התאים כמדריך. שימוש בתמונות פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה שצולמו קודם לכן.

זהה אזורי עניין במיקרוגרף האלקטרונים התואמים את האות הפלואורסצנטי. השתמש בציוני דרך כגון המיקום של כרומטין הטרו והמעטפת הגרעינית כדי לקבוע איזו תמונת זאק פלואורסצנטית מתאימה לפרוסת ה-EM. כעת מצולמים באמצעות תוכנת הדמיה כגון Image J או Adobe Photoshop, הפחיתו את האטימות של התמונה הפלואורסצנטית ל-50% ושכבו אותה על תמונת ה-TEM המתאימה.

יישר את התמונות על-ידי התאמת קנה המידה המוצג. להלן התוצאות ממיקרו-הזרקה ומיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם. תמונה זו מציגה את מיקרוגרף השדה הבהיר של תאי NRK הגדלים על תלוש כיסוי מרושת זכוכית חרוט בלייזר.

שימו לב לאותיות הרקע b ו-m המשמשות לזיהוי הרשת המכילה תאים מוזרקים. חיצים מציינים את שני התאים שזוהו וצולמו במיקרוסקופ אלקטרונים. מוצגת כאן תמונה פלואורסצנטית של צבע המעקב האינרטי הכחול המשמש לזיהוי תאים מוזרקים זעירים.

הנה שכבת-על של אותות השדה הבהיר והפלואורסצנטי של אמין המסומן במולקולה קטנה. פאנל זה מייצג את המתאם בין מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרונים של תא מוזרק. ראש החץ מציין פונקטה פלואורסצנטית שצולמה בהגדלה גבוהה יותר בפאנל זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק מיקרו חלבון מעניין ולעקוב אחר השינויים המורפולוגיים התת-תאיים שלו שהוא גורם באמצעות הליך של מיקרו-הזרקה Clem או מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם.