אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ככלי למדמיינים מולקולות Microinjected והיעדים האיקריוטים תת סלולריים
4 במאי 2012
טכניקת קלם הותאמה לנתח מורפולוגיה ultrastructural של קרומים, האברונים, ומבני subcellular מושפעים מולקולות microinjected. שיטה זו משלבת טכניקות רבות העצמה של המיקרומניפולציה / microinjection, מיקרוסקופיה confocal ניאון, וכן במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאפשר מילימטר לרזולוציה רבה ננומטר. טכניקה זו היא נוחה למגוון רחב של יישומים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להחדיר מולקולות קטנות או חלבונים המסומנים פלואורסצנטית לתוך הציטופלזמה של תא יונקים בתרבית, ולבחון את השינויים המורפולוגיים המושרים ברזולוציה של מיקרומטרים עד לננומטרים בודדים. זאת מושג תחילה על ידי גידול תאי יונקים על לוחות כיסוי מזכוכית עם רשת (grided glass cover slips) והזרקה מיקרוסקופית של מולקולה קטנה או חלבון רצוי המסומנים פלואורסצנטית. לאחר מכן, התאים מקובעים בפורמלהיד, ונבחנים ומצולמים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
לאחר מכן, התאים מקובעים באמצעות glutaraldehyde, נחתכים, נצבעים ומצולמים באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית. לבסוף, התמונות שצולמו במהלך מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה בהיר ומיקרוסקופיה אלקטרונית משולבות ומיושרות. בסופו של דבר, השילוב של תמונות אלו מאפשר לחוקר לדגום ברזולוציה גבוהה שינויים שנגרמו על ידי המולקולה הקטנה או החלבון הנחקרים.
שלום, אני ד"ר אבן רדיק מהמעבדה של ד"ר ניל אלטו במחלקה למיקרוביולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס Southwestern בדאלאס. היום אני אדבר איתכם על פרוצדורת ה-M Clem, או מיקרו-הזרקה בשילוב מיקרוסקופיה אלקטרונית ואופטית (correlative light and electron microscopy). היתרון העיקרי של פרוצדורה זו על פני טכניקות נפרדות, כגון מיקרו-הזרקה או מיקרוסקופיה, הוא שכאן הן מבוצעות בתיאום ונעזרות בשימוש בכיסוי זכוכית עם רשת (gridded glass cover slip).
כיסוי זכוכית (cover slip) עם רשת זו מאפשר לחוקרים לחזור לאותו התא במהלך שלבים שונים של הפרוטוקול. בנוסף, טכניקה זו מעניקה לחוקר את היכולת לצפות בשינויים ארכיטקטוניים תת-תאיים המושרים על ידי מגוון רחב של מולקולות קטנות או חלבונים רצויים להזרקה, ועשות זאת ברזולוציה הנעה בין מיקרומטרים למספר ננומטרים. כדי להכין את התאי התרבית למיקרו-הזרקה, כגון תאי כליה רגילים של חולדה או תאי סרטן צוואר הרחם מונחלים, על כיסויי זכוכית בעלי רשת שנוצרה בתהליך צריבה פוטוכימית (photo etched) המצומדים לצלוחות תאים חיים, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2.
בהתאם ללוח הזמנים הניסיוני המתוכנן, התאימו את רמת ההצטברות (confluency) של התאים. פלטה בעלת הצטברות מלאה תקשה מאוד על זיהוי תאים שהוזרקו במיקרו-הזרקה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים. לפיכך, זרעו את התאים כך שיגיעו לכ-50% הצטברות ביום של ניסוי קצר, ולכ-25% הצטברות בניסויים ארוכים יותר.
ביום של ניסוי ממושך יותר, הכין חלבון, DNA או מולקולות קטנות המסומנים פלואורסצנטית בבופר המתאים לנפח סופי של 50 µL. בהתאם לפורופור (Fluorophore) הנבחר, הוסף צבע מעקב כגון Texas red או cascade blue. הוסף ריכוז של 0.5 עד 1 mg/mL.
סננו את התמיסה דרך מסנן צנטריפוגלי של 0.22 micron. לאחר משיכת מחטי מיקרו-הזרקה בהתאם להנחיות היצרן, העבירו בזהירות באמצעות פיפטה מיקרו-ליטרים של תמיסה אל חלקו האחורי של המחט. טענו את המחט לזרוע המיקרו-מניפולטור של מכשיר מיקרו-הזרקה מסחרי המחובר למיקרוסקופ הפוך.
הניחו צלחת של תאים מתורבת במחזיק הצלחות של המיקרוסקופ ההפוך. אתרו תאים הגדלים בתוך רשת חרוטה בפוטו-ליתוגרפיה ורשמו את המזהה האלפא-נומרי של הרשת. מזהה זה ישמש בכל השלבים הבאים.
חשוב לבחור תאים להזרקה מיקרוסקופית (microinjection) שנדבקו קרוב למרכז כיסוי הזכוכית (cover slip), ולהימנע מאלו הנמצאים בשוליים. דבר זה חשוב כדי להבטיח העברה יעילה של התאים הנבדקים למרכז השרף מסוג epon המשמש בהמשך למיקרוסקופיה אלקטרונית. הורד ידנית את זרוע ההזרקה מעל כיסוי הזכוכית והשתמש במיקרו-מניפולטור כדי להוריד את המחט עד שהחוד נוגע בעדינות במשטח התאים. בצע הזרקה מיקרוסקופית לכל תא שני בתוך הרשת שנבחרה; עבור תאים הגדלו ב Fluency של כ-50%, צפי למספר של כ-80 תאים לרשת של 600 square micrometer, מה שיניב N של כ-30 עד 40 תאי ניסוי וביקורת.
לאחר ההזרקה, החזיר את הצלחת למדגרה למשך הזמן הרצוי לצורך ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השליך את מצע הגידול וקבע את התאים באמצעות formaldehyde ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. החלף את מקבע התאים ב-XPBS אחד.
לאחר מכן, תיעדו את סידור התאים על ידי צילום של חמישה עד 10 תמונות בשדה בהיר (bright field) של הרשת הנבחרת, בהגדלה נמוכה וגבוהה. כדי לזהות את התאים שהוזרקו במיקרו-הזרקה, צלמו תמונות פלואורסצנטיות באורכי הגל של העירור והפליטה של צבע ההזרקה האינרטי. בעזרת מיקרוסקופ קונפוקאלי, אספו סדרה (Z-stack) של תמונות של תאים שהוזרקו במיקרו-הזרקה בהגדלה גבוהה, בתוך אותה רשת שצולמה קודם לכן.
נדרשת הגדלה גבוהה על מנת לבצע קורלציה בין דימויים פלואורסצנטיים למבנים תת-תאיים שיזוהו באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית. לאחר הדמיה קונפוקלית, השתמשו בנוזל להסרת זכוכית כיסוי כדי להפריד את זכוכית הכיסוי מהצלחת, והניחו אותה כאשר הצד של התאים פונה כלפי מעלה בתוך צלחת תרבית חדשה המכילה XPBS אחד. המשיכו למעבדת המיקרוסקופיה האלקטרונית.
יש לפעול לפי פרוטוקולי EM סטנדרטיים. כדי לקבע, לצבוע ולהוציא מים מהדגימות, הכין שרף epon והנח את כיסוי הזריקה כאשר צד התא פונה כלפי מטה על גבי מבחנה מלאה בשרף epon. אפשר לשרף להתבל crystallize בטמפרטורה של 60 °C למשך 24 שעות.
כדי להסיר את זכוכית המיסך (cover slip) משרף ה-epon, טבול אותה במהירות בחנקן נוזלי. הלם הטמפרטורה מ-60 °C ל-196 °C-.
מסיר את כיסוי הזריקה (cover slip) מתוך צינור השרף. המתן חמש עד 10 דקות, ולאחר מכן הוצא את הצינור, שכעת הוא נקי מכיסוי הזריקה. תחת מיקרוסקופ דיסקסיבי (dissecting scope), בחן את פני השטח של השרף כדי לאתר את הגריד הרלוונטי.
באמצעות להב תער סטרילי או סקלפל, גזרו את בלוק ה-epon כך שרק הרשת הרלוונטית תהיה בנקודת השיא של הבלוק. בעזרת ultra microtome, חתכו חתכים סדרתיים מהבלוק הגזור; השתמשו ב-uranyl acetate וב-lead citrate כדי לצבוע את החתכים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. אתרו את התאים הרצויים במיקרוסקופ האלקטרונים תוך שימוש במיקומם היחסי של התאים כמדריך, ובהתבסס על תמונות הפלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה שצולמו קודם לכן.
זהו אזורי העניין במיקרוגרף האלקטרוני התואמים את האות הפלואורסצנטי. השתמשו בנקודות ייחוס, כגון מיקום ההטרוכרומטין והמעטפת הגרעינית, כדי לקבוע איזו תמונת Zack פלואורסצנטית תואמת לפרוסת ה-EM. בעת הצפייה באמצעות תוכנת דימיון כגון Image J או Adobe Photoshop, הפחיתו את השקיפות של התמונה הפלואורסצנטית ל-50% והניחו אותה ככיסוי על גבי תמונת ה-TEM התואמת.
יישרו את התמונות על ידי כיוון קנה המידה המוצג. אלו הן התוצאות מהזרקה מיקרוסקופית וממיקרוסקופיה אלקטרונית ואורית קורלטיבית. תמונה זו מציגה מיקרוגרף בשדה בהיר של תאי NRK הגדלים על לוח כיסוי זכוכית עם רשת חרוטה בלייזר.
שימו לב לאותיות הרקע b ו-m המשמשות לזיהוי הרשת המכילה תאים מוזרקים. החיצים מצביעים על שני התאים שזוהו והדמיות בוצעו להם במיקרוסקופיה אלקטרונית. מוצגת כאן תמונה פלואורסצנטית של צבע המעקב האינרטי cascade blue המשמש לזיהוי תאים שהוזרקו במיקרו-הזרקה.
להלן תמונה משולבת (overlay) של אותות שדה בהיר (brightfield) ופלואורסצנציה של מולקולה קטנה המסומנת באמין. פאנל זה מייצג את המתאם בין מיקרוסקופיית שדה בהיר, פלואורסצנציה ומיקרוסקופיה אלקטרונית של תא מוזרק. ראש החץ מצביע על נקודות פלואורסצנטיות (puncta) שצולמו בהגדלה גבוהה יותר בפאנל זה.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע הזרקה מיקרוסקופית (microinjection) של חלבון עניין ולעקוב אחר השינויים המורפולוגיים התת-תאיים שהוא גורם, וזאת באמצעות פרוצדורה של microinjection Clem או מיקרוסקופיה קורלטיבית של אור ואלקטרונים (correlative light and electron microscopy).
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
טכניקת ה-CLEM מאפשרת ניתוח של המורפולוגיה האולטרה-מבנית של ממברנות ואברונים המושפעים ממולקולות שהוזרקו במיקרו-הזרקה. באמצעות שילוב של מיקרו-מניפולציה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית ומיקרוסקופיה אלקטרונית, שיטה זו מאפשרת דימוי ברזולוציה גבוהה מקנה מידה של מילימטרים ועד לננומטרים בודדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- המחקר מתמקד בהשפעות של מולקולות קטנות או חלבונים על תאי יונקים בתרבית.
- סימון פלואורסצנטי מאפשר מעקב אחר מולקולות אלו בתוך התאים.
- שילוב של טכניקות מיקרוסקופיה שונות משפר את הרזולוציה של השינויים הנצפים.
- הבנת התגובות התאיות ברזולוציות שונות היא קריטית למחקר בתחום מדעי המוח.
מטרת המחקר
- החדרת מולקולות מסומנות פלואורסצנטית לתאי יונקים.
- תצפית על שינויים מורפולוגיים המושרים על ידי מולקולות אלו.
- ביצוע קורלציה בין תמונות מטכניקות מיקרוסקופיה שונות לצורך ניתוח מפורט.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול תאי יונקים על לוחות כיסוי מזכוכית עם רשת (gridded glass cover slips).
- הזרקה מיקרוסקופית (Microinjection) של מולקולות קטנות או חלבונים המסומנים פלואורסצנטית לתאים.
- קיבוע תאים באמצעות פורמאלדהיד לצורך דימוי במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- קיבוע באמצעות גלוטראלדהיד, חיתוך, צביעה ודימוי באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית.
תוצאות עיקריות
- תמונות ברזולוציה גבוהה חושפות הפרעות שנגרמו על ידי המולקולות שהוזרקו.
- הצלחה ביישור (alignment) של תמונות ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה אלקטרונית.
- הוכחת היכולת של CLEM לנתח מבנים תת-תאיים.
- מתן תובנות לגבי שינויים מורפולוגיים בקני מידה שונים.
מסקנות
- טכניקת ה-CLEM יעילה לחקר תגובות תאיות למולקולות שהוחדרו במיקרו-הזרקה.
- שילוב של טכניקות דימות מאפשר ניתוח מקיף של מורפולוגיה תאית.
- ניתן ליישם שיטה זו בתחומי מחקר שונים במדעי העצבים ובביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה משולבת של אור ואלקטרונים (CLEM) מאפשרת לצוותי ביו-פארמה להדמיות את הלוקליזציה התת-תאית המדויקת ואת ההשפעה המורפולוגית של מולקולות שהוחדרו בתהליך של מיקרו-הזרקה לתאים אוקריוטיים. גישה דו-מודאלית זו מגשרת על הפער בין דימוי פלואורסצנטי דינמי לבין מיקרוסקופיה אלקטרונית של מבנה על (ultrastructural), ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף של מטרות ביולוגיות. שילוב של CLEM בתהליכי הגילוי מגביר את רמת הביטחון החזויה בהערכה של תרכובות וביולוגים בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של הפרעות מולקולריות ברזולוציה סוב-צלולית לצורך תיקוף תפקודי של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קורלציה בין לוקליזציה מולקולרית לבין שינויים אולטרה-סטרוקטורליים.
- מקל על חקירה מונחית-היפותזה של השפעות של חלבונים או מולקולות קטנות בתוך מדורים תאיים רלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פלטי דימות מאושרים לפיתוח בדיקות (assays) ותהליכי סריקה בהמשך הדרך.
- מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה באמצעות שימוש בכיסויי זכוכית (coverslips) עם רשת למעקב מדויק אחר תאים.
- מספק נתונים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית להכוונת הבחירה ותיעדוף של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מדדים מורפולוגיים תת-תאיים לאסטרטגיות של סממנים ביולוגיים תרגומיים כאשר הדבר רלוונטי.
- שומר על רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני על ידי מתן תובנות מכניסטיות ברזולוציה גבוהה.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על ויזואליזציה ישירה של תגובות תאיות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטת ה-CLEM משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לדימות קורלטיבי ברזולוציה גבוהה של מולקולות שהוזרקו במיקרו-הזרקה והשפעותיהן התאיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי קישור לוקליזציה מולקולרית לתוצאות אולטרה-מבניות.
- סריקה: מספקת נתוני דימוי כמותיים הניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה ישירה בין תנאי ניסוי לביקורת באמצעות דימויי פלואורסצנציה ו-EM מיושרים.
- מחקר תרגומי: מספקת תובנות מכניסטיות המכוונות התאמה של ביומרקרים ובחירה של מודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימוי רב-פעמית למגוון מטרות מולקולריות ותאיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי העבודה בדימוי ושיפור השחזוריות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים עתירי-תוכן בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם-סיכון וקידום מועמדים על בסיס ראיות תאיות ישירות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות הן בטכניקות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית והן במיקרוסקופיה אלקטרונית.
- דורש גישה למכשור ייעודי, כולל מערכות להזרקה מיקרוסקופית (microinjection) ומיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנת דגימות וליישור תמונות.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה לסוגי תאים או למחלקות מולקולריות שונות.
- התפוקה מוגבלת בשל שלבי ההזרקה המיקרוסקופית והדימות הידניים.
