Name: DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: חקור תבניות הסתעפות אקסונים בנוירוני DRG בהכנת הר שלם של חוט שדרה עוברי בעכבר. שיטת DiI מאפשרת ניתוח מבנה ענפי עצבים וזיהוי מולקולות המווסתות התפתחות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר אליסטר Garratt (מקס Delbrück מרכז ברלין) על הערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז מחקר שיתופי (SFB665) של מועצת המחקר הגרמנית (DFG).

1. Dissection ההליך הערה: שימוש ניסיוני של עכברים צריך לעקוב אושרה רשמית הנחיות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההכנה, להגדיר מיקרוסקופ לנתח שלך לפרוס את מכשירי ניתוח הדרוש לנתיחה כולל מספריים גדולים וקטנים, מלקחיים שיניים גדולות, מלקחיים מעוקל ארבעה סטים של דומון No.5 לנתח מלקחיים (שתיים מהן בתוך מלוטשת טיפים) ( לפרטים ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד). מניחים פיסת נייר מסנן צלחת 100 מ&quot;מ פטרי Sylgard מצופה. יוצקים קר PBS בבארות של צלחת 12 באר, צלחת פטרי 100 מ&quot;מ ו - צינור 12 מ&quot;ל ולהשאיר על הקרח. פיפטה 2ml של חיץ קיבעון (paraformaldehyde 4% ב-PBS, pH 7.4) היטב כל צלחת 12 גם המקום השני על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה, להקריב את הסכר בהריון בעיתוי ב E12.5 (זיהוי של תוסף הנרתיק יועד E0.5), במקום את העכברעם למעלה בצד הגחון שלו על שלושה גיליונות של מגבות נייר להשרות את אזור הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל abdominopelvic, לבודד את קרני הרחם דו צדדי ולהעביר אותם לתוך אחד 100 מ&quot;מ עם מאכלים קרים כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בקרה מיקרוסקופית, לעשות חתך אורכי דופן הרחם עם, מספריים קטנים ישר לחתוך כל שק השפיר של השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלף את שק השפיר של העובר כל לחתוך את חבל הטבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים קטנים, לערוף את העוברים ולשים את הראש או חלק מהם בצד הבידוד של הדנ&quot;א הגנומי אם genotyping צריכה להיות חובה. לאחר מכן, להעביר את torsi את בארות בהתאמה של הצלחת 12-היטב עם קור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את נייר הסינון בצלחת Sylgard עם כמה טיפות של PBS ואת המיקום הטורסו עובריים עם הצד הגבי שלה על הנייר. כדי להשיג יציבות טובה יותר, ליישר את זנבו הגפיים מהגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודהתחת מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה של כ 16x, בזהירות קמצוץ את עור העובר מעל חוט השדרה עם שני זוגות מלקחיים היטה בסדר בעדינות לקרוע אותו לגזרים. החל באמצע, המשך ראשון לקראת הזנב ואז לחדש מאמצע כלפי הצד הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את העובר מעת לעת עם שתיים או שלוש טיפות של PBS כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע זאת DRG הם דמעו מן חוט השדרה כאשר הוא הוסר העובר לנתק את DRG ואת חוט השדרה מהעמודה סביב השדרה סחוסי ידי תנועות החלקה אופקי עם להב של מלקחיים בסדר בתוך מלוטשת טיפים. החל באמצע הצד הימני של העובר, דרך העבודה שלך לכיוון הזנב ואז לסיים את הקדמי. לאחר מכן, לחזור על התהליך בצד השני. היזהר שלא לקרוע את DRG קשור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק לחלוטין את חוט השדרה משוחרר מן העובר, להרים cervic שלהאל חלק עם מלקחיים בסדר למשוך אותו החוצה בחתיכה אחת לקראת סוף הזנב שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את חוט השדרה מבודד עם DRG מחוברת היטב של צלחת 12-הבאר מלא חיץ קיבעון ולהמשיך עם הכנת מיתרי השדרה של העוברים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מיתרי השדרה לפחות שעתיים על הקרח. </li></ol> 2. DiI תיוג של נוירונים DRG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל חוט השדרה כדי להיות מתויג, להכין שתי מחטים זכוכית עם חולץ micropipette. אנו משתמשים במודל סאטר חולץ P-97 אלקטרודה (הגדרת התוכנית: 1 היט = 625, לוול ךיב = 35, TIME = 175; היט 2 = 600, לוול ךיב = 25, TIME = 175; היט 3 = 630, לוול ךיב =... 30, TIME = 150). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בקרה מיקרוסקופית לטבול את קצה מחט כל כוס שלוש עד חמש פעמים בתמיסה (w / v) 5% DiI באתנול. אידוי של אתנול יוצר שכבה דקה של קריסטלים DiI על המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה של 40X בערך, במקום חוט השדרה שלה עם vבצד entral עד בשקופית. בעזרת מספריים באביב, פתח את חוט בצד הגחון ב אורכו על ידי חיתוך דרך floorplate כדי לאפשר לאחר מכן הרכבה של הכנת במצב ספר פתוח, הפוכה (ראה סעיף ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את חוט השדרה עם הצד הגבי עד בשקופית. ואז באופן ידני הגישה את כבל עם קצה DiI המכוסה של המחט תחת זכוכית להדמיה מיקרוסקופית ובזהירות לנקב כל DRG השני בצד אחד של חוט השדרה. אין כמעט עקבות של DiI צריך להיות גלוי DRG פירסינג כדי להבטיח את תיוג של מספר קטן בלבד של נוירונים. קח מחט השני בצד השני של החוט. מכוון רק כל DRG second נמנעת חפיפה של תחזיות axonal שכותרתו מ DRG שכנות אשר עלול לסבך את הבידול של אקסונים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את חוט השדרה למאגר קיבעון ו דגירה בחושך במשך לפחות שש שעות בטמפרטורת הסביבה או לילה ב 4 ° C כדי לתת זמן כדי לצבוע diffuse לאורך האקסון בתוך קרום התא. אפשר לתקופת דגירה ארוכה יותר (עד יומיים ב 4 ° C) אם הניתוח של צמיחה בטחונות לתוך חוט השדרה הוא הרצוי. </li></ol> 3. הרכבה ואת ניתוח מיקרוסקופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות עמדת לצבוע דיפוזיה, חוט השדרה יחיד עם הצד הגבי שלה על coverslip לירידה של PBS. תשמרי על עצמך כי DRG המחוברים בצורה נכונה אוריינטציה רוחבית לא להתערבב. לשאוב נוזל עודף לרדד את כבל במצב פתוח ספר הפוכה באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהר הכנה בשקופית באמצעות מיקרוסקופ PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע גידול של ניתוח כתמים לא רצויים ברקע מיקרוסקופיים הקרינה של תחזיות axonal שכותרתו אמור להתבצע ביום גובר. עד אז לשמור את השקופיות בחושך ב 4 ° C. </li></ol> 4. נציג תוצאות: חוט השדרה של העכבר מקבל יחסי ציבור מביאojections מתוך 8 זוגות של צוואר הרחם, 13 זוגות של החזה, 5 זוגות זוגות המותני ו -4 של עצם העצה DRG בהיקף של עד 60 הגרעינים השדרה. לאחר כמה אימונים חוט שדרה עם DRG הכי מחוברת עדיין יכול להיות מבודד העובר בתוך פחות מחמש דקות. הליך זה מתאים הבידוד של מיתרי השדרה עם DRG המצורפת מתוך E11.5 כדי E13.5 עוברי עכברים. עם זאת, התוצאות הטובות ביותר מושגות מתוך E12.5. תוצאות למופת של ההליך תיוג המתואר כאן מוצגים באיור 3. תיוג של DRG על אורכו של חוט השדרה עלול לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכמת התנהגות הסתעפות axonal ברמות שונות בחוליות (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> באיור 1. תוכנית המתארת ​​את שני המצבים העיקריים של הסתעפות axonal. (א) מסעף ידי הפעילויות של חרוט צמיחה שעלולה להוביל הסתעפות - כפי שצוין כאן - כמו גם סוכות מסוף מורכבים או(ב) בטחונות היווצרות הפיר האקסון (ביניים הסתעפות). מצב זה האחרון הוא סוג של הסתעפות שולט מקרין אקסונים הקורטיקליים thalamocortical 6,7. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> איור 2 מביא תחזיות של נוירונים DRG לתוך חוט השדרה העובר להציג שני סוגים של הסתעפות axonal:. אקסונים הסניף הראשון דח על ידי הסתעפות (1) ו מן הטופס סניפים בטחונות וכתוצאה מכך הבת לאחר תקופת המתנה על ידי ביניים הסתעפות (2). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> באיור 3. ויזואליזציה של מסלולי axonal יחיד של נוירונים DRG עובריים בעכבר. (א) חוט השדרה עם DRG מצורף מוכן מעובר E12.5 העכבר. (סרגל קנה מידה, 1 מ&quot;מ.) (BD) צפיות הגבי של DRG-DiI שכותרתו של wild-type עכברים בהגדלה הגדלת מוצגים. ב &#39;כל DRG השני הוא labeleד על ידי DiI. תמונות הקרינה הם הפוכים, הזנב הוא בצד שמאל וב C ו-D, לרוחב הוא בתחתית. ב C מספר קטן של אקסונים הוא שכותרתו בהגדלה גבוהה נוכחות של T-כמו ענפים ניתן לזהות דח של חוט השדרה. (מוטות קנה מידה, 250 מיקרומטר (ב), 100 מיקרומטר (ג) ו - 50 מיקרומטר (ד)). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> איור 4. כימות בצורת האות T סניפים, פונה מקורי או הזנב יחיד wild-type ו-C-type natriuretic פפטיד (CNP) מחסר עכברים בבית E13.5. המספרים של אקסונים יחיד נספר ניתנים בסוגריים רמות גזע שונה גנוטיפ של כל אחד. C-או R-הופך - צמיחה רק בכיוון הזנב או מקורי, בהתאמה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> איור 5. מסלול איתות cGMP מעורר הסתעפות האקסון חושי בשעה דח של חוט השדרה. (א) סכמתאת מסלול איתות cGMP המורכבת ליגנד CNP, הקולטן guanylyl cyclase Npr2 ואת סרין / תראונין קינאז cGKIα בנוירונים DRG עובריים. Npr2 מייצר cGMP מ GTP על ידי גירוי CNP. (ב) DiI מעקב של אקסונים יחיד של DRG נוירונים בעכברים wild-type ו-CNP לקוי. (סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר).

<ol><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li>
<li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li>
<li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li>
<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li>
<li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding%3A+implications+for+target+recognition+and+%26quot%3Bwaiting+periods%26quot%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &quot;waiting periods&quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li>
<li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li>
<li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+natriuretic+peptide+%28CNP%29+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li>
<li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li>
<li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

דפוסי הקרנת סטריאוטיפית הכוללת את שני הסוגים של היווצרות ענף axonal יחד עם קלות הכנה בשילוב עם שימוש ברקמת קבוע DiI תיוג הופך את חוט השדרה העובר צמוד עם DRG מודל חיובי ללמוד axonal הסתעפות. היישום של כמויות זעירות של DiI באמצעות מחטים זכוכית מצופה מאפשר - בניגוד תיוג עיקר DRG - להדמיה של קבוצות קטנות של נוירונים DRG ובכך ניתוח של אקסונים הפרט דפוסי הסתעפות שלהם. השיטה המתוארת אפשר לשפר עוד יותר על ידי הזרקת iontophoretic של נותב lipophilic אשר מקטין עוד יותר את מספר הנוירונים שכות...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Stereomicroscope STEMI DRC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו פתרון (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> מרק </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים כירורגית רגילה </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים תקן שיניים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> תוספת קנס איריס מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Curved מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> דומון No.5 בסדר טיפים מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> דומון No.5 המראה לסיים מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas-טובינגן באביב מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> מסנן נייר </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Precission העולם מכשירים </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ צלחות פטרי </td><td> גריינר </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 מ&quot;ל צינור פוליפרופילן </td><td> קרל רוט GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12 גם תרבות צלחת </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> מרק </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / בראון micropipette חולץ P-97 </td><td> סאטר Instrument ושות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> בורוסיליקט זכוכית נימי </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DiI (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3 &quot;, 3&#39;-tetramethyl - indocarbocyanine פרכלורט) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות SuperFrost פלוס </td><td> קרל רוט GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית תלושי </td><td> קרל רוט GmbH </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-תיוג של נוירונים drg לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

כאן אנו מציגים טכניקה התווית מסלולים של קבוצות קטנות של נוירונים DRG לתוך חוט השדרה העובר על ידי מכתים diffusive באמצעות נותב lipophilic 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3 &quot;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine (DiI) פרכלורט 1 . ההשוואה בין המסלולים axonal של wild-type עם אלה של קווי העכבר אילו גנים שעברו מוטציה המאפשרת בדיקת תפקיד פונקציונלי של חלבונים מועמד בשליטה על הסתעפות axonal המהווה מנגנון חיוני החיווט של מערכת העצבים. הסתעפות axonal מאפשר נוירון יחיד להתחבר עם מטרות מרובות, ובכך לספק את הבסיס הפיזי של עיבוד מקבילי של מידע. השלכות על אזורים יעד ביניים של צמיחה axonal ניתן להבחין בין arborization סופנית. יתר על כן, מצבים שונים של היווצרות ענף axonal ניתן לסווג תלוי אם תוצאות מסתעפת מן הפעילויות של חרוט צמיחה (פיצול או חזייה מתעכבnching) או מפני נביטה של בטחונות מן הפיר האקסון בתהליך הנקרא הסתעפות ביניים 2 (איור 1). תחזיות המרכזית של נוירונים של DRG להציע מערכת ניסיונית שימושי ללמוד את שני הסוגים של הסתעפות axonal: כאשר האקסונים שלהם מביא להגיע השורש הגבי כניסה לאזור (דח) של חוט השדרה העובר בין ימים 10-13 (E10 - E13) הם התצוגה דפוס סטריאוטיפי של T-Y או בצורת הסתעפות. שני אקסונים הבת וכתוצאה מכן להמשיך בכיוונים מקורי או הזנב, בהתאמה, בשוליים דורסולטרלי של חוט ורק לאחר תקופת המתנה בטחונות צומחים מתוך גזע אקסונים אלה לחדור את החומר האפור (ביניים הסתעפות) ואת פרויקט ספציפי של נוירונים ממסר רבדים של חוט השדרה שם הם עוד arborize (מסוף הסתעפות) 3. העתקים DiI חשפו קונוסים צמיחה בכל אזור הכניסה השורש הגבי של חוט השדרה זה נראה ב-PRocess של פיצול טוען כי הסתעפות נגרמת על ידי פיצול של חרוט הצמיחה עצמה 4 (איור 2), עם זאת, אפשרויות אחרות נדונו גם 5. וידאו זה מדגים הראשונה איך לנתח את עמוד השדרה של עכברים E12.5 עוזב DRG המצורפת. קיבעון בעקבות הסכומים דגימה קטנה של DiI מוחלים DRG באמצעות מחטים זכוכית משך משפופרות נימי. לאחר שלב דגירה, חוט השדרה שכותרתו מותקן כהכנה פתוח ספר הפוך לנתח אקסונים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תחזיות סטריאוטיפית של afferents חושי אל חוט השדרה מכרסם להציע מערכת ניסיונית נגיש ללמוד axonal מסתעפת דרך התחקות של אקסונים יחיד.

DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר

כאן אנו מציגים טכניקה לסימון מסלולי נדידה של קבוצות קטנות של נוירונים מהגנגליון של השורש האחורי (DRG) אל תוך חוט השדרה העוברי, באמצעות צביעה דיפוזית באמצעות ה...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדמיות של דפוסי ההסתעפות של אקסונים בודדים של נוירונים ב-DRG בתוך תכשיר whole mount של חוט שדרה עוברי של עכבר. כדי לזהות מולקולות המעורבות בהסתעפות אקסונית, ההשלכות של נוירוני DRG לתוך חוט השדרה של העכבר מציעות מערכת ניסוית פשוטה, קלה ונגישה לחקר הסתעפות אקסונית. כאשר אקסונים מסוג ENT של נוירוני DRG מגיעים לאזור הכניסה של השורש הגבי (dorsal root entry zone) של חוט השדרה, הם מציגים דפוס סטריאוטיפי של פיצול דו-כיווני בצורת T או Y.שני אקסוני הבת הנוצרים ממשיכים בכיוונים רוסטרליים או חוטיים, בהתאמה, בשוליים הלטרליים-דורסליים של החוט. רק לאחר תקופת המתנה, נבטים קולטרליים מאקסוני גזע אלה חודרים לחומר האפור ומקרינים לנוירוני ממסר בשכבות ספציפיות של חוט השדרה, שם מתרחשת הענפה טרמינלית. סרטון זה מדגים תחילה כיצד לבצע דיסקציה של חוט השדרה.בעזרת DRG המחובר לדגימה מעובר עכבר ביום 12.5, לאחר קיבוע הדגימה, מיושמות כמויות מזעריות של dii ל-DRG באמצעות מחטי זכוכית שנמשכו מצינורות קפילריים. לאחר שלב אינקובציה, חוט השדרה המסומן מורכב כהכנה של ספר פתוח הפוך (inverted open book preparation) כדי לנתח אקסונים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הסתעפות של אקסונים היא היבט חשוב בפיתוח של קישוריות עצבית. השיטה המוצגת כאן מאפשרת השוואה בין תבניות הסתעפות מסוג Y לבין אלו של עכברים מוטנטים, ובכך מאפשרת זיהוי של מולקולות המווסתות הסתעפות אקסונלית.ראשית, הגדירו את מיקרוסקופ הדיסקציה וסדרו את כלי הניתוח הדרושים לביצועה. הניחו דף של נייר סינון בתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר המצופה ב-silk guard. לאחר מכן, מזגו PBS קר לתוך בארות של פלטה בעלת 12 בארות, לצלוחת פטרי בקוטר 100 מילימטר ולמבחנה בנפח 12 מיליליטר, והשאירו על קרח.טפטפו שני מיליליטר של בופר קיבוע 4% paraldehyde לכל באער של פלטת 12 באערים שנייה והניחו על קרח. לאחר בידוד קרני הרחם הדו-צדדיות מעכבר, העבירו אותן לצלחת של 100 מילימטר עם PBS קר מאוד. לאחר עריפת העוברים, העבירו את ה-toci של העוברים לפלטת ה-12.הרטיבו את נייר הסינון בצלחת הגנת ה-S בעזרת מספר טיפות של PBS והניחו עוברי גוף כאשר צדם הגבי (דורסלי) פונה כלפי מעלה על הנייר ליציבות טובה יותר. יישרו את הזנב והגפיים הרחק מהגוף בעבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה של כ-16 פעמים. צבטו בזהירות את עור העובר מעל חוט השדרה באמצעות שתי זוגות של פינצטות בעלות קצה דק, החל מהמרכז.קרע בעדינות את העור תחילה לכיוון הזנב, ולאחר מכן חזור מהמרכז לכיוון הצד הקדמי. הרטב את העובר מדי פעם בשתי או שלוש טיפות של PBS כדי למנוע התייבשות ולהבטיח שגנגליות השורש הדורסליות (DRG) לא ייקרעו מהחוט השדרתי. לאחר ההסרה, נתק את ה-DRG ואת החוט השדרתי מעמוד השדרה הסחוסני שמסביבם, על ידי התחלה במרכז הצד הימני של העובר ועבודה לכיוון הזנב, ולאחר מכן לקצה הקדמי, כדי לנתק לחלוטין את החוט השדרתי המשוחרר מהעובר.הרימו את חלקו הצווארי באמצעות פינצטה עדינה ומשכו אותו בשנית אחת לכיוון חוט השדרה. טבלו את חוט השדרה המבודד עם ה-DRG המחובר אליו לבאר בתוך פלטת 12 בארות המלאה בבופר קיבוע, והמשיכו בהכנת חוטים שדרתיים משאר העוברים.קבעו את חוט השדרה במשך שעתיים לפחות על קרח עבור כל חוט שיוסמן, והכינו שתי מחטי זכוכית באמצעות מושך מיקרו-פיפט תחת בקרה מיקרוסקופית. טבלו את קצה כל מחט זכוכית שלוש עד חמש פעמים בתמיסה של 5% של צבע באתנול כדי ליצור שכבה דקה של גבישי צבע על המחט, תוך עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה של כ-40 פעמים. הניחו חוט שדרה כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה על תבנית בעזרת מספרי קפיץ.פתחו את חבל השדרה בצדו הוונטרלי לאורך כל אורכו על ידי חיתוך דרך ה-floor plate כדי לאפשר קיבוע בשיטת "ספר פתוח" הפוך. מקמו את חבל השדרה על העגלה כאשר הצד הדורסלי פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, התקרבו ידנית לחבל השדרה עם קצה מחט הזכוכית המכוסה ב-dai ונקבו בזהירות כל גנגליון שורש אחורי (DRG) שני בצד אחד של חבל השדרה.כמעט ואין לראות עקבות של dai ב-DRG הנדקר כדי להבטיח סימון של מספר קטן בלבד של נוירונים באמצעות המחט השנייה. חזור על הפעולה עבור הצד השני של חוט השדרה, תוך כיוון לכל DRG שני בלבד, כדי למנוע חפיפה של שלוחות אקסוניות מסומנות מאזורים סמוכים, מה שעלול לסבך את ההבחנה בין אקסונים בודדים.החזירו את חוט השדרה למסלק הקיבוע והבקיעו בחושך למשך שש שעות לפחות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 °C, כדי לאפשר לצבע לדיפוזיה לאורך האקסון בתוך ממבנה הפלזמה. לאחר דיפוזיית הצבע, הניחו חוט שדרה בודד בצד הגבי שלו כלפי מטה על לבידה בטיפת PBS, שאבו נוזלים עודפים, ושטחו את חוט השדרה במבנה של ספר פתוח הפוך באמצעות פינצטה.יש לוודא כי ה-DRG המחוברים מונחים כראוי באוריינטציה לטרלית ואינם נשבקים זה בזה. יש להכין את הדגימה על תית השמירה של מיקרוסקופ באמצעות PBS כדי למנוע עלייה בצביעת רקע לא רצויה. יש לבצע אנליזה במיקרוסקופ פלואורסצנציה של השליחות העצביות (axonal projections) המסומנות ביום הכנת הדגימה. עד אז, יש לשמור את התיתים בחושך בטמפרטורה של 4°C.כאן מוצגים מבטים גביים של גנגליון השורש האחורי (DRG) המסומנים ב-Dai מעכברי פרא (wild type) בהגדלות גדלות, כפי שמתואר בכל שנייה. ה-DRG סומן באמצעות Dai. כאן מספר קטן של אקסונים מסומנים ובבהגדלה גבוהה יותר, ניתן לזהות נוכחות של הסתעפויות דמויות T באזור הכניסה של השורש האחורי לסרבל (spinal cord).ענפים בצורת T. כאן נמדדים סיבובי R רוסטרליים או סיבובי C קורדליים בודדים במפלסים ורטברליים שונים, הן בעכברים מסוג בר (wild type) והן בעכברים עם חסר ב-C type natriuretic peptide CMP. בשלב E 13.5.מספר הנוירונים הכולל שנספרו מוצג בסוגריים ואחוז סוג המסלול מוצג למטה. בניגוד לאקסונים מסוג בר (wild type) של נוירוני DRG, במוטנטים של סיגנלינג CMP הם פונים רק לכיוון אחד במקום להתפצל באזור הכניסה של השורש הגבי (dorsal root entry zone) של חוט השדרה. שיטה זו סייעה לנו לזהות קסקדת סיגנלינג של CGP שהיא חיונית להתפצלות של נשואים תחושתיים באזור הכניסה של השורש הגבי.בניגוד למאפייני הטיפוס הפראי של cgm, תנועת סיגנל P פונה לכיוון אחד בלבד במקום להתפצל באזור הכניסה של השורש הגבי (dors root entry zone). מחקרים אלו חשפו גם כי היווצרות co אינה מושפעת במוטנטים של סיגנל P ב-CG, מה שמעיד על כך שהסוג השני של הסתעפות אקסונית שנצפה בנוירוני DGen מווסת באופן שונה.

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מדגימים את השימוש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים פרוסות המוח של מכרסמים פרימטים שאינם בני אדם בגילאים שונים. במקרה הספציפי הזה, אנו משתמשים בעכברים בוגרים (3-6 חודשים) וקופים cynomologus מבוגר (9-15 שנים). טכניקה זו, שתוארה לראשונה על ידי במעבדה של ד"ר ליכטמן...

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

הר הכנה שלמים של המבוגר תסיסנית עצבי חוט הגחון עבור הזרקת סיבים ענק דיי

Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית...

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS)...

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי לגנוטיפ, צביעה והכנה של עכברים עובריים להדמיה של הקרנות אקסון נוציספטור היקפיות בבעל החיים כולו, כשיטה יעילה להערכת פנוטיפים של צמיחת אקסונים חושיים בפיתוח עכברים מהונדסים גנטית.

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשחול הידראולי של חוט השדרה וכן זיהוי ובידוד של גרעיני שורש גב ספציפיים (DRGs) באותו מכרסם. בהשוואה לשיטות בידוד חוט השדרה הסטנדרטיות, שיטה זו מהירה משמעותית ומפחיתה את הסיכון לנזק לרקמות.

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

בדו ח זה, היתרונות של תרבויות organotypic ותרבויות הפומבית העיקרי של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים מודגשים לחקור מגוון רחב של מנגנונים הקשורים אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, בתגובה זיהום ויראלי.

Explant של עכבר למבוגרים DRG הפומבית תא מודלים לחקור והנוירולוגיה הפלסטית ואת התגובות עלבונות סביבתי כולל זיהום ויראלי

אלקטרופורציה היא גישה יעילה כדי לספק את הגנים של אינטרסים לתוך תאים. על-ידי החלת גישה זה ויוו על הנוירונים של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון (DRG), נתאר מודל ללמוד האקסון התחדשות בתוך vivo.

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

מוצג כאן הפיתוח לרכישה עקבית של קטעי קריוסטט גנגליון שורש גבי באיכות גבוהה.

הליך עבור עכבר שורש גבי גנגליון Cryosectioning

גנגליוני שורש גביים (DRG) מכילים גופי תאי נוירון חישה ראשוניים ומעבירים אותות חושיים היקפיים לחוט השדרה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לפירוק DRG בעכברים התומכת בבידוד סטנדרטי של גנגליונים שלמים מבניים, זיהוי סגמנטלי אנטומי, הכוונה אינטואיטיבית למשתמשים מתחילים, והפחתת פגיעות ברקמה פרוצדורלית.

ניתוח ובידוד של גנגליוני שורש גבי בעכבר

חקור תבניות הסתעפות אקסונים בנוירוני DRG בהכנת הר שלם של חוט שדרה עוברי בעכבר. שיטת DiI מאפשרת ניתוח מבנה ענפי עצבים וזיהוי מולקולות המווסתות התפתחות עצבית.

DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר

גלה סרטונים נוספים