Name: הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: למד לייצר תרביות רפסודות אורגנוטיפיות מקרטינוציטים אנושיים ראשוניים או מקווי תאים אפיתליים מבוססים. שיטה זו מאפשרת הערכת הבדלות אפיתלית וחקר אינטראקציות נגיף:מארח בתנאים הדומים לסביבה ביולוגית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות סאלי רוברטס (אוניברסיטת בירמינגהם, בירמינגהם בבריטניה) מתנה סוג של נוגדנים E1E4. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לסרטן (4R00CA137160-03).

1. לקראת תרבויות רפסודות Organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרפסודה רשתות מתכת הרבה 1 להיות מטופלים עם חומצה גופרתית כרום כדי להסיר שאריות שעלולה להפריע לתהליך הבידול. רשתות מתכת לטבול בכוס כוס המכילה חומצה גופרתית למשך שעה אחת, ואז שטף ברציפות לילה עם מי ברז. לאחר לילה לשטוף, רשתות הרפסודה יש ​​לשטוף במשך 3-5 שעות במים מזוקקים פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לספק תמיכה רפסודות את, לכופף משלושה צדדים של הרפסודה על 0.5 ס&quot;מ במרחק שווה זה מזה. רשתות המתכת אמור להיות autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את החיץ הכינון מחדש 10X ידי הוספת 2.2 גרם ו -4.8 NaHCO3 Hepes גרם. להמיס 100 מ&quot;ל של NaOH M 0.05. סנן לעקר ולאחסן ב 5 מ&quot;ל ב -20 aliquots ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DMEM 10X בלי סודה לשתייה. סנן לעקר ולאחסן ב 5 מ&quot;ל ב -20 aliquots ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן גורם אפידרמיס העכבר גידול: ממיסים 100 מ&quot;ג של EGF ו 10 מ&quot;ג של BSA כל 10 מ&quot;ל deionized DDH 2 0. שלב EGF ו BSA ומוסיפים 80 מ&quot;ל של deionized DDH 2 0 עבור נפח כולל של 100 מ&quot;ל. סנן-לעקר, aliquot (5 מ&quot;ל) ו חנות -20 ° C. עבור ליטר אחד של המדיום E להוסיף 5 מ&quot;ל של EGF 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(ריכוז סופי 5 ng / ml). </li></ol> 2. הכנת ג&#39;ל קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת ג&#39;ל קולגן נדרש כל רפסודה. קולגן יש לשמור על הקרח כדי למנוע לחיזוק. כל ג&#39;ל קולגן דורשת 3 מ&quot;ל של תערובת קולגן המכיל: 2.4 מ&quot;ל של סוג עכברוש זנב קר קולגן אני (הריכוז הסופי 3-4 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 0.3 חיץ מ&quot;ל הכינון מחדש 10X, 0.3 מ&quot;ל DMEM 10X and1-2 X 10 6 העכבר 3T3 J2 fibroblasts כתאים מזין. פתרונות ריכוז גבוה של קולגן זנב חולדה, לדלל חומצה אצטית 0.02 מ &#39;כדי להשיג את הריכוז בעבודה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר ג&#39;ל קולגן (רפסודות) תצטרך ולאחר מכן לחשב שילוב אב בסכום של קולגן, reconstit 10Xמאגר ution, DMEM 10X ו J2 fibroblasts הנדרש. כלול מספיק לערבב כל אב ג&#39;ל נוספות 3-4 בשל צמיגות של קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין ג&#39;ל קולגן, trypsinize את J2 fibroblasts ולנטרל עם המדיום. מערבבים את כל fibroblasts ומכניסים בקבוקון 50 מ&quot;ל חרוטית. לספור את התאים כדי לקבוע את מספר רפסודות שניתן לעשות. שוב, 1-2x10 6 fibroblasts נדרשים לכל ג&#39;ל קולגן ולכן לכל רפסודה. לסובב את התאים במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate בינוני של פיברובלסטים גלולה ו resuspend בסכום המתאים של חיץ הכינון מחדש 10X, 10X ו DMEM קולגן עבור מספר רפסודות מחושבים. הוסף קולגן האחרון למנוע את הג&#39;ל לחיזוק מהר מדי. לאחר קולגן נוסף, מערבבים במהירות, אך בעדינות כדי למנוע את כניסתה של בועות לתוך הג&#39;ל. ג &#39;ל צריך להיות צבע כתום אדמדם, מעיד על ה-pH הנכון. אם התערובת ג&#39;ל צהוב מדי, מוסיפים כמה טיפות של פילטר עיקור 1NNaOH ומערבבים בעדינות כדי לקבל את הצבע הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של קולגן: תערובת פיברובלסטים כדי הבארות של המנה תרבות 6 היטב. תערובת קולגן יש pipetted לאט בצד גם כדי למנוע כל יצירת בועות. מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס רקמת התרבות החממה ולאפשר לגבש במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 30 דקות, להוסיף 3 מ&quot;ל של מדיום E עם EGF לחלק העליון של ג&#39;ל קולגן הקרושה ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור. ג&#39;ל יש לשמור על 37 מעלות צלזיוס לפחות יום אחד, אבל להשתמש בתוך ארבעה ימים. תוצאות אופטימליות מתרחשים לאחר שני ימי דגירה. </li></ol> 3. קרטינוציטים הכנת התמיינות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרטינוציטים מעבר נמוכים יש גדל בכ 70% confluency. הרפסודה כל דורש 1-2x10 6 קרטינוציטים. Trypsinize את קרטינוציטים ולנטרל עם המדיום E עם EGF. לספור את התאים כדי לקבוע את מספר רפסודות שניתן לעשות. לסובב את התאים ב SPE נמוכהאד. Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מדיום E עם EGF עבור כל תרבות רפסודה מחושב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate בינוני מן ג&#39;ל קולגן על ידי צלחת הטיה 6 היטב. הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום E טרי עם EGF כדי ג&#39;ל זה. עבור כל ג&#39;ל, בזהירות להוסיף 1 מ&quot;ל של קרטינוציטים resuspended ל 2 מ&quot;ל של מדיום E הנוכחי כבר טוב. בעדינות pipet את קרטינוציטים בתוספת 2 מ&quot;ל של התקשורת ולאחר מכן אפשר נפתח חכם נפילה לאחור על ג&#39;ל. רעד או נדנדה צלחת עלול לגרום חלוקה לא שווה של תאים בצד אחד של ג&#39;ל קולגן. מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים צריך להיות מבוגר כדי confluency, החלפת בינוני E מדי יום. התאים confluent כאשר השינויים בינוני עד שיום אחד צהוב לאחר השינוי במדיום. זה בדרך כלל לוקח 2-4 ימים. אם המדיום לא השתנה מיום ליום 4, המשך לשלב הבא. </li></ol> 4. מה שהופך את התרבויות הרפסודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים סטריליות להציב רשת סטרילית רפסודה מתכת, כפוף הצדדים את, לתוך צלחת 10 ס&quot;מ. Aspirate בינוני של ג&#39;ל קולגן. כדי לשחרר את הג&#39;ל מצידי גם, עבור סביב היקף של ג&#39;ל עם מרית סטרילי באמצעות תנועה למעלה ולמטה. כדי להסיר את ג&#39;ל קולגן, להטות את הצלחת מעט להרים את ידי הצבת מתחת מרית. הנח את ג&#39;ל קולגן על רשת מתכת מבלי ליצור בועות בין הרשת לבין ג&#39;ל. שני ג&#39;לים ניתן למקם על רשת כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפוך את ממשק אוויר נוזלי, מוסיפים בינוני דואר ללא EGF לאט אל החלק התחתון של המנה כל כך את הרשת רפסודה נוגע לתקשורת אבל ג&#39;ל קולגן הוא לא. התקשורת לא צריכה לבוא דרך החורים ברשת. הוסף בינוני לאט, כדי למנוע יצירת בועות תחת הרשת, זה ימנע בידול אחיד. דגירה על רפסודות על 37 מעלות צלזיוס, לשנות את המדיום פעם ביומיים שמירה על ממשק אוויר נוזלי. למסוק את רפסודות לאחר 14 יום. </li></ol> 5. נציג תוצאות כאשר לאהוא פרוטוקול מבוצע כהלכה עם קרטינוציטים ראשוניים, הליך זה יביא האפיתל היטב מובחן שבו שכבות שונות של עור ניכרים. זה יושג באמצעות בדיקה היסטולוגית של מכתים קטעי תרבויות רפסודות עבור hematoxylin ו eosin (H &amp; E), כפי שמוצג באיור 1 ב. צביעת H &amp; E שימושית גם לבחון את המורפולוגיה של רפסודות ועל ההשפעה של וירוסים או תרכובות אנטי על היכולת של התאים לרבד ולהבחין. לדוגמה, רפסודות עשויות-HPV הנציח קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה (HFK-31) הם בעיקר בהשוואה עבה יותר כדי רפסודות עשויות רגילים קרטינוציטים העורלה האדם (HFK), המשקף שיעור מוגבר של שגשוג היכולת של חלבונים-HPV לשמור על התאים המבדילים פעיל במחזור התא (איור 1 ב) 10. התוצאה היא שימור של גרעיני ברחבי האפיתל, ואילו קרטינוציטים רגילים יציאה מחזור התא על בידול, והתוצאה היא התמוטטות שלגרעיני המעטפה. כדי לבחון מקרוב יותר בידול, אימונוהיסטוכימיה ניתן לבצע כדי לבדוק סמנים ספציפיים, כולל בידול cytokeratins, כמו גם involucrin ו filaggrin. Cytokeratins שונים באים לידי ביטוי בשלבים מסוימים של בידול 7. כפי שניתן לראות בתרשים 2, cytokeratin 10 (K10) לא באה לידי ביטוי ברובד הבסיסי, והוא נמצא רק בשכבות suprabasal המורכבות של תאים בהדרגה המבדילים. ב-HPV רפסודות חיוביים, ביטוי של K10 מתעכב בהשוואה לזו של קרטינוציטים רגילים, שוב המשקפות את השפעת חלבונים-HPV על בידול keratinocyte. אימונוהיסטוכימיה יכול לשמש גם כדי לבחון את פרופיל הביטוי של גנים נגיפיים. שמוצג באיור 3 הוא מכתים נציג לבחון את הביטוי של חלבון E1 HPV ^ E4, שהוא חלבון ז&quot;ל אשר הביטוי מוגבל בשכבות העליונות של האפיתל. כצפוי, לא מכתים הוא ציין בתרבויות רפסודות מן הומא רגילעכ קרטינוציטים העורלה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> איור 1. מתאר) של שיטה להכנת תרבויות רפסודות organotypic קרטינוציטים מן ראשוניים או שורות תאים אפיתל. ב) Hematoxylin ו eosin מכתים של תרבויות רפסודות organotypic שנוצר קרטינוציטים העורלה האדם ביציבות שמירה על HPV-31 (HFK-31) episomes, או רגילים קרטינוציטים העורלה האדם (HFK). שכבות אפיתל בודדים מזוהים, כמו גם התוספת קולגן. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> איור 2. Cytokeratin 10 (K10) הביטוי מוגבל שכבות suprabasal של האפיתל. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על חתכים של תרבויות רפסודות organotypic שנוצר HFK-31 תאים, כמו גם HFKs רגיל באמצעות נוגדנים ל-K10. ה-DNA התאי היה counterstained עם DAPI. תמונות נתפסו באמצעות confמיקרוסקופ פלואורסצנטי ocal. החצים מצביעים על שכבת הבסיס של האפיתל. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> איור 3. E1 HPV ^ E4 חלבון המיוצר בשלב מאוחר היצרני של מחזור החיים של נגיפי. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על חתכים של תרבויות רפסודות organotypic שנוצר HFK-31 תאים, כמו גם HFKs רגיל באמצעות נוגדנים E1E4. ה-DNA התאי היה counterstained עם DAPI. תמונות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. החצים מצביעים על שכבת הבסיס של האפיתל.

<ol><li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth%2C+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li>
<li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+%27simplified%27+skin%3A+control+of+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, Suppl . 27. 219-222 (1984).</li>
<li>Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBodily%2C+J+%22Organotypic+epithelial+raft+cultures+and+the+study+of+the+natural+history+of+human+papillomavirus%22">Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus</a>. , Caister Academic Press. Norfolk. (2006).</li>
<li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).</li>
<li>Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+papillomavirus+and+modulation+of+the+infectious+program+in+epithelial+raft+cultures.+OFF%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF.</a> Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).</li>
<li>Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis+of+oncogenic+human+papillomaviruses+requires+episomal+genomes+for+differentiation-dependent+late+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).</li>
<li>Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+as+important+regulators+of+terminal+differentiation%3A+examining+keratin+expression+in+individual+epidermal+cells+at+various+stages+of+keratinization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization.</a> The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).</li>
<li>Longworth, M. S., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+human+papillomaviruses+in+differentiating+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Review%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia.</a> Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).</li>
<li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li>
<li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+R+%22Differentiation+of+HPV-Containing+Cells+Using+Organotypic+Raft+Culture+or+Methylcellulose%22">Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose</a>. , Humana Press Inc. Totowa. 119-119 (2006).</li>
<li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

המתואר כאן שיטה, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד בידול אפיתל בכלל, אבל יכול גם להיות מותאם בקלות ללמוד הפתוגנזה ויראלי, כמו גם את היעילות של הרפוי פוטנציאליים. וירוסים רבים למקד לתאי האפיתל או כאתר העיקרי של זיהום, כמו במקרה של HPV, או בשלב מסוים במחזור החיים ויראלי, כמו herpesviruses. למרות גידול תרבויות רפסודות organotypic זמן רב, היכולת לשחזר בנאמנות על בידול אפיתל vivo מספק שיטה יעילה מאוד לבחון וירוס: תא אינטראקציות המארחות. בהצלחה לגדול האפיתל הבדיל באופן מלא יש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> זנב עכברוש קולגן סוג 1 (4-5mg/ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> DMEM ללא NaHC0 3 </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 </td><td> סיגמא </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Calbiochem </td><td> 391338 </td></tr><tr><td> נירוסטה רשתות מתכת </td><td> וויליאמס עוז ושות </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> E בינוני 11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> עוריות Growth Factor </td><td> BD Biosciences </td><td> 354010 </td></tr></tbody></table>

הדור של תרבויות רפסודות organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

פיתוח organotypic תרבויות רפסודות אפיתל סיפקה לחוקרים עם ויעיל במערכת במבחנה כי משחזר בנאמנות בידול אפיתל. ישנם שימושים רבים עבור מערכת זו. למשל, היכולת לגדול תלת ממדי תרבויות רפסודות organotypic של קרטינוציטים הייתה ציון דרך חשוב במחקר של וירוס הפפילומה האנושי (HPV) 1. מחזור החיים של HPV הוא קשור קשר הדוק בידול של האפיתל הקשקשי 2. Organotypic תרבויות רפסודות אפיתל כפי שתואר כאן לשחזר את כל מחזור החיים וירוס הפפילומה, כולל ייצור וירוס 3,4,5. בנוסף, אלה תרבויות רפסודות התערוכה נגעים שומות דומות לאלה שנצפו על זיהום vivo עם HPV. לכן מערכת זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד סרטן תאים אפיתל, כמו גם את ההשפעה של תרופות על התמיינות תאים אפיתל בכלל. פותח במקור על ידי Asselineau ו Prunieras <sלמעלה&gt; 6 ו שונה על ידי Kopan et al. 7, התרבות organotypic אפיתל מערכת רפסודה התבגר לתוך המודל, בכלל התרבות קל יחסית, הכוללת את הצמיחה של תאים על קולגן המתחבר שמרו על הממשק אוויר נוזלי (איור 1 א). במשך 10-14 ימים, התאים לרבד להבדיל, ויצרו אפיתל בעובי מלא שמייצר בידול ספציפיים cytokeratins. רפסודות שנקטפו ניתן לבדוק בהיסטולוגיה, כמו גם על ידי שיטות מולקולריות ביוכימיים סטנדרטיים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה לייצור של תרבויות הרפסודה של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה. באותה טכניקה ניתן להשתמש שהוקמו שורות תאים אפיתל, והוא יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם רקמות אפיתל מ ביופסיות נורמלי או חולה 8. וירוסים רבים היעד או אפיתל עורית או הרירית כחלק ממעגל החיים שלהם replicative. בשנים האחרונות, את הכדאיות של שימוש כת רפסודה organotypicures כשיטה של לימוד וירוסים המארחות אינטראקציות סלולריים הוכח על herpesviruses כמה, כמו גם adenoviruses, parvoviruses ו poxviruses 9. תרבויות רפסודות Organotypic ולכן יכול להיות מותאם לבחון הפתוגנזה ויראלי, הם האמצעי היחיד לבחון סוכני נגיפים חדשים עבור אותם וירוסים שאינם לעיבוד של שורות תאים קבע.

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיטת לחקות<em&gt; In vivo</em&gt; בידול האפיתל המתואר. וירוסים רבים למקד לתאי האפיתל במסגרת מחזור החיים הנגיפי שלהם, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת וירוס: אינטראקציות מארחים יותר מקרוב דומה לזו המתרחשת<em&gt; In vivo</em&gt;. טכניקה זו ניתן להשתמש עם קרטינוציטים ראשוניים, שורות תאים שהוקמו, כמו גם נורמלי או חולה רקמות ביופסיה.

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

פיתוחן של תרביות רפטי-אפיתל (raft cultures) אורגנוטיפיות סיפק לחוקרים מערכת יעילה למבחנה (in vitro) המשחזרת נאמנה את...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק תרביות רפטים (raft cultures) אורגנוטיפיות מקראטינוציטים ראשוניים או מקווי תאים אפיתליאליים מבוססים. הדבר מושג תחילה על ידי יצירת פלאגים של קולגן פיברובלסטים, ולאחר מכן שכבת תאים אפיתליאליים מונחת על גבי הפלאגים.לאחר מכן מעבירים את הרפידות לרשתות הציפה ושומרים אותן בממשק אוויר-נוזל למשך 10 עד 14 ימים. בשלב הסופי, קוצרים את הרפידות. לבסוף, ניתן להעריך שינויים בדיפרנציאציה אפיתליאלית באמצעות אנליזה היסטולוגית או אימונוהיסטוכימית. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי דיפרנציאציה אפיתליאלית.ניתן ליישם זאת גם על מערכות אחרות, כגון וירוסים המדביקים את האפיתל העורי או הרירי כחלק ממחזור חייהם. את הפרוצדורה תדגים Dan Anneker, סטודנטית לתואר מתקדם במעבדה שלי. ראשית, שפכו חומצה כרומית-גופרתית לתוך כלי זכוכית (beaker) והטבילו את רשתות ה-metal raft בחומצה למשך שעה אחת.לאחר מכן, שטפו את הסריגים באופן רציף במים מהברז למשך הלילה. לאחר השטיפה הממושכת, שטפו את הסריגים למשך שלוש עד חמש שעות נוספות במים מזוקקים פעמיים, והניחו לסריגי הרפטי (raft grids) להתייבש. לאחר מכן, כופפו שלושה צדדים של הרפטי, כ-0.5 סנטימטרים במרחקים שווים זה מזה, ועקרו את סריגי הרפטי באוטוקלב.לאחר הכנת ג'ל הקולגן, יש להשתמש ב-trypsin עבור שני הפיברובלסטים, ולאחר מכן לנטרל את ה-trypsin בעזרת מצע גידול. העבירו את הפיברובלסטים למבחנה קונית של 50 מיליליטר, וספרו את התאים כדי לקבוע את מספר ה-rafts שניתן להכין. לאחר סבב של התאים למשך ארבע דקות ב-244 ×g בטמפרטורת החדר, שאבו את מצע הגידול ממשקע הפיברובלסטים ותלו את התאים בכמות מתאימה של בופר שחזור DMEM וקולגן עבור מספר ה-rafts שחושב.הוסיפו את הקולגן בסוף כדי למנוע מהג'ל להתמצק מהר מדי. לאחר הוספת הקולגן, ערבבו את התמיסה במהירות אך בעדינות כדי למנוע היווצרות בועות בתוך הג'ל. אם תערובת הג'ל צהובה מדי, הוסיפו מספר טיפות של סטריליזציה בסינון.הוסיפו אחת מנת נתרן הידרוקסיד רגילה. ערבבו בעדינות עד שהג'ל הופך לצבע כתום-אדמדם המעיד על pH נכון. כעת, העבירו באמצעות פיפטה שלושה מיליליטרים של תערובת הקולגן והפיברובלסטים באיטיות לדופן של כל באר בצלחון תרבית בעל שש בארות, תוך הימנעות מיצירת בועות, ולאחר מכן הד기로 את הצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לג'ל להתמצק.כאשר הג'ל מוצק, הוסיפו שלושה מיליליטרים של מצע E עם EGF לחלק העליון של ג'ל הקולגן שהתמצק, והחזירו את הצלחת לאנקובטור. לאחר גידול קרטינוציטים במעבר נמוך עד לצפיפות של כ-70%, בצעו טריפסין לקרטינוציטים, ולאחר מכן נטרלו את הטריפסין באמצעות E medium עם EGF. ספרו את התאים כדי לקבוע את מספר הרפסים שניתן להכין.לאחר סבב צנטריפוגה להורדת התאים, השעו את המשקע במיליליטר אחד של eed עם EGF עבור כל תרבית רהפט שחושבה. כעת, הסירו את המדיום מגלי הקולגן על ידי הבעת פלטת שש הבארים על צדה, ולאחר מכן הוסיפו שני מיליליטרים של eed טרי עם EGF לכל ג'ל. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות מיליליטר אחד של קרטינוציטים משוערים לשני המיליליטרים של eed שכבר נמצאים בכל אחת מהבארות.העבירו בעדינות בעזרת פיפט את הקרטינוציטים יחד עם שני מיליליטרים של מצע גידול, וטפטפו אותם על פג' collagen. הניחו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך יומיים עד ארבעה ימים כדי לאפשר לתאים להגיע לקונפלואנס. התאים מוכנים כאשר המצע משנה את צבעו לצהוב יום אחד לאחר החלפת המצע; עד ליום הרביעי, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להניח רשת מתכת סטרילית כאשר הצדדים הכפופים פונים כלפי מטה בתוך צלחת של 10 centimeter.שאבו את המצע מג'ל קולגן אחד, ולאחר מכן העבירו שפכטל סטרילי סביב היקף הג'ל בתנועה למעלה ולמטה כדי לשחרר את הג'ל מדפנות הבאר. העברת פלאג הקולגן מלוח שש הבארים אל הרשת היא החלק המאתגר ביותר בפרוצדורה זו. הקפידו להחליק בעדינות את השפכטל מתחת לפלאג מבלי לקרוע אותו, והניחו אותו בצורה שטוחה על הרשת מבלי ליצור בועות אוויר בין הפלאג לרשת.לאחר מכן, ניתן להשתמש בשפכטל כדי להחליק חלקים שקיפלו פנימה במהלך הליך זה. כדי להוציא את הג'ל, הגביהו מעט את הפלטה, החליקו את השפכטל תחת הג'ל והרימו אותו. הניחו את ג'ל הקולגן על רשת המתכת באופן שלא ייווצרו בועות בין הרשת לג'ל.כדי ליצור ממשק אוויר-נוזל, הוסיפו באיטיות EED ללא EGF לתחתית הכלי, כך שרשת הרפטים (rafts) תיגע במצע, אך ג'ל הקולגן לא יגע בו. לבסוף, דגרו את הרפטים בטמפרטורה של 37 °C. תוך שמירה על ממשק האוויר-נוזל, קצרו את הרפטים לאחר 14 ימים. כפי שניתן לראות בדמות זו, רפטים שיוצרו מקראטינוציטים אנושיים ראשוניים המונצחים על ידי HPV 31 או H fk, 30 ones הם עבים באופן ניכר בהשוואה לרפטים שיוצרו מקראטינוציטים רגילים מעור אנושי או hks.לפיכך, לחלבוני HPV יש את היכולת להשאיר תאים המבצעים דיפרנציאציה פעילים במחזור התא. כאן, בוצע ניתוח אימונוהיסטוכימי על חתכים של תרביות raft אורגנוטיפיות שנוצרו מ-HK 30 וכן מ-HKS רגילים, תוך שימוש בנוגדן נגד cytokeratin 10 או K 10 בצבע ירוק. K 10 לא בוטה בשכבה הבזאלית המסומנת כאן על ידי החיצים, ובמקום זאת נמצא רק בשכבות הסופרה-בזאליות, המורכבות מתאים העוברים דיפרנציאציה פרוגרסיבית.באיור זה, מוצג הביטוי של חלבון ה-HPV, ‏E1, ‏E4, חלבון מאוחר המוגבל לשכבות העליונות של האפיתל והמוצג כאן בירוק, כפי שצפוי. לא נצבעה כלום בתרביות raft מתאי hks נורמליים, בדומה לאיור הקודם.החצים מצביעים שוב על השכבה הבזאלית של האפיתל לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן ללמוד את הפתוגנזה של וירוסי הפפילומה האנושיים באמצעות מערכת המדמה דיפרנציאציה אפיתליאלית in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו מכינים תרביות רפט (raft cultures) אורגנוטיפיות מקראטינוציטים ראשוניים או מקווי תאים אפיתליאליים מבוססים.

generation-organotypic-raft-cultures-from-primary-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול המפורט ליצירת שחזורי עור אורגנוטיפיים תלת-ממדיים במבחנה לחקר התקדמות המלנומה. מודל עור זה מחקה הן את הארכיטקטורה והן את המורכבות הרב-תאית של איברים in vivo.

יצירת שחזורי עור מלא אורגנוטיפיים: הליך לביסוס מודל עור תלת ממדי באמצעות דגימות עור אנושיות

סרטון זה מתאר את בידודם של קרטינוציטים – התאים הבולטים ביותר בשכבת האפידרמיס של העור האנושי, על ידי שימוש בשילוב של עיכול אנזימטי ושיטות שיבוש מכני. שיטה זו מסייעת בצמיחה מועדפת של קרטינוציטים על פני סוגי תאי עור אחרים באמצעות מדיום גידול סלקטיבי.

בידוד קרטינוציטים בעור האדם: שיטה לתרבית קרטינוציטים ראשוניים מדגימות עור

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור רטרו-וירוס רקומביננטי רקומביננטי של קרטינוציטים אנושיים מהונדסים גנטית. שיטה זו יכולה לשמש כדי לתפעל ביטוי גנים בקרטינוציטים.

שינוי גנטי של קרטינוציטים אנושיים ראשוניים: שיטה למניפולציה גנטית של קרטינוציטים באמצעות רטרו-וירוסים רקומביננטיים

פרוטוקול וידאו זה מתאר טכניקה מבוססת קלטות בתרבית חוץ גופית ליצירת עור אורגנוטיפי אנושי באמצעות קרטינוציטים אפידרמיס ודרמיס אנושי סוטה. הם מחקים את התפקוד והפיזיולוגיה של עמיתיהם ברקמת in vivo.

תרבות עור תלת-ממדית אורגנוטיפית: טכניקה מבוססת קלטות בתרבית חוץ גופית לחידוש האפידרמיס האנושי על דרמיס אצלולרי

מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מקיף ומפורט כיצד ליצור עור אורגנוטיפי אנושי מהונדס גנטית מקרטינוציטים אפידרמליים ודרמיס אנושי נטול חיוניות.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

העור האנושי פועל כשורה הראשונה של הגנה מפני הסביבה החיצונית. אנו מציגים שיטה לבודד את ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. Keratinocytes מבודדים אלה שימושיים רבים setups ניסיוני, הם מודל המתאים מאוד ללמוד המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית במבחנה.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת 3D organotypic מלנומה ספרואיד העור מודל recapitulates הן את הארכיטקטורה ואת multicellular המורכבות של איברים/גידול של ויוו , אבל באותו זמן מסתגלת שיטתית ניסיוני התערבות.

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

אנו מציעים פרוטוקול זה מראה כיצד להבדיל keratinocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה ו fibroblasts וליצור תא צורב של העור תלת-ממד באמצעות אלה keratinocytes ו fibroblasts. פרוטוקול זה מכיל צעד נוסף של יצירת מודל humanized עכברים. הטכניקה המובאת כאן תשפר את המחקר דרמטולוגית.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיפוח שיטתי של כדורי אפידרמיס בתרבות השעיה תלת-ממדית. פרוטוקול זה כולל יישומים נרחבים לשימוש במגוון סוגי רקמות אפיתל ולדוגמנות של מספר מחלות ותנאים אנושיים.

הקמת מערכת תרבית אפידרמיס כדורית בעלת תפוקה גבוהה למודל פלסטיות תאי גזע קרטינוציטים

פרוטוקול זה מתאר את התרבית של קרטינוציטים טריים שהושגו (מעבר 0) לשימוש בהדמיית תאים חיים.

יצירת תרביות ראשוניות להדמיית תאים חיים של קרטינוציטים

למד לייצר תרביות רפסודות אורגנוטיפיות מקרטינוציטים אנושיים ראשוניים או מקווי תאים אפיתליים מבוססים. שיטה זו מאפשרת הערכת הבדלות אפיתלית וחקר אינטראקציות נגיף:מארח בתנאים הדומים לסביבה ביולוגית.

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

גלה סרטונים נוספים