חקירת דלקת מעיים במודל DSS-Induced של IBD

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את התגובה החיסונית במעי הנגרמת על ידי נתרן דקסטרון סולפט על ידי קביעת כמויות פעילות המיאלו פרוקסידאז וציטוקינים פרו-דלקתיים המיוצרים בתגובה לדלקת. ראשית, קוליטיס DSS נגרמת בעכברים באמצעות החדרת תמיסת DSS SALT למי השתייה. לאחר מכן, חומרת המחלה של הקוליטיס מוערכת על ידי ניקוד מקרוסקופי ומסירים את המעי הגס להמשך ניתוח.

לאחר מכן מחלקים את המעי הגס המנותח לשלושה חלקים לצורך היסטולוגיה, כימות ציטוקינים ופעילות עמותה. לבסוף, רקמת המעי הגס הומוגנית והסופרנטנט משמש לקביעת פעילות MPO. בסופו של דבר, ניתן לקבוע שינויים בפעילות ה-MPO באמצעות נתוני הספיגה שנאספו באמצעות ספקטרופוטומטר.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מידע כרוני של מודלים שונים של מחלות מעי דלקתיות, כגון DSS וקוליטיס הנגרמת על ידי TNBS. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו באיברים אחרים כמו הריאה והכבד לפני תחילת ההליך. החלף את מי השתייה בכל כלוב עכבר בתמיסת DSS כדי לגרום לדלקת.

תן לעכברי הדברה, חיטוי מי שתייה ללא DSS. לאחר מכן, ביום הניסוי, נתחו את המעי הגס כפי שהודגם בעבר במאמר JoVE מאת ווית'ם וויליאמס וויליאמס. סוחטים בזהירות את הצואה מכל המעי הגס בעזרת פינצטה כפופה, אוספים אותה לנייר שקילה על ידי שטיפת הטישו ב- PBS סטרילי.

העריכו את הצואה על ידי שימוש בזוג מלקחיים כדי ללחוץ כלפי מטה על הצואה כדי לקבוע את עקביותה כדי לקבוע ציון לדם בצואה. שימו לב לצבע הצואה ותקפו עוד יותר את ההערכה באמצעות בדיקת המוקולט, הכוללת מריחת צואה על נייר המוקולטי, הוספת מפתח, ולאחר מכן רישום הצבע הכחול מציין בדיקת צואה חיובית לדם. לאחר מכן השתמש בטבלה זו כדי לקבוע ערך עבור כל אחד מהתנאים.

לאחר מכן, תוך שמירה על הכיוון הפרוקסימלי עד הדיסטלי של המעי הגס, חתכו את המעי הגס לשלושה חלקים שווים. לאחר מכן קחו שברי דגימה מהחלקים הפרוקסימליים והאמצע של המעי הגס של המעי הגס, והניחו את הדגימות בצינורות eph בודדים של 1.5 מיליליטר. כדי להעריך את הנזק ההיסטולוגי של חומרת הקוליטיס, השתמש בקטע הרקמה הדיסטלי ביותר של המעי הגס וחתוך שבר קטן באורך של חצי עד סנטימטר אחד.

הנח את השבר בקלטת רקמות וטבל את הקסטה בתמיסת פורמלין 10% חוצצת. לאחר מכן לאחר הכנת חתכים משובצים בפרפין של שברי הרקמה, צבעו את החלקים בהמטין אואין לניקוד על ידי צופה עיוור. לבסוף, הקפיאו את הדגימות מהחלקים הפרוקסימליים והאמצעיים בחנקן נוזלי ואחסנו אותן עד לשימוש במינוס 70 מעלות צלזיוס.

לאחר הסרת דגימות המעי הגס מאחסון של מינוס 70 מעלות צלזיוס, הניחו אותן על קרח. לאחר מכן השתמשו במלקחיים כפופים כדי להסיר צואה או שומן גלויים, והניחו אותם בצינורות בודדים של שני מיליליטר המתאימים לשימוש בהומוגנייזר. לאחר מכן קבע ורשום את המשקל של כל דגימה.

לאחר מכן, הוסף חרוזי הומוגנייזר לכל צינור דגימה, ולאחר מכן הוסף את הכמות המתאימה של מאגר לשונית H לצינור בהתאם למשקל הרקמה כפי שנקבע זה עתה, נתק את השברים עם הומוגנייזר רקמות למשך ארבע דקות ב-30 הרץ. לבסוף, צנטריפוגה את תמיסת התא למשך שש דקות בטמפרטורה של 13, 400 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה, ואז מקפידים לשמור על חרוז ההומוגניזציה להשליך את הכדור שהתקבל.

לאחר מכן ניתן לאחסן את הסופרנטנט במינוס 70 עד לשימוש. התחל שלב זה על ידי הוספת שבעה מיקרוליטרים של הרקמה שהוכנה בעבר הומוגנאט בשלוש עותקים לצלחת של 96 בארות. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר מי חמצן מדולל ליוד OD Dion טרי שהוכן לאחרונה.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית מוסיפים 200 מיקרוליטר מתערובת מי החמצן לכל אחת מהבארות. כעת, מדוד את הספיגה של 550 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר, תוך ביצוע שלוש קריאות במרווחים של 32. לאחר מכן באמצעות נתוני הספיגה, משקל הרקמה ונפח החיץ, חשב את פעילות ה-NPO בהומוגנטים כפי שמודגם בחישוב מדגם זה.

במהלך הטיפול ב-DSS, ניתן להשתמש במדד פעילות המחלה כדי להעריך ולהעריך את ההתקדמות הקלינית של המחלה. בעלי חיים שטופלו ב-DSS מראים ירידה משמעותית במשקל בהשוואה למשקל ההתחלתי, צואה רכה ודימום צואה. ככל שמערכות מקרוסקופיות משמעותיות יותר, כך מדד פעילות המחלה גבוה יותר.

לאחר הקרבה ובדיקה של המעי הגס של עכברים שקיבלו 5% DSS במי שתייה במשך חמישה ימים, חומרת הקוליטיס המבוססת על ניקוד מקרוסקופי של קיצור אורך המעי הגס, דימום במעי הגס, דימום צואה, התרופפות סמיכות הצואה וסימני דימום רקטלי עבור ניסוי מייצג זה נקבעה כגרועה פי חמישה מאשר בבקרות שטופלו במים בלבד, כפי שהודגם על ידי חתכי נתונים אלה של DSS שטופלו לדגימות רקמת המעי הגס, זהה ל-H ו-E, יש ציונים היסטולוגיים גבוהים יותר מאשר בקרות שטופלו במים. כאן, ניתן להבחין בארכיטקטורה הרגילה ובהיעדר חדירה תאית באזור המצוין על ידי הכוכבית בחתך מוכתם h ו-e זה שנאסף מחיית ביקורת שקיבלה מים בלבד. כעת השווה את צביעת h ו-e של דגימה מבעל חיים שטופל ב-DSS לאיור הקודם.

המעי הגס מבעל חיים זה מציג יותר נזק היסטולוגי כפי שמעיד יותר חדירה תאית כפי שמצוין על ידי סימן הפאונד ועל ידי יותר דלדול תאי גביע ועיוות גדול יותר. נזק לארכיטקטורת קריפטה K כפי שמצוין בכוכבית. כדי לאפיין עוד יותר את מידת חומרת המחלה בעכברים שטופלו ב-DSS, ניתן להעריך סמן חלופי לדלקת מדגימות רקמת מעי גס הומוגניות.

כצפוי, למעי הגס שטופלו ב-DSS יש פעילות NPO גבוהה יותר מאשר לביקורת. בנוסף, חומרת הקוליטיס הנגרמת על ידי DSS קשורה לרמות מוגברות של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון IL אחד, בטא IL 6 ו-TNF אלפא. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שפעילות MPO יכולה לרדת עם הזמן.

לכן, בדיקת MPO צריכה להיות אחת הבדיקות הראשונות המבוצעות בעת קביעת חומרת דלקת המעיים.