Name: דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: למדו שיטת תרבית אקספלנטים דופמינרגיים וסטריאטליים בעכברים בתלת ממד במטריצת קולגן. טכניקה זו מאפשרת חקר התפתחות מסלולי עצבים מזוסטריאטליים וסטריאטוניגרליים וניתוח תגובות אקסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Assay מטריצת הקולגן פותחה לשפר על ידי עבודה של הרבה קבוצות מחקר שונות במהלך השנתיים עד שלוש השנים האחרונות. הגישות המתוארות כאן explants דופאמין ו striatal תועלת רבה ממחקרים אלה. בנוסף, החוקרים מודים Asheeta פראסאד על עזרתה בהקמת תרבויות explant striatal. לעבוד במעבדה מומן על ידי ארגון Human תוכנית המדע הגבול (פיתוח פרס קריירה), ארגון הולנד למחקר בריאות ופיתוח (ZonMW-VIDI ZonMW ו-TOP), האיחוד Europanian (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , גרנט 222999) (כדי RJP), לבין ארגון הולנד למחקר מדעי (TopTalent, כדי Eres).

1. הכנת קולגן זנב עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 6-10 זנבות עכברים בוגרים (ניתן לאחסן את זנבות ב -20 ° C עד השימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את זנבות באתנול 95% בין לילה בטמפרטורת החדר (RT). </li></ol> דיסקציה של זנבות עכברים (בשכונה בתרבית רקמה): (לשמור על כלי באתנול 70%, כאשר לא משתמשים בהם ולוודא כי כל הפתרונות, הכלים וכלי הזכוכית בשימוש בכל הליך זה הם סטריליים) <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף גידים מ זנבות, לנתק את קצה הזנב. החזק בסופו של זנב גדול עם זוג מלקחיים. השתמש עוד זוג מלקחיים להחזיק, לכופף ולשבור את הזנב קרוב מלקחיים אחרים. לפרק ואת הגידים יישאר מאחור (איור 1 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הגידים סטרילית H 2 O, ולאחר איסוף כל הגידים להעביר אותם petridish חדש עם סטרילית H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2-3 גידים ו לגרוס אותם באמצעות 2 זוגות שלceps ב petridish חדש עם סטרילית H 2 O. הסר שאינם רקמת גיד כגון ורידים (רקמת גיד מבריק ומהורהר, 1C איור). לאחר הסרה של רקמת גיד לא הכל, זנב אחד מניב כ 100-150 מ&quot;ג של גידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הגידים עד 300 מ&quot;ל של חומצה אצטית סטרילית 3% ומערבבים לאט לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מ&quot;ל נוסף 200 של חומצה אצטית סטרילית 3% ומערבבים לאט לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה פתרון חומצה אצטית המכיל את הגידים XG ב 2700 ~ 120 דקות ב 4 ° C עד גלולה לא מומס הגידים שאינם גיד רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה להכין צינורות דיאליזה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חתיכות של 40 ס&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרתיח ב 500 מיקרומטר EDTA 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריר סטרילי H 2 O </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור קשר בקצה אחד של צינור דיאליזה ולמלא את צינורות עם supernatant הפתרון גיד centrifuged על הקרח מכסה המנוע תרבות רקמות באמצעות pipett אוטומטיתE ו פיפטה 25 מ&quot;ל. הימנע לייצר בועות. קשר את הקצה השני של צינורות צינורות החנות על רדיד אלומיניום סטרילי על הקרח עד חתיכות של כל צינורות מלאים (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 ליטר של סטרילית 0.1x ספורט, pH 4.0, בשכונה בתרבית רקמה. הוסף מצוף לחתיכות של צינורות ולהוסיף אותם לפתרון מראש מקורר MEM 0.1x בכוס 10 ליטר. Dialyze לילה ב 4 ° C תוך לאט תוך ערבוב. דיאליזה זה מסיר עודפי חומצה, תוך שמירה על pH נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף חדשה מראש מקורר 10 אני 0.1x MEM ומערבבים לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב הקודם על ידי החלפת מראש עם חדש מקורר 10 אני 0.1x MEM ומערבבים במשך הלילה על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולגן aliquot פתרון תוך 50 צינורות סטריליים מ&quot;ל. החנות aliquots ב 4 ° C. שמור על 6-12 חודשים, רק להתמודד עם המניות קולגן בשכונה בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לבדוק אם קולגן מטוהרים צריך להיות מדולל (ב 0.1x MEM) כדי להשיג תוצאות אופטימליות ב matr קולגןט assay. לכן, לייצר סדרה דילול הקולגן (הקולגן חי, 01:01, 01:02 ו 01:05 בדילול מלא) ולבצע מטריקס מבחני קולגן כמתואר להלן, כדי לקבוע את דילול קולגן אופטימלית. </li></ol> 2. דיסקציה של המוח התיכון דופאמין 7,8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח E14.5 עוברי עכברים מן הרחם של האם לשמור על המדיום L15 על הקרח עד הצורך. </li></ol> כל השלבים הנתיחה שלאחר מכן מבוצעות בתווך L15 על הקרח. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את telencephalon על ידי חיתוך לאורך החלק המדיאלי של שלפוחית ​​כל telencephalic (שימוש שלפוחית ​​telencephalic עבור explants striatal). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נדן meningeal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך dorsoventral מקורי רק של כפף mesencephalic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות עוד קיצוץ הזנב dorsoventral רק כפף mesencephalic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך לאורך קו האמצע rostrocaudal הגב באמצעות microdissectioסכין n לחשוף את הרקמה הבסיסית המוח התיכון הגחון. להיזהר לא לפגוע ברקמת המוח התיכון הגחון מכיוון שהיא מכילה נוירונים דופאמין (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשני חתכים rostrocaudal לרוחב ובמקביל קו האמצע הגחון כדי להסיר רקמות המוח התיכון הגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את רקמת המוח התיכון הנותרים הגחוני אל explants באמצעות סכין microdissection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את explants במדיום L15 FBS המכיל 5% על הקרח עד לשימוש. </li></ol> 3. דיסקציה של הסטריאטום צעדים כל דיסקציה מבוצעות בתווך L15 על הקרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שלפוחית ​​telencephalic גזור במהלך דיסקציה המוח התיכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התלמוס על ידי חיתוך בין התלמוס ואת הסטריאטום באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך mediolateral מקורי כדי הסטריאטום להסיר מבנים מקורי כגון נורת חוש הריח. חזור על פעולה זו על רקמת ממוקם caudally אל הסטריאטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדהפרוסת הנותרים לקבל תצוגה העטרה של הסטריאטום (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסטריאטום יכול להיות מוכר כחלק מעט פחות צפוף (שקוף יותר) של רקמה. לנתח את הסטריאטום לחתוך לתוך explants באמצעות סכין microdissection. הימנע קרוב רקמות מעט כהה יותר כדי קו האמצע, אשר מכיל נוירונים נודדים של רוממות ganglionic לרוחב ו המדיאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את explants במדיום L15 FBS המכיל 5% על הקרח עד לשימוש. </li></ol> 4. הרכבה קולגן מטריקס מבחני הכנת קולגן (בכל הצעדים על הקרח, להשתמש מקורר טיפים פיפטה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 860 μl של קולגן בדילול מלא עם 100 μl של MEM 10x ו 40 μl של סודה לשתייה 1 יג (NaHCO 3) ולשמור על הקרח. אם בשלב זה הקולגן מתחמם זה יהיה לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה של μl 20 (כ 5 מ&quot;מ קוטר) של קולגן מוכנים coverslip היטב מנה 4-גם Nuncולתת לו לעמוד CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות (הסביבה O 2 בריכוז מספיק). במהלך הדגירה זה קולגן יהיה gelatinize. </li></ol> הגדרת שיתוף תרבות קולגן ג&#39;ל <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קולגן יש gelatinized, השתמש פיפטה עם טיפ 200 μl להעביר explant דופאמין או striatal קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את explants בסמיכות זה לזה באמצעות מחט. להפריד ביניהם במרחק של קוטר של כ explant 1 (~~~HEAD=NNS 200-300 מיקרומטר) (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני עודף ולהוסיף 20 μl של קולגן מוכן על גבי explants את. זה יהיה לעיתים קרובות לגרום explants כדי לנוע. למקם מחדש את explants באמצעות מחט כמתואר 4.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הקולגן לחזק במשך 15 דקות ב RT ואחריו 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קולגן קבע, הוסף 400 μl של הבינוני xplant ולגדול במשך 2-3 ימים CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 5. ניתוח על פי אימונוהיסטוכימיה וכימות אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן explants, בעדינות להוסיף 400 μl של paraformaldehyde 8% (PFA) ב PBS עד 400 μl של המדיום (ובכך לדלל PFA ל -4%) ולתת לעמוד במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דקות 3x 15 ב PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחסימת המאגר (BB; PBS + 1% FBS + 0.1% טריטון X-100) במשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בין לילה עם הנוגדן העיקרי BB ב 4 ° C. על האקסונים דופאמין להשתמש נגד טירוזין נוגדנים hydroxylase (1:1000) 7, אקסונים striatal נגד DARPP32 נוגדנים (1:500) 9 ו המאפשר הדמיה את כל האקסונים נגד βIII טובולין (1:3000) 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שעה 5x 1 ב PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני מצומדות כדי fluorophore המתאים (1:500) ב BB לילה בשעה 4° C. משלב זה ואילך לצמצם את החשיפה של explants את האור (למשל לכסות אותן בנייר כסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לילה PBS ב 4 ° C ואחריו שוטף כמה במהלך היום הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר explants על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות להאריך מגיב Antifade הרכבה בינונית. הוסף ירידה של 10 μl ~ בשקופית מיקרוסקופ זכוכית. קח coverslip בעדינות ומניחים אותו על ירידה של המדיום גובר כאשר הצד explant כלפי מטה. למנוע השמנה כל האוויר מתחת דה coverslip ידי בעדינות הורדת אותו על ירידה של המדיום גובר. </li></ol> כימות על ידי חישוב P / D יחס <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות דיגיטליות של explants באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתמונות אלה, לחלק אחד explant לתוך הרביעים לייצר ברבע פרוקסימלי (כלומר החלק של explant הקרוב explant צמוד) וגם ברבע דיסטלי (חלק explant הרחוק ביותר מן expla הסמוךNT) (איור 2, 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את אורך של 20 neurites הארוכים ביותר העולה מתוך explant הן את הרביעים הפרוקסימלית ומ דיסטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באורך ממוצע של 20 neurites הארוכים ביותר כדי לחשב את יחס P / D עבור explant בנפרד. AP / D יחס&gt; 1 מציין משיכה האקסון, בעוד יחס &lt;1 מצביע על דחייה האקסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים מסוימים, צמיחה צפופה של neurites מונע הערכת אורך neurite הפרט. במצבים אלה, כימות יכול להתבצע על ידי מדידת המרחק בין קצה explant והחזית המוביל של הצמיחה האקסון של הרביעים הפרוקסימלית ומ דיסטלי. </li></ol> 6. נציג תמונות אחרי התרבות המוצלח של explants דופאמין ו striatal מספר רב של אקסונים גלויים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או דמיינו כפי immunocytochemistry נגד βIII טובולין (לא מוצג). תת קבוצה של אקסונים אלה יהיו דופאמין או של<html> אקסונים triatal כמו immunocytochemistry באמצעות דמיינו (איור 3). על ידי חלוקת explants לתוך הרביעים כמתואר וקביעת P / D יחס, התוצאה האקסון המשוערת מושכת או דוחה ניתן לכמת (איור 3E). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> באיור 1. תמונות הממחישות את ההכנה של הקולגן בגידים זנב חולדה. א) משיכת חוץ זנב עכברוש חושף את הגידים. ב) הגידים הם נראים כמו חבל, כמו צרורות. ג) הגידים קל להבחין בין עורקים על ידי המראה הלבן הבוהק שלהם. ד) לאחר המסת הגידים חומצה אצטית, הפתרון הוא להעביר את צינורות דיאליזה. כדי לשמור על קור קולגן מומס, צינורות ממוקמות על רדיד אלומיניום סטרילי על הקרח. ה 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. סכמטי המציין את השלבים השונים של ההליך. אזורי המוח המתאימים גזור ופצע ליצור explants. המוח התיכון יחיד explant striatal ממוקמים בסמיכות במטריצה ​​קולגן והשאיר לגדול במשך 48-72 שעות על 37 ° C. האקסונים הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה הקרינה ואת היחס P / D מחושב לכמת התגובות chemotropic. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> איור 3. תוצאות נציג מראה צמיחה האקסון בתרבות מטריקס קולגן. א) explant המוח התיכון מוכתם נגד tyrosine hydroxylase נוגדנים תוצאה חושפים האקסון. הקו המקווקו מציין explant הסמוך. ב) הגדלה של מספר neurites בודדים המראים קונוסים צמיחה (חיצים). ג) explant Striatal מוכתם נגד DARPP32. D) הגדלה של C מראה neurites בודדים. ה) דוגמהע / D יחס כימות. Explants מחולקים הרביעים שווים. ברבע הפרוקסימלי עומדת בפני explant הסמוך ואילו ברבע דיסטלי פונה ממנו. ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר.

<ol><li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+connected+in+the+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li>
<li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li>
<li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation%2C+channeling%2C+rostral+growth%2C+and+intracortical+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li>
<li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li>
<li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li>
<li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

Assay מטריקס קולגן המתואר כאן נעשה שימוש ושיפרה ידי מעבדות רבות בעשורים האחרונים לחקור מגוון רחב של מולקולות האקסון הדרכה ומערכות עצביות (למשל לראות הפניות 5-8). מחקרים אלה הראו כי assay זה הוא כלי רב עוצמה לחקר תופעות ורגולציה של מולקולות האקסון הדרכה המופרשים על ידי (ביניים) ברקמות שונות היעד. עם זאת, יש לציין כי מטריקס קולגן הוא תחליף בסביבה תאית (ECM), אבל ברור שחסר חלבונים רבים מציגים בדרך כלל ECM. מרכיבי EC...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> עגל עוברית סרום </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> גלוטמין (200 מ&quot;מ) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> מרק </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Media חיוניים מזערי (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> ליבוביץ של L-15 בינוני </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך מגיב Antifade זהב </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> דיאליזה צינורות </td><td> ספקטרום Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylase הארנב נגד טירוזין </td><td> פל, FreeZ </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד Darpp32 (H-62) </td><td> סנטה קרוז, </td><td> SC-11365 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר נגד βIII טובולין </td><td> סיגמא </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד שכותרתו נוגדנים משניים </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו explants striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

הדופמין במוח התיכון (mdDA) נוירונים הפרויקט באמצעות צרור המוח הקדמי המדיאלי כלפי כמה אזורים telencephalon, כולל 1 הסטריאטום. הדדי, הנוירונים קוצניים בינוני בסטריאטום שיוצרים מסלול (ישיר) striatonigral innervate nigra substantia 2. פיתוח של שטחים אלה האקסון תלויה בפעולות קומבינטורית של שפע של צמיחה האקסון ואת רמזים הדרכה כולל מולקולות שפורסמו על ידי neurites או (ביניים) אזורים היעד 3,4. גורמים אלה מסיסים ניתן ללמוד במבחנה על ידי mdDA culturing ו / או explants striatal במטריצה ​​קולגן אשר מספק מצע תלת מימדי על אקסונים מחקה את הסביבה תאיים. בנוסף, מטריקס מאפשרת קולגן ליצירת שיפועים יציבה יחסית של חלבונים שפורסמו על ידי explants או תאים אחרים המוצבים בסביבה (למשל, לראות את הפניות 5 ו -6). כאן אנו מתארים את שיטות פורification של קולגן עכברוש הזנב, microdissection explants של דופאמין ו striatal, התרבות שלהם ג&#39;ל קולגן וניתוח immunohistochemical וכמותית שלאחר מכן. ראשית, במוחם של עוברי עכברים E14.5 הם מבודד דופאמין ו explants striatal הם microdissected. Explants אלה מכן (CO) בתרבית ג&#39;ל קולגן על coverslips במשך 48 עד 72 שעות במבחנה. כתוצאה מכך, תחזיות axonal הם דמיינו באמצעות סמנים עצביים (tyrosine hydroxylase למשל, DARPP32 או טובולין βIII) וצמיחה האקסון ותגובות האקסון אטרקטיביים או דוחה הם הניתנים לכימות. זו הכנה עצבי הוא כלי שימושי עבור במבחנה של המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון mesostriatal ו striatonigral והדרכה במהלך הפיתוח. שימוש assay זה, אפשר גם להעריך אחרים (ביניים) מטרות אקסונים דופאמין ו striatal או לבדוק אותות מולקולריים מסוימים.

Explants ממערכת המוח התיכון דופאמין הסטריאטום משמשים assay קולגן מטריקס עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; ניתוח של פיתוח מסלול mesostriatal ו striatonigral. ב assay זו תוצאה הדרכה axonal והוא יכול לטפל לכמת. זה גם יכול להיות שונה להערכת באזורים אחרים או סימנים מולקולריים.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

נוירונים דופמינרגיים של המוח האמצעי (mdDA) שולחים שלוחות דרך הצורר המדיאלי של המוח הקדמי (medial forebrain bundle) לעבר מספר אזורים בטלנצפאלון, כולל הסטריאטום1. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לתרבת דופמינרגיים וסטריאטום AAL Explan כדי לחקור את התפתחות מסלולי Meso Sal ו-Sal Nigro. מטרה זו מושגת תחילה על ידי מיקרו-דיסקציה של הסטריאטום והמידבריין הדופמינרגי מעוברים של עכבר בשלב E 14.5. השלב השני הוא חיתוך של explan בגודל מתאים מהרקמה שבוצעה לה דיסקציה.בשלב הבא, מניחים את ה-explan בתוך ג'ל קולגן בקרבה רבה זה לזה. השלב האחרון הוא תרבית של explan אלו לאורך תקופה של יומיים עד שלושה ימים כדי לאפשר צמיחת אקסונים. לבסוף, נעזרים באימונוהיסטוכימיה לסמנים נוירונליים ספציפיים כדי להראות ולכמת תגובות אקסוניות של משיכה או דחייה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרביות של תאים מופרדים או שני שתלי DX, הוא שמטריצת הקולגן מספקת תשתית תלת-ממדית לאקסונים המדמה את הסביבה החוץ-תאית. בנוסף, מטריצת הקולגן מאפשרת יצירה של מדרגי ריכוזים יציבים יחסית של חלבונים המופרשים על ידי שתלי X או תאים הממוקמים בסביבתם. את הפרוצדורה ידגימו Ava Smith ו-Francesca, שתיים מסטודנטיות הדוקטורט במעבדתי.כדי להתחיל בפרוצדורה זו, יש להוציא את עוברי העכבר בשלב E 14.5 מרחמה של האם. יש לשמור אותם במדיום L 15 על קרח עד למועד השימוש. לאחר מכן, העבירו עובר אל המיקרוסקופ ובודדו את המוח מהעובר.לאחר מכן, הסירו את ה-cephalon על ידי חיתוך לאורך החלק המדיאלי של כל שלפוחית ראשית (cephalic vesicle). לאחר מכן, הסירו את המעטפת הקרומית (meningeal sheath). בצעו חיתוך גבי-בטני (dorso ventral) ממש בצד הרוסטרלי של ה-meas cephalic flex.לאחר מכן, בצעו חיתוך גבי-בטני (dorsal ventral) נוסף ממש לפני הכיפוף הצווארי (cephalic flexor). לאחר מכן, בצעו חיתוך רוחבי (rostral caudal) לאורך קו האמצע הגבי באמצעות סכין למיקרו-דיסקציה כדי לחשוף את רקמת הגב המוחית הבטנית שמתחתיה. היזהרו לא לפגוע ברקמת הגב המוחית הבטנית, שכן היא מכילה את הנוירונים הדופמינרגיים.לאחר מכן, בצעו שני חיתוכים רוחביים (coddle cuts) לטראליים ומקבילים לקו האמצע הוונטרלי כדי להסיר את רקמת המוח האמצעי הדורסלית. לאחר מכן, חלקו את רקמת המוח האמצעי הוונטרלית שנותרה ל-X רססי רקמה (explants) באמצעות סכין למיקרודיסקציה. שמרו את X רססי הרקמה במצע L 15 המכיל 5%FBS על קרח עד לשימוש.כעת העבירו את השקיקים הצפליים של הטלון (talon cephalic vesicles) שהתקבלו קודם לכן במהלך נתיחת המוח האמצעי אל המיקרוסקופ. הסירו את התלמוס על ידי חיתוך בין התלמוס לבין ה-satu באמצעות פינצטה. לאחר מכן, בצעו חיתוך מדיאלי-לטראלי רוסטרלית לסטריאטום כדי להסיר מבנים רוסטרליים, כגון הפקעת הריח.בשלב הבא, חזור על פעולה זו עבור הרקמה הממוקמת באופן סימטרי לסטריאטום. לאחר מכן, מקם את הפרוסה הנותרת כדי להשיג מבט קורונלי של הסטריאטום. ניתן לזהות את הסטריאטום כחלק שקוף מעט יותר של הרקמה.לאחר מכן בודדו את הסטריאטום (striatum), ואז חתכו אותו לשבבים באמצעות סכין למיקרודיסקציה. הימנעו מהרקמה הכהה יותר שנמצאת סמוך לקו האמצע, המכילה נוירונים נודדים של ה-lateral and medial ganglion eminence. הוסיפו טיפה של קולגן שהוכן למסך כיסוי (cover slip) בתוך באר של צלחת בעלת ארבע בארות.השאירו את הדגימה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות. הקולגן יעבור ג'לטיניזציה במהלך דגירה זו. לאחר שהקולגן הפך לג'ל, השתמשו בפיפטה עם טיפ של 200 µL כדי להעביר את השתילים הדופמינרגיים או את שתיל ה-sal אל תוך הקולגן.לאחר מכן, העבירו את האקספלנטים למצב של קרבה הדדית באמצעות מחט. שמרו על מרחק ביניהם של בערך קוטר של אקספלנט אחד. לאחר מכן, הסירו את עודפי המצע.הוסיפו 20 µL מהקולגן שהוכן מעל ה-explant. פעולה זו תגרום לעיתים קרובות לתזוזה של ה-explants. החזירו את ה-explants למקומם באמצעות מחט.הניחו לקולגן להתמצק בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, העבירו אותו לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 30 דקות. לאחר שהקולגן התייצב, הוסיפו 400 µL של מצע גידול (explan medium) והניחו לו לגדול במשך יומיים עד שלושה ימים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C.כדי לקבע את הרקמות בעדינות, הוסיפו 4% paraformaldehyde והשאירו אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר שעה, שטפו אותן ב-PBS בטמפרטורת החדר שלוש פעמים, בכל פעם למשך 15 דקות.לאחר הסרת ה-PBS, הדגרי אותם בבופר חסימה למשך שעתיים. לאחר מכן, הדגרי אותם למשך לילה עם נוגדן ראשוני ובופר חסימה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. למחרת, שטפי אותם ב-PBS חמש פעמים בטמפרטורת החדר, בכל פעם למשך שעה אחת. לאחר מכן, הדגרי אותם עם נוגדן משני המצומד לפלואורסצנט המתאים.ארבע שעות בבuffer חסימה למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס. מהשלב הזה ואילך, כסו את האקספלנטים בנייר אלומיניום כדי למזער את חשיפתם לאור. שטפו אותם למשך הלילה ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס, ולאחר מכן בצעו מספר שטיפות למחרת.בשלב הבא, העבירו את האקספלנטים למסגרת על גבי פלטת מיקרוסקופ באמצעות מדיום קיבוע עם רכיב אנטי-פייד (anti fade), כאשר צד האקספלנט פונה כלפי מטה. הניחו בעדינות רבה זכוכית כיסוי על מדיום הקיבוע כדי למנוע כליאת בועות אוויר תחתיה. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) כדי להשיג תמונות דיגיטליות של x האקספלנטים.בעזרת תמונות אלו, חלקו כל שתיל X לרבעים כדי ליצור רבע פרוקסימלי ורבע דיסטלי. לאחר מכן, מדדו את אורכן של 20 הנויריטים הארוכים ביותר הבולטים מהשתיל X, הן ברבע הפרוקסימלי והן ברבע הדיסטלי. השתמשו באורך הממוצע של 20 הנויריטים הארוכים ביותר כדי לחשב את היחס הפרוקסימלי-דיסטלי עבור כל שתיל בנפרד.יחס פרוקסימלי-דיסטלי הגדול מאחד מעיד על משיכה של אקסונים. בעוד שיחס הקטן מאחד מעיד על דחייה של אקסונים. מוצג כאן נתח של גב המוח הצפוף (midbrain explan) שנצבע בנוגדן anti tyrosine hydroxylase, החושף צמיחה של אקסונים.הקו המקווקו מצביע על השתילים הסמוכים. החצים מצביעים על נוריטים בודדים ואפלי פיתוח (growth cones). זהו דוגמה לכימות של יחס פרוקסימלי-דיסטלי.הם מחולקים לרבעים שווים. הרבע הפרוקסימלי פונה לרקמות ה-X הסמוכות, בעוד הרבע הדיסטלי פונה הרחק מהן. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע תרבית משותפת של רקמות דופמינרגיות וסטריאטליות כדי לחקור את התפתחות המסלול המזומרגרו-סטריאטלי, וללמוד את המנגנונים המולקולריים המעורבים ביצירת מסלולים אלו.

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Assay זה מעריך את היכולת של מולקולות איתות, עצם פה חלבון המוךפו"גנטי שהולך 7 (BMP7), לארגון מחדש של אקסונים commissural. Explant של חוט השדרה הגבי העובריים בתרבית הסמוכים המצרפי של הפרשת התאים COS הצמיחה גורמים מועמד. אקסונים commissural ההתמצאות גדל בתוך explant הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה.

Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה

אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות חומוס הגנגליון E4 statoacoustic ו E6 explants חוט השדרה. Explants הם תרבותי תחת בסרום ללא תנאים ג'ל קולגן 3D עבור 24 שעות. ההיענות Neurite נבדק עם המדיום גורם הגדילה, שיושלם עם חלבון מצופים חרוזים.

Dissection והתרבות של גנגליון צ&#39;יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג&#39;ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

סרטון זה מתאר שיטה לטיפוח נוירונים דופמינרגיים מרקמת מוח עוברית של עכבר. התהליך כולל טיפול במוח התיכון באמצעות אנזים מפרקי חלבון, ניתוק התאים וגידולם על גבי כיסויים מצופים פולימר בתווך עשיר בחומרים מזינים עם אנטיביוטיקה לצורך גדילתם ויכולת הקיום שלהם לטווח ארוך.

גידול ותחזוקה של תאי עצב דופמינרגיים מרקמת מוח עוברית של עכבר

הסרטון מדגים את תהליך הבידוד והטיפוח של נוירוני דופמין מהמוח התיכון של עוברי עכברים. רצפות המוח התיכון הגחוני המבודד מנותקות באמצעות אנזימים. נוירוני הדופמין המתקבלים נקצרים ומועברים למיקרו-איים בתוך צלחות מרובות בארות. התאים מודגרים בתווך נוירון דופמין כדי לשמור על התאים בצפיפות גבוהה בתוך המיקרו-איים.

בידוד ותרבית של נוירוני דופמין עובריים ראשוניים במוח התיכון

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

נוירונים דופמינרגיים ממלאים תפקיד ויסות חיוני במוח. אובדן שלהם קשור למחלת פרקינסון. בסרטון זה, אנו מראים כיצד ליצור תרביות ראשוניות של נוירונים דופמינרגיים מרכזיים ממזנספלון של עכברים עובריים. תרבויות כאלה שימושיות לחקר הפגיעות הקיצונית של נוירונים אלה ללחצים שונים.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

תובנה לגבי הפעולות המורכבות של המוח דורשת כלי מחקר מתקדמים. כאן אנו מדגימים מודל תלת מימדי חדש מבוסס משי-קולגן של רקמה עצבית הדומה לארכיטקטורה דמוית מוח. המודל יכול לשמש לחקר הרכבת רשת עצבית, הנחיה אקסונלית, אינטראקציות תא-תא ופעילות חשמלית.

דגם של רקמות עצביות מקוטב מבוסס משי-קולגן מהונדס 3D

במחלת פרקינסון (PD), חומר שחור (SNC) נוירונים דופאמינרגיים להתנוון, שמובילים מוטורי. כאן אנו מדווחים פרוטוקול נוירונים culturing מוח תיכון גחון של עכבר להביע eGFP מונע על ידי hydroxylase טירוזין (TH) רצף אמרגן, קצירת נוירונים ניאון פרט מן התרבויות, ומדידת transcriptome שלהם באמצעות-seq RNA.

זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

בדו ח זה, היתרונות של תרבויות organotypic ותרבויות הפומבית העיקרי של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים מודגשים לחקור מגוון רחב של מנגנונים הקשורים אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, בתגובה זיהום ויראלי.

Explant של עכבר למבוגרים DRG הפומבית תא מודלים לחקור והנוירולוגיה הפלסטית ואת התגובות עלבונות סביבתי כולל זיהום ויראלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

כאן, אנו מספקים שיטה לניתוח התנהגות של האקטונים הגדלים בתוך מטריצות תלת-ממד, מחקה את התפתחותם הטבעית.

דור של 3-D הידרוג'לים קולגן מבוססי לנתח צמיחה Axonal התנהגות במהלך פיתוח מערכת העצבים

למדו שיטת תרבית אקספלנטים דופמינרגיים וסטריאטליים בעכברים בתלת ממד במטריצת קולגן. טכניקה זו מאפשרת חקר התפתחות מסלולי עצבים מזוסטריאטליים וסטריאטוניגרליים וניתוח תגובות אקסונים.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

גלה סרטונים נוספים