דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

המטרה הכללית של הליך זה היא לתרבת דופמינרגיים וסטריאטום AAL Explan כדי לחקור את התפתחות מסלולי Meso Sal ו-Sal Nigro. מטרה זו מושגת תחילה על ידי מיקרו-דיסקציה של הסטריאטום והמידבריין הדופמינרגי מעוברים של עכבר בשלב E 14.5. השלב השני הוא חיתוך של explan בגודל מתאים מהרקמה שבוצעה לה דיסקציה.

בשלב הבא, מניחים את ה-explan בתוך ג'ל קולגן בקרבה רבה זה לזה. השלב האחרון הוא תרבית של explan אלו לאורך תקופה של יומיים עד שלושה ימים כדי לאפשר צמיחת אקסונים. לבסוף, נעזרים באימונוהיסטוכימיה לסמנים נוירונליים ספציפיים כדי להראות ולכמת תגובות אקסוניות של משיכה או דחייה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרביות של תאים מופרדים או שני שתלי DX, הוא שמטריצת הקולגן מספקת תשתית תלת-ממדית לאקסונים המדמה את הסביבה החוץ-תאית. בנוסף, מטריצת הקולגן מאפשרת יצירה של מדרגי ריכוזים יציבים יחסית של חלבונים המופרשים על ידי שתלי X או תאים הממוקמים בסביבתם. את הפרוצדורה ידגימו Ava Smith ו-Francesca, שתיים מסטודנטיות הדוקטורט במעבדתי.

כדי להתחיל בפרוצדורה זו, יש להוציא את עוברי העכבר בשלב E 14.5 מרחמה של האם. יש לשמור אותם במדיום L 15 על קרח עד למועד השימוש. לאחר מכן, העבירו עובר אל המיקרוסקופ ובודדו את המוח מהעובר.

לאחר מכן, הסירו את ה-cephalon על ידי חיתוך לאורך החלק המדיאלי של כל שלפוחית ראשית (cephalic vesicle). לאחר מכן, הסירו את המעטפת הקרומית (meningeal sheath). בצעו חיתוך גבי-בטני (dorso ventral) ממש בצד הרוסטרלי של ה-meas cephalic flex.

לאחר מכן, בצעו חיתוך גבי-בטני (dorsal ventral) נוסף ממש לפני הכיפוף הצווארי (cephalic flexor). לאחר מכן, בצעו חיתוך רוחבי (rostral caudal) לאורך קו האמצע הגבי באמצעות סכין למיקרו-דיסקציה כדי לחשוף את רקמת הגב המוחית הבטנית שמתחתיה. היזהרו לא לפגוע ברקמת הגב המוחית הבטנית, שכן היא מכילה את הנוירונים הדופמינרגיים.

לאחר מכן, בצעו שני חיתוכים רוחביים (coddle cuts) לטראליים ומקבילים לקו האמצע הוונטרלי כדי להסיר את רקמת המוח האמצעי הדורסלית. לאחר מכן, חלקו את רקמת המוח האמצעי הוונטרלית שנותרה ל-X רססי רקמה (explants) באמצעות סכין למיקרודיסקציה. שמרו את X רססי הרקמה במצע L 15 המכיל 5%FBS על קרח עד לשימוש.

כעת העבירו את השקיקים הצפליים של הטלון (talon cephalic vesicles) שהתקבלו קודם לכן במהלך נתיחת המוח האמצעי אל המיקרוסקופ. הסירו את התלמוס על ידי חיתוך בין התלמוס לבין ה-satu באמצעות פינצטה. לאחר מכן, בצעו חיתוך מדיאלי-לטראלי רוסטרלית לסטריאטום כדי להסיר מבנים רוסטרליים, כגון הפקעת הריח.

בשלב הבא, חזור על פעולה זו עבור הרקמה הממוקמת באופן סימטרי לסטריאטום. לאחר מכן, מקם את הפרוסה הנותרת כדי להשיג מבט קורונלי של הסטריאטום. ניתן לזהות את הסטריאטום כחלק שקוף מעט יותר של הרקמה.

לאחר מכן בודדו את הסטריאטום (striatum), ואז חתכו אותו לשבבים באמצעות סכין למיקרודיסקציה. הימנעו מהרקמה הכהה יותר שנמצאת סמוך לקו האמצע, המכילה נוירונים נודדים של ה-lateral and medial ganglion eminence. הוסיפו טיפה של קולגן שהוכן למסך כיסוי (cover slip) בתוך באר של צלחת בעלת ארבע בארות.

השאירו את הדגימה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות. הקולגן יעבור ג'לטיניזציה במהלך דגירה זו. לאחר שהקולגן הפך לג'ל, השתמשו בפיפטה עם טיפ של 200 µL כדי להעביר את השתילים הדופמינרגיים או את שתיל ה-sal אל תוך הקולגן.

לאחר מכן, העבירו את האקספלנטים למצב של קרבה הדדית באמצעות מחט. שמרו על מרחק ביניהם של בערך קוטר של אקספלנט אחד. לאחר מכן, הסירו את עודפי המצע.

הוסיפו 20 µL מהקולגן שהוכן מעל ה-explant. פעולה זו תגרום לעיתים קרובות לתזוזה של ה-explants. החזירו את ה-explants למקומם באמצעות מחט.

הניחו לקולגן להתמצק בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, העבירו אותו לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 30 דקות. לאחר שהקולגן התייצב, הוסיפו 400 µL של מצע גידול (explan medium) והניחו לו לגדול במשך יומיים עד שלושה ימים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C.

כדי לקבע את הרקמות בעדינות, הוסיפו 4% paraformaldehyde והשאירו אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר שעה, שטפו אותן ב-PBS בטמפרטורת החדר שלוש פעמים, בכל פעם למשך 15 דקות.

לאחר הסרת ה-PBS, הדגרי אותם בבופר חסימה למשך שעתיים. לאחר מכן, הדגרי אותם למשך לילה עם נוגדן ראשוני ובופר חסימה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. למחרת, שטפי אותם ב-PBS חמש פעמים בטמפרטורת החדר, בכל פעם למשך שעה אחת. לאחר מכן, הדגרי אותם עם נוגדן משני המצומד לפלואורסצנט המתאים.

ארבע שעות בבuffer חסימה למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס. מהשלב הזה ואילך, כסו את האקספלנטים בנייר אלומיניום כדי למזער את חשיפתם לאור. שטפו אותם למשך הלילה ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס, ולאחר מכן בצעו מספר שטיפות למחרת.

בשלב הבא, העבירו את האקספלנטים למסגרת על גבי פלטת מיקרוסקופ באמצעות מדיום קיבוע עם רכיב אנטי-פייד (anti fade), כאשר צד האקספלנט פונה כלפי מטה. הניחו בעדינות רבה זכוכית כיסוי על מדיום הקיבוע כדי למנוע כליאת בועות אוויר תחתיה. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) כדי להשיג תמונות דיגיטליות של x האקספלנטים.

בעזרת תמונות אלו, חלקו כל שתיל X לרבעים כדי ליצור רבע פרוקסימלי ורבע דיסטלי. לאחר מכן, מדדו את אורכן של 20 הנויריטים הארוכים ביותר הבולטים מהשתיל X, הן ברבע הפרוקסימלי והן ברבע הדיסטלי. השתמשו באורך הממוצע של 20 הנויריטים הארוכים ביותר כדי לחשב את היחס הפרוקסימלי-דיסטלי עבור כל שתיל בנפרד.

יחס פרוקסימלי-דיסטלי הגדול מאחד מעיד על משיכה של אקסונים. בעוד שיחס הקטן מאחד מעיד על דחייה של אקסונים. מוצג כאן נתח של גב המוח הצפוף (midbrain explan) שנצבע בנוגדן anti tyrosine hydroxylase, החושף צמיחה של אקסונים.

הקו המקווקו מצביע על השתילים הסמוכים. החצים מצביעים על נוריטים בודדים ואפלי פיתוח (growth cones). זהו דוגמה לכימות של יחס פרוקסימלי-דיסטלי.

הם מחולקים לרבעים שווים. הרבע הפרוקסימלי פונה לרקמות ה-X הסמוכות, בעוד הרבע הדיסטלי פונה הרחק מהן. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע תרבית משותפת של רקמות דופמינרגיות וסטריאטליות כדי לחקור את התפתחות המסלול המזומרגרו-סטריאטלי, וללמוד את המנגנונים המולקולריים המעורבים ביצירת מסלולים אלו.